Name: En reprise cellule tumorale in Vitro pour l’évaluation prédictive de l’antigène chimérique fonction antitumorale des récepteurs des lymphocytes T (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Découvrez une méthode de co-culture in vitro pour évaluer la fonction antitumorale des cellules CAR-T par défis tumoraux répétés. Cette technique permet d'analyser l'activation et l'épuisement des lymphocytes T contre les cellules de glioblastome.

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Ce travail a été soutenu par les subventions accordées par le California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) grant TR3-05641 et subventions NIH CA33572 P30 (carottes). P.S. est pris en charge par NCI bourse 1F99CA234923-01.

Notre CISR ne nécessite pas de révision du présent protocole. Nous recevons des échantillons de tumeur glioblastome frais mis au rebut de la ville de Hope pathologie département qui sont codées, et notre laboratoire ne peut pas accéder à la clé. Nous recevons les spécimens avec des données que sur l’état de maladie et de traitement préalable au moment de la biopsie/résection, avec aucune donnée d’identification.
1. préparation de support
<ol><li>Préparer les cellules souches neurales milieux pour culture de lignées de cellules primaires GBM : DMEM:F12, 01:50 B27, 5 µg/mL héparine et 2 mmol/L, L-glutamine ; additionné de 20 facteur de croissance épidermique (EGF) ng/mL et 20 ng/mL facteur de croissance basique des fibroblastes (FGF) deux fois par semaine (voir Table des matières).</li>
	<li>Préparer les médias de lymphocytes T : 15 X-VIVO contenant 10 % de sérum de veau foetal (FCS) ; additionné de 70 UI/mL rhIL-2 et 0,5 ng/mL rhIL-15 chaque 48 h (voir Table des matières).</li>
	<li>Préparation des milieux de culture co : prendre des cellules souches neurales médias sans supplément EGF et FGF et ajoutez 10 % FCS.</li>
	<li>Préparer des FACS (FSS) de solution de coloration : HBSS, 2 % FCS, NaN3 (0,5 g/500 mL).</li>
</ol>2. préparation des cellules tumorales GBM
<ol><li>Récolter les sphères de tumeur basse-passage GBM (TSs) par centrifugation à 300 x g pendant 4 min et jeter le surnageant. Remarque : Tumeur GBM sphères (TSs) sont générés à partir résection de tumeurs comme décrit plus haut22,23,24et maintenue par les médias de cellules souches neurales, en couveuse avec 5 % de CO2 à 37 ° C.</li>
	<li>Réchauffez les milieux de culture co dans un bain-marie à 37 ° C.</li>
	<li>Ajouter 1 mL d’accutase froid à GBM TSs, dissocier TSs en pipettant également, pour les 30-60 s et arrêter la dissociation en ajoutant 5 mL de milieux de culture co chaud. Remarque : GBM TSs ne doivent pas être conservés sur accutase pendant plus de 5 min.</li>
	<li>Récolter les cellules GBM par centrifugation à 300 g pendant 4 min, jeter le surnageant et remettre en suspension des cellules dans 2 mL de milieu de culture co.</li>
	<li>Déterminer la concentration de cellules à l’aide d’un compteur de viabilité de cellules. Remarque : Viabilité cellulaire doit être > 70 %.</li>
</ol>3. préparation des cellules de T de voiture
<ol><li>Moins de 24h avant le dosage, prenez 100 µL de cellules de T de voiture cultivées dans un tube de cytométrie en flux et ajouter 2 mL de FSS. Remarque : Les cellules de T de voiture ont été générés comme décrit plus haut11,21 et cultivées dans des milieux de lymphocytes T.</li>
	<li>Centrifugation à 300 g pendant 4 min, puis jeter le surnageant.</li>
	<li>Ajouter 2 mL de FSS pour laver les cellules, centrifuger à 300 x g pendant 4 min et jeter le surnageant.</li>
	<li>Colorer les cellules avec des anticorps approprié pour indiquer l’expression de la voiture à 4 ° C pendant 30 min. Remarque : Par exemple, si une voiture IL13Rα2 ciblés décrits précédemment25 est utilisé, puis colorer avec un anticorps anti-IL13.</li>
	<li>Laver deux fois avec 2 mL de FSS et analyser exn de voiture à l’aide d’un cytomètre en flux.</li>
	<li>Déterminer le % de voiture sur les cellules T à l’aide de la stratégie de blocage illustrée à la Figure 1B.</li>
	<li>Lors de la journée de co-culture, récolter toutes les cellules de T de voiture par centrifugation à 300 g pendant 4 min, jeter le surnageant et remettre en suspension des cellules dans 2 mL de milieu de culture co.</li>
	<li>Déterminer la concentration de cellules à l’aide d’un compteur de viabilité de cellules. Remarque : Viabilité cellulaire doit être > 70 %.</li>
</ol>4. configurer la tumeur — co-culture de lymphocytes T
