En reprise cellule tumorale in Vitro pour l’évaluation prédictive de l’antigène chimérique fonction antitumorale des récepteurs des lymphocytes T
27 février 2019
Nous décrivons ici une méthode de culture in vitro de co aux cellules de T de tumeur ciblée de défi de manière récursive, qui permet une analyse phénotypique et fonctionnelle de l’activité antitumorale des lymphocytes T.
Ce protocole fournit une méthode fonctionnelle à long terme, in vitro, pour l’évaluation du récepteur chimérique d’antigène, ou cellules de T de CAR, par le défi répétitif de cellules de tumeur. Cette technique prend moins de temps, et moins laborieuse que l’évaluation in vivo de fonction de cellule T de CAR tout en réalisant toujours une représentation précise de l’efficacité vraie d’anti-tumeur. Cette technique in vitro permet le criblage et la différenciation à haut débit de la puissance anti-tumorale des cellules T de la RCA.
Qui a l’application potentielle pour évaluer l’efficacité clinique des produits de cellule T de CAR. Commencez par dissocier les tumeurs du glioblastome d’une culture tumorale du glioblastome. Avec un millilitre d’accutase froide, et 30 à 60 secondes de pipetage.
Quand les tumorspheres ont été perturbés, arrêtez la réaction avec cinq millilitres de milieu chaud de co-culture. Et pelleter les suspensions des cellules tumorales par centrifugation. Suspendre à nouveau les cellules du glioblastome à 1,6 fois 10 à la cinquième cellule tumorale par millilitre de concentration moyenne de coculture fraîche, et diluer les lymphocytes T récoltés à partir d’une culture des lymphocytes T car au pourcentage approprié de lymphocytes T positifs en RCA par millilitre de concentration moyenne de coculture.
Ensuite, ajoutez 100 microlitres des cellules tumorales diluées à chaque puits d’une plaque de culture de tissu de fond bien plate de 96 puits. Et 100 microlitres de cellules T CAR dans chaque puits de cellules tumorales avec mélange doux. Placez ensuite la plaque dans un incubateur de dioxyde de carbone de 37 degrés Celsius et de 5 %.
Les jours deux, quatre et six de la culture, soigneusement enlever 50 microlitres de milieu de chaque puits de la cellule tumorale, T cellule plaque de co-culture prévue pour rechallenge selon le tableau. Ensuite, ajouter 50 microlitres de suspension cellulaire glioblastome frais, préparé comme il vient de le démontrer, mais avec deux fois le nombre de cellules de la co-culture initiale à chaque puits avec un mélange doux. Et rendre la plaque à l’incubateur de culture cellulaire.
Les jours un, trois, cinq et sept de la co-culture, transfèrent le surnatant de chaque puits pour être récolté dans une nouvelle plaque inférieure ronde de 96 bien selon le tableau et ajoutent 50 microlitres de 0,5% préchauffé Trypsin EDTA dans chaque milieu bien épuisé. Après cinq minutes à 37 degrés Celsius, confirmer que les cellules se sont détachées du fond de chaque puits par microscopie légère, et pipette doucement la solution enzymatique autour du fond de chaque puits pour résuspendre les cellules. Avant de transférer la suspension cellulaire détachée dans les puits correspondants appropriés de la nouvelle plaque de 96 puits.
Pelleter les cellules par centrifugation, et laver les cellules avec 200 microlitres de fluorescents activé solution debout de tri cellulaire, ou FFS par puits avec une deuxième centrifugation. Suspendre à nouveau les granulés dans 100 microlitres du cocktail d’anticorps d’intérêt pour 100 microlitres de SSS par puits pendant une incubation de 30 minutes à quatre degrés Celsius. A la fin de l’incubation enlever tout anticorps non lié par séquentiel 100 et 200 microlitres FSS lave et re-suspendre les cellules dans 100 à 200 microlitres de tache nucléaire DAPI et FSS.
Ensuite, analyser les cellules selon les protocoles standard d’analyse cytométrique de flux. Pour l’analyse fonctionnelle et phénotypique des cellules T de CAR après co-culture de cellules de tumeur, récupérez les fichiers de données du cytomètre d’écoulement, et portez toutes les cellules négatives réelles de DAPI. Pour quantifier les cellules tumorales, portez la population négative de CD45.
Pour quantifier la barrière de cellules T de la RCA, la population positive de CD45 en RCA. Puis tracer les nombres de tumeurs et de cellules T CAR au cours de l’expérience, en identifiant l’activation des lymphocytes T par la co-expression de 41BB, et CD69. Épuisement des lymphocytes T par l’expression de PD1, LAG3 et TIM3, et le statut de mémoire des lymphocytes T LAG3, et TIM3, et le statut de mémoire des cellules T par CD45RO, et cd62 ligand expression.
par CD45RO, et CD62 ligand expression. Les lymphocytes T CD4 positifs et CD8 positifs en RCA sont également activés contre les cellules du glioblastome qui expriment l’antigène cible tel qu’indiqué par leur expression CD107a et cytokine intracellulaire. Cependant, comme évalué par le défi répétitif de tumeur SA, CD4 positif, mais pas CD8 positif, cellules de T de CAR sont capables de tuer rond multiple.
Les lymphocytes T CD4 positifs en RCA réalisent également une expansion plus robuste. Lorsque les lymphocytes T CD4 positifs et CD8 positifs en RCA sont mélangés à un rapport d’un à un, cette combinaison cellulaire permet d’obtenir des lymphocytes T CD8 positifs, mais non positifs au CD4 en termes de cytotoxicité à long terme. En outre, l’expansion des lymphocytes T CD8 positifs car est induite par l’ajout de lymphocytes T CD4 positifs.
Tandis que l’expansion positive de cellule T de CAR cd4 est inhibée en présence des cellules positives de CDa. 24 heures après la co-culture initiale, les lymphocytes T CD4 positifs et CD8 positifs car sont activés de la même manière. Pendant le défi répétitif de tumeur, les cellules positives de CD4 et de CD8 positives de CAR T démontrent une transition d’un phénotype positif de mémoire centrale positif de CD45RO, de CD62 ligan, à un phénotype positif de mémoire d’effecteur de CD45RO de CD62 ligan.
Les lymphocytes T CD8 positifs en RCA sont également plus sujets à l’épuisement que les lymphocytes T CD4 positifs en RCA évalués par leur expression PD1, LAG3 et TIM3 après trois jours de co-culture. De plus, aucune différence observée dans l’épuisement positif des lymphocytes T du CDa en présence ou en l’absence de lymphocytes T cd4 positifs, ce qui indique que l’expansion positive des lymphocytes T CD8 induits par CD4 n’est pas associée à une meilleure fonction effectrice. Cet essai peut également être couplé avec le tri des cellules T forment la co-culture pour effectuer une analyse plus approfondie sur les transcriptomes, la protéomique, et des gènes spécifiques d’intérêt.
Ce défi répétitif de tumeur pourrait également être employé comme plate-forme pour étudier les événements biologiques après reconnaissance de tumeur de cellule T de CAR.
Aperçu
Cet article présente une méthode de co-culture in vitro pour l'évaluation fonctionnelle des cellules T CAR par des défis répétés avec des cellules tumorales. Cette approche permet une analyse détaillée de l'activité des cellules T contre les cellules de glioblastome.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Immunologie
- Biologie cellulaire
- Recherche sur le cancer
Contexte
- Les cellules T exprimant un récepteur antigénique chimérique (CAR) sont conçues pour cibler des antigènes tumoraux spécifiques.
- L'évaluation de l'efficacité des cellules T-CAR implique traditionnellement des modèles complexes in vivo.
- Cette étude présente une méthode plus simple in vitro pour évaluer la fonction des cellules T-CAR.
- Comprendre les réponses des cellules T est essentiel pour améliorer les immunothérapies anticancéreuses.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode à haut débit pour évaluer la puissance anti-tumorale des cellules T CAR.
- Analyser les caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles des cellules T CAR lors de la co-culture avec des cellules de glioblastome.
- Étudier les effets de défis tumoraux répétés sur l'activation et l'épuisement des cellules T.
Méthodes utilisées
- Culture mixte de cellules de glioblastome et de cellules CAR T dans un format de plaque de 96 puits.
- Challenges répétées avec un nombre croissant de cellules tumorales sur plusieurs jours.
- Analyse par cytométrie en flux pour évaluer les marqueurs d'activation et d'épuisement des cellules T.
- Quantification des populations de cellules CAR T et de cellules tumorales tout au long de l'expérience.
Résultats principaux
- Les cellules T à récepteur CAR CD4 et CD8 sont activées contre les cellules de glioblastome.
- Les cellules T à récepteur CAR CD4 présentent une expansion supérieure et effectuent plusieurs cycles de destruction.
- Les cellules T à récepteur CAR CD8 montrent une tendance plus marquée à l'épuisement par rapport aux cellules T à récepteur CAR CD4.
- La présence de cellules T à récepteur CAR CD4 améliore l'expansion des cellules T à récepteur CAR CD8.
Conclusions
- Cette méthode in vitro simule efficacement le microenvironnement tumoral pour l'évaluation des cellules T CAR.
- Des stimulations tumorales répétées permettent d'obtenir des informations sur la dynamique et l'efficacité des cellules T.