<ol><li>Diluer les cellules tumorales à une concentration de 0,16 millions/mL avec les milieux de culture co.</li>
	<li>Basé sur voiture %, diluer les cellules à une concentration de cellules en voiture+ 0,04 millions/mL avec les milieux de culture co voiture T. Remarque : Par exemple, si la voiture est de 50 % et la concentration cellulaire T est de 0,4 millions/mL, puis réaliser une dilution au 1:5 pour obtenir la concentration finale de 0,04 millions voiture+ cellules/mL.</li>
	<li>Pipetter 100 µL de cellules tumorales dilué dans chaque puits d’une plaque 96 puits à fond plat culture de tissus.</li>
	<li>Pipetter 100 µL de cellules de T de voiture dilués dans chaque cupule contenant mix et les cellules tumorales bien. Remarque : Chaque co-culture de cellules de tumeur-T est analysé à 4 points dans le temps. 4-6 répétitions pourraient se révéler nécessaires à chaque fois point basé sur une analyse différente, mais < 3 répétitions par point dans le temps n’est pas recommandée ; voir le tableau 1 pour une platemap représentatif.</li>
	<li>Maintenir la plaque en a 37 ° C, 5 % CO2 incubateur.</li>
</ol>5. tumeur cellulaire reprise du traitement
Remarque : Reprise du traitement se déroule à 2, 4 et 6 jours après l’installation initiale de co-culture (Figure 1A).
<ol><li>Récolter et se dissocient GBM TSs tel que décrit ci-dessus (étapes 2,1 à 2,6).</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules GBM à une concentration de 0,64 millions/mL.</li>
	<li>Déterminer les puits de co-culture nécessitant une reprise du traitement (voir tableau 1) et retirez délicatement le dessus de chaque puits 50 médias µL.</li>
	<li>Ajouter 50 µL de la suspension cellulaire GBM dans chaque puits et bien mélanger, puis remettre la plaque en a 37 ° C, 5 % CO2 incubateur.</li>
</ol>6. récolter des échantillons et l’analyse par cytométrie en flux d’écoulement
Remarque : Les échantillons seront récoltées au poste de jours 1, 3, 5 et 7, que la configuration initiale de co-culture, avec 1, 2, 3 et 4 tours du challenge de la tumeur, respectivement.
<ol><li>Solution de trypsine-EDTA 0,05 % préchauffez au bain-marie à 37 ° C.</li>
	<li>Déterminer les puits qui ont besoin de récolte et de transférer les médias dans une nouvelle plaque de 96 puits fond rond.</li>
	<li>Pipetter 50 µL de trypsine-EDTA dans les puits pour digérer les cellules tumorales restantes à 37 ° C pendant 5 min.</li>
	<li>Sous un microscope, confirmer que les cellules ont détaché du fond.</li>
	<li>Pipetter autour du fond bien remettre en suspension les cellules individuelles, puis transférer la trypsine-EDTA contenant des cellules individuelles aux puits de la plaque à 96 puits fond rond correspondants.</li>
	<li>Centrifuger la plaque à 96 puits fond rond à 300 x g, 4 ° C pendant 4 min, puis jeter liquide surnageant.</li>
	<li>Ajouter 200 µL/puits de la FSS pour laver les cellules, la centrifuger à 300 x g, la 4 ° C pendant 4 min, puis jeter le surnageant.</li>
	<li>Remettre les cellules en 100 µL/puits FSS contenant des anticorps (voir Table des matières), et tache les cellules à 4 ° C pendant 30 min.</li>
	<li>Ajouter 100 µL/puits SFS aux cellules, centrifuger à 300 g, 4 ° C pendant 4 min, puis jeter surnageant.</li>
	<li>Ajouter 200 µL/puits de la FSS pour laver les cellules, la centrifuger à 300 x g, la 4 ° C pendant 4 min, puis jeter le surnageant.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules avec 100-200 µL/puits de FSS avec 500 ng/mL DAPI, puis analyser les échantillons par cytométrie en flux.</li>
</ol>7. fonctionnelle et Phen Otypic analyse des cellules de T de voiture
<ol><li>Récupérer les fichiers de données du cytomètre en flux et porte tous (DAPI-) des cellules vivantes (Figure 1C).</li>
	<li>Quantifier les cellules tumorales par blocage du CD45– population et cellules de T de voiture par blocage du CD45+, voiture + population (Figure 1C). Remarque : Si les cellules tumorales expriment CD45 (par exemple les cellules de lymphome Raji), anti-CD3 coloration peut être utilisée pour différencier les cellules T de cellules tumorales.</li>
	<li>Tracer la cellule tumorale et le nombre de cellules de T de voiture au cours du temps.</li>
	<li>Identifier l’activation des cellules T par la co-expression de 4-1BB et CD69. Remarque : Ces marqueurs de surface peuvent être utilisés pour analyser des lymphocytes T d’activation 6 à 24 heures post initial co-culture.</li>
	<li>Identifier épuisement de lymphocytes T par l’expression de PD-1, 3-LAG et TIM-3.</li>
	<li>Identifier les cellules T état de la mémoire par l’expression de CD45RO et CD62L.</li>
</ol>

<ol><li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).</li>
<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), (2013).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+expressing+CD19+chimeric+antigen+receptors+for+acute+lymphoblastic+leukaemia+in+children+and+young+adults%3A+a+phase+1+dose-escalation+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial.</a> The Lancet. 385 (9967), 517-528 (2015).</li>
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<li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li>
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<li>Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+T+cells%3A+the+promise+and+challenges+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 566-581 (2016).</li>
<li>Esensten, J. H., Bluestone, J. A., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Therapeutic+T+Cells%3A+From+Synthetic+Biology+to+Clinical+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Engineering Therapeutic T Cells: From Synthetic Biology to Clinical Trials.</a> Annual Review of Pathology. 12, 305-330 (2017).</li>
<li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li>
<li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+IL13Ralpha2-Targeted+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+for+Improved+Anti-tumor+Efficacy+against+Glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimization of IL13Ralpha2-Targeted Chimeric Antigen Receptor T Cells for Improved Anti-tumor Efficacy against Glioblastoma.</a> Molecular Therapy. , (2017).</li>
<li>Long, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-1BB+costimulation+ameliorates+T+cell+exhaustion+induced+by+tonic+signaling+of+chimeric+antigen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors.</a> Nature Medicine. 21 (6), 581-590 (2015).</li>
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<li>Priceman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-stimulatory+signaling+determines+tumor+antigen+sensitivity+and+persistence+of+CAR+T+cells+targeting+PSCA%2B+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Co-stimulatory signaling determines tumor antigen sensitivity and persistence of CAR T cells targeting PSCA+ metastatic prostate cancer.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1380764(2018).</li>
<li>Eyquem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+CAR+to+the+TRAC+locus+with+CRISPR%2FCas9+enhances+tumour+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection.</a> Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+full+effector+function+in+vitro+paradoxically+impairs+the+in+vivo+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).</li>
<li>Malandro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+Abundance+of+Tumor-Specific+CD4%28%2B%29+T+Cells+Potentiates+Efficacy+and+Alters+Susceptibility+to+Exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Clonal Abundance of Tumor-Specific CD4(+) T Cells Potentiates Efficacy and Alters Susceptibility to Exhaustion.</a> Immunity. 44 (1), 179-193 (2016).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+arrests+effector+T+cell+differentiation+and+generates+CD8%2B+memory+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells.</a> Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).</li>
<li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+memory+self%2Ftumor-reactive+CD8%2B+T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li>
<li>Gattinoni, L., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paths+to+stemness%3A+building+the+ultimate+antitumour+T+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paths to stemness: building the ultimate antitumour T cell.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (10), 671-684 (2012).</li>
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<li>Fraietta, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+TET2+promotes+the+therapeutic+efficacy+of+CD19-targeted+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of TET2 promotes the therapeutic efficacy of CD19-targeted T cells.</a> Nature. 558 (7709), 307-312 (2018).</li>
</ol>

La construction de la voiture décrite dans cet ouvrage ont été licenciés par Mustang Bio., Inc., dont S.J.F. et C.E.B. recevoir des redevances. Tous les autres auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt potentiel.