- Les résultats pourraient guider des stratégies d'optimisation des thérapies par cellules T CAR dans des contextes cliniques.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cet essai de rechallenge cellulaire in vitro des cellules tumorales comble un manque critique dans le développement des cellules T à récepteur antigénique chimérique (CAR T) en proposant une méthode prédictive et à haut débit permettant d'évaluer la fonction cytotoxique à long terme et la capacité proliférative sous des charges tumorales physiologiquement pertinentes. En simulant une exposition répétée à l'antigène sur sept jours, cet essai reflète mieux les dynamiques antitumorales in vivo que les essais standards de lyse à court terme, permettant ainsi d'identifier plus précocement les risques associés aux candidats CAR T. Cela facilite des décisions éclairées d'aller ou de ne pas aller plus loin (go/no-go) aux stades de découverte et préclinique, améliorant la priorisation du portefeuille et réduisant les risques biologiques en phase avancée.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'évaluer la persistance fonctionnelle des cellules T CAR et leur potentiel de destruction récursive lors de défis tumoraux répétés.
- Valeur scientifique : Facilite le profilage phénotypique des marqueurs d'activation, d'épuisement et de mémoire afin de réduire les risques liés aux hypothèses d'engagement de la cible.
- Valeur opérationnelle : Permet la comparaison parallèle des produits de cellules T CAR CD4+ et CD8+ pour guider le choix du meilleur construit.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des données quantitatives longitudinales sur la dynamique de co-culture entre cellules tumorales et lymphocytes T au fil du temps.
- Valeur opérationnelle : Utilise un format de plaque 96 puits compatible avec le criblage à haut débit de multiples variantes de cellules T à récepteur chimérique (CAR T).
- Valeur opérationnelle : Nécessite uniquement une infrastructure standard de cytométrie en flux, permettant une adoption large dans les laboratoires de découverte.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Ressort les observations in vivo où les cellules T CAR CD4+ montrent une expansion supérieure et une activité durable dans les modèles orthotopiques de GBM.
- Valeur scientifique : Établit un lien entre les paramètres fonctionnels in vitro et l'efficacité in vivo, soutenant une continuité translationnelle.
- Valeur opérationnelle : Permet une détection mécanistique des risques en identifiant les phénotypes sensibles à l'épuisement (par exemple, PD1, LAG3, TIM3 dans les cellules CD8+) avant des études in vivo coûteuses.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Le test s'inscrit dans la continuité découverte-préclinique, servant de pont fonctionnel entre l'identification initiale des candidats prometteurs et la validation préclinique en fournissant dès les premiers stades une prédiction fiable de la puissance et de la durabilité des cellules CAR T.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses sur la persistance des cellules CAR T et leur fonction antitumorale au-delà de l'activation initiale.
- Essais de criblage : Fournit des résultats quantitatifs reproductibles issus de co-cultures, permettant de classer les produits de cellules CAR T selon leur capacité de destruction répétée.
- Analyses : Génère des données multiparamétriques de cytométrie en flux sur les phénotypes des cellules T et l'élimination tumorale, afin d'aider à la prise de décision fondée sur les données.
- Recherche translationnelle : Montre une corrélation avec les résultats obtenus dans des modèles de xénogreffes orthotopiques, confirmant ainsi son rôle dans la continuité préclinique.
- Utilisation en entreprise : Met en place une plateforme standardisée et réutilisable pour l'évaluation continue des produits de cellules CAR T dans différents programmes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans la fonction antitumorale à long terme et réduction de l'ambiguïté mécanistique concernant l'efficacité des cellules T CAR.
- Valeur opérationnelle : Protocole standardisé et évolutif nécessitant un temps d'intervention minimal par rapport aux modèles in vivo.
- Valeur stratégique : Amélioration de l'efficacité du capital en permettant l'identification précoce de candidats à base de cellules T CAR à forte puissance.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation ajustée au risque fondée sur un potentiel prolifératif et cytotoxique validé.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture de cellules immunitaires primaires, en techniques de co-culture stériles et en cytométrie en flux.
- Dépend de l'accès à un cytomètre en flux capable d'immunophénotypage multiparamétrique (par exemple, CD45, CAR, CD69, 41BB, PD1, LAG3, TIM3, CD45RO, CD62L).
- Exige une préparation standardisée des cellules tumorales (par exemple, sphéroïdes de glioblastome) et un calendrier régulier de rechallenges toutes les 48 heures.
- L'adaptation à d'autres modèles tumoraux peut nécessiter une optimisation de l'expression de l'antigène et de la résilience des cellules tumorales face à des challenges répétés.
- La durée du test (7 jours) et les étapes de renouvellement du milieu exigent une planification rigoureuse et un contrôle strict de la contamination.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
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Title
0:54
Tumor Cell: T Cell Co-culture Setup and Tumor Cell Rechallenge
2:37
Sample Harvest for Flow Cytometric Analysis
4:12
Functional and Phenotypic Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Analysis
5:14
Results: Representative CD4+ and CD8+ CAR T Cell Phenotypes After Repetitive Challenge
7:30
Conclusion