Cette analyse de défi de cellules de tumeur répétitives propose une démarche pratique pour évaluer la puissance de la fonctionnelle de cellule T de voiture, en utilisant une configuration in vitro qui récapitule la charge tumorale élevée associée à des modèles de tumeurs in vivo. Au cours de cet essai de 7 jours, les cellules de T de voiture subissent quatre séries de défi de la tumeur (co-culture initiale et reprise de x 3), créer un environnement où épuisé les lymphocytes T peuvent perdre leur capacité à répondre au défi de tumeur malgré une puissante réponse initiale. Élimination des cellules tumorales et l’expansion des cellules T de voiture représentent deux lectures fondamentales qui peuvent être acquises de cet essai, tandis que les phénotypes des cellules T de voiture peuvent être facilement analysés par coloration de surfaces ou intracellulaires des marqueurs qui indiquent l’activation des cellules T, épuisement et/ou mémoire. Ce dosage est également pratique pour combiner avec analyse impartiale de voiture T cellules transcriptome, protéome ou phosphore-proteome21,26et polyfonctionnalité de cellules T qui a été adoptée afin de prédire les réponses cliniques27. En outre, les cellules tumorales peuvent également être testés pour leur réponse adaptative contre l’immunité cellulaire T tels que la sécrétion de cytokine28. Puisque les échantillons sont récoltés à plusieurs moments, ce dosage permet non seulement statique, mais aussi une analyse dynamique du comportement de cellules T de la voiture lorsqu’elle répond au trop grand nombre de cellules tumorales.
L’essai est particulièrement puissant en comparant la puissance d’effecteur des cellules de T de voiture ciblant le même antigène, mais avec différentes conceptions et/ou les procédés de fabrication. Nous avons utilisé ce test pour identifier que CD4+ T voiture cellules étaient capables de médiation supérieure à long terme fonction effectrice que CD8+ cellules21. On a aussi montré que cette efficacité in vivo de la voiture est en corrélation avec la cytotoxicité aux périodes ultérieures (D5-D7) au cours de ce test, plus loin en soulignant la nécessité d’utiliser le défi de tumeur répétitives pour évaluation in vitro de cellules T de la voiture. Bien que les cellules GBM étaient utilisées comme l’exemple des cellules cibles ici, cet essai pourrait être adopté facilement à une combinaison de différentes cellules T-tumeur. Notamment, comportement de cellules T de la voiture peut également varier à densités différentes de l’antigène et ingénierie des cellules cancéreuses pour exprimer différents niveaux d’antigènes ciblés fournis l’outil pour étudier les événements moléculaires séquentiels sur voiture reconnaissance29. Par conséquent, cette analyse peut également être exploitée afin d’examiner le modèle d’activation de certaines cellules T voiture contre différentes cibles.
Puisque la viabilité cellulaire cible et l’expansion des cellules T de la voiture sont deux afficheurs initiaux de ce test, il est essentiel que toutes les cultures co commencent par viables (> 70 %) tumeur et les cellules T. Lorsque vous effectuez les processus de reprise du traitement, l’action des médias aspirante (étape 5.3) ne devrait pas modifier tumeur et les cellules de T dans le fond des puits, afin de ne pas introduire des variations inutiles des comtes de cellules. Lorsque vous effectuez ce test sur des lignées cellulaires de suspension cible, il est recommandé de récolter les cellules restantes par centrifugation avant la réexposition de cellules tumorales.
Une des limitations de ce test est que les paramètres d’installation (E:T ratios de co-culture initiale et reprise du traitement) doit être ajustée selon différentes combinaisons de voiture-tumeur. Par exemple, si les cellules tumorales expriment un degré considérable de molécules immuno-inhibitrices (PD-L1, par exemple), un ratio plus élevé de E:T est recommandé étant donné que l’ensemble tuant efficacité est altérée par rapport aux cellules tumorales PD-L1 faible. Avant d’appliquer le test de nouvelles combinaisons de voiture-tumeur, une étude pilote est recommandée afin de déterminer les conditions optimales, ce qui permet habituellement la plus puissante voiture NKT analysés avec le test d’éliminer > 80 % des cellules tumorales à la fin. Contact cellule-cellule directe est nécessaire pour voiture médiée par les lymphocytes T tuer, si les cellules tumorales ont été marqués par fluorescence, puis le panneau de cytométrie doit être ajusté en conséquence (par exemple si les cellules tumorales ont été marqués au GFP, puis tout FITC conjugué anticorps ne doivent pas être utilisés).
L’activité clinique des cellules de T de voiture contre les tumeurs malignes de cellules B a conduit à deux médicaments approuvés par la FDA. Cependant, la réponse a montré une variation substantielle à travers différents patients27,30,31, qui a été élucidée en corrélation avec les propriétés phénotypiques de la voiture produits30. Cet essai de défi de tumeur répétitives in vitro plus fournit une approche qui testent la puissance d’effecteur de voiture en plus de la caractérisation phénotypique et la production de cytokines polyfonctionnalité et permet un débit plus élevé projection du produits cliniques en comparaison de modèles in vivo de tumeur tout en conservant la fidélité prédictive. Dans l’ensemble, cet essai pourrait être utilisé pour le test fonctionnel des lymphocytes T pour la conception de voiture T cell, développement préclinique et clinique.

L’immunothérapie utilisant des récepteurs de l’antigène chimérique (voiture)-ingénierie des cellules T a vu des résultats prometteurs contre les lymphocytes B malignes1,2,3,4, alors que le potentiel de ciblage des autres tumeurs continue d’être sous enquête rigoureuse5,6,7. Grands progrès ont été réalisés afin d’optimiser la construction voiture, procédé de fabrication et patient pré-infusion schémas6,7,8, et approches de la biologie synthétique roman devraient augmenter leurs persistance, de sécurité et de tumeur spécificité9,10. Cependant, il a été difficile et fastidieux d’évaluer correctement le potentiel thérapeutique des cellules T de la voiture afin de guider le choix le plus approprié pour la traduction clinique. Le modèle plus établi jusqu'à présent pour évaluer la fonction des cellules T de la voiture est en souris immunodéficientes portant de xénogreffes tumorales humaines, auquel cas voiture NKT est examinées pour l’efficacité antitumorale et comparativement à cellule titré doses11,12 , 13 , 14 , 15. ces études murins in vivo sont fastidieuses et chronophages, surtout lorsqu’un grand nombre de paramètres de dépistage. En outre, in vivo études peuvent être freinées par l’accessibilité des souches de souris, les installations de soins aux animaux et les techniques de gestion d’animaux. Par conséquent, il y a un besoin de développer des essais in vitro plus pratiques permettant des lectures rapides d’activite d’effecteur, qui reflètent aussi fidèlement la fonction antitumorale in vivo de ces lymphocytes T.
Les méthodes conventionnelles pour déterminer la cytotoxicité des cellules T in vitro ont mis l’accent sur la détection de dégranulation, la production de cytokines et la capacité à lyser les cellules cible marquée radio-isotope (p. ex., tests de libération de Chrome). Alors que ces tests ont un caractère informatifs permettant de définir la spécificité cellulaire T de voiture et la reconnaissance de la cible redirigée, ils échouent souvent à réfléchir in vivo potentiel antitumoral d’ingénierie T cellules12,13,16. Dans certains cas, en vitro tuant l’activité dans les essais à court terme ont montré une corrélation inverse avec la fonction antitumoral in vivo16. Cette incompatibilité est vraisemblablement le résultat des ratios élevés effecteur : cible (E:T) utilisés dans ces essais in vitro et donc l’impossibilité pour différencier les produits de cellules de T de voiture qui sont sujettes à épuisement17. En revanche, au cours de l’éradication des tumeurs in vivo T cellules répondent habituellement contre des charges de grande tumeur, ce qui nécessite donc plusieurs tours de tuer au volant par la suite des lymphocytes T la différenciation et l’épuisement18,19, 20, qui est l’un des principaux obstacles contre la clairance apparente de tumeur par voiture T cellules12,13. Pendant ce temps, à plus court terme meurtre in vitro tests font également pas des différences de lecture dans la prolifération des cellules T, tandis que chez les cellules traitées voiture T la capacité pour l’expansion des cellules T de voiture est fortement corrélée avec les réponses cliniques4. Ainsi, l’essai in vitro approprié devrait récapituler les conditions de charge tumorale élevée, induction d’épuisement de lymphocytes T et permet la lecture de l’expansion des cellules T.
Nous décrivons ici une stratégie afin d’évaluer les cellules de T de voiture pour tumeur répétitive tuant potentiel, avec un test simple de co-culture in vitro. Paramètres d’activité différents lymphocytes T Effecteurs peuvent être examinés en même temps, y compris la mort cellulaire cible, expansion des cellules T de la voiture et les phénotypes associés à la mémoire ou l’épuisement. Les résultats générés par cet essai bien corrèlent avec l’effet antitumoral in vivo des cellules T de la voiture et peuvent être exploitées pour évaluer la puissance des produits cellulaires T de voiture. Alors que nous décrivons un test afin d’évaluer les cellules de T de voiture IL13Ra2 ciblées contre primaire GBM lignes21, il peut être facilement adapté à n’importe quelle plateforme de cellules de T de voiture.

<table><tbody><tr><td>0,05 % de trypsine/0,53 mM d’EDTA dans HBSS sans calcium ni magnésium</td><td>Corning</td><td>MT25051CI</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>Irvine Scientific</td><td>9319</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamine</td><td>Cambrex Bio Science</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate (DAPI) - FluoroPure grade</td><td>Invitrogen</td><td>D21490</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Aldesleukin Proleukin (rhIL-2)</td><td>Novartis Oncology</td><td>NDC 0078-0495-61</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD137, PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555956</td><td>4B4-1</td></tr><tr><td>Anti-CD19, PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557835</td><td>SJ25C1</td></tr><tr><td>Anti-CD3, PERCP</td><td>BD Biosciences</td><td>340663</td><td>SK7</td></tr><tr><td>Anti-CD4, FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>340133</td><td>SK3</td></tr><tr><td>Anti-CD45, PERCP</td><td>BD Biosciences</td><td>340665</td><td>2D1</td></tr><tr><td>Anti-CD45RO, PE</td><td>BD Biosciences</td><td>561137</td><td>UCHL1</td></tr><tr><td>Anti-CD62L, APC</td><td>BD Biosciences</td><td>559772</td><td>DREG-56</td></tr><tr><td>Anti-CD69, APC</td><td>BD Biosciences</td><td>340560</td><td>L78</td></tr><tr><td>Anti-CD8, APC-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>348793</td><td>SK1</td></tr><tr><td>Anti-IL-13, PE</td><td>BD Biosciences</td><td>340508</td><td>JES10-5A2</td></tr><tr><td>Anti-LAG-3, PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-2239-41</td><td>3DS223H</td></tr><tr><td>Anti--1, APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>329921</td><td>EH12.2H7</td></tr><tr><td>Anti-TIM-3, APC</td><td>eBiosciences</td><td>17-3109-42</td><td>F38-2E2</td></tr><tr><td>B-27 Supplément sans sérum (50x)</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 Microplaques en polystyrène à fond plat transparent traité TC, emballées individuellement, avec couvercle, stériles (Produit #3596)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin défini, HI IR</td><td>Hyclone Labs</td><td>SH30070.03IH</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F-12 50:50 (1x) sans Glutamine</td><td>MediaTech, Inc.</td><td>15-090-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Gluc sans L-Glu, Na Pyr 1 L</td><td>Invitrogen</td><td>11960051</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-Ham’s F12 50:50 Mélange avec L-glutamine et 15 mM HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10092CV</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Irvine Scientific</td><td>9224</td><td></td></tr><tr><td>Inactivé thermiquement FCS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Héparine sodique(1 000 U/mL)</td><td>Américain Pharmaceutique</td><td>401811B</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant</td><td>Milteni Biotech Inc.</td><td>BIS013220&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x W/CA & MG</td><td>Irvine Scientific</td><td>9236</td><td></td></tr><tr><td>PBS avec 1 mM d’EDTA (sans Ca2+ ou Mg2+)</td><td>Produits VWR Scientific</td><td>PB15009A</td><td></td></tr><tr><td>EGF humain recombinant</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>FGF humain recombinant</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>rhIL-15 Dilution de travail (10 ng/&micro ; L)</td><td>CellGenix, US Operations</td><td>tF0297</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST40R</td><td>Thermo Scientific</td><td>41693700</td><td></td></tr><tr><td>TC-HEPES BUFFER (1 M) SOLN 100ML&nbsp ;</td><td>IRVINE SCIENTIFIC CORP</td><td>6472</td><td></td></tr><tr><td>Masque de procédure Tecnol</td><td>Kimberly-Clark</td><td>47117</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>BW04-744Q</td><td></td></tr></tbody></table>

en reprise cellule tumorale in vitro pour l’évaluation prédictive de l’antigène chimérique fonction antitumorale des récepteurs des lymphocytes t

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

Le domaine de la thérapie de T cell receptor (voiture) antigène chimérique progresse rapidement avec des améliorations dans le design automobile, approches gène-ingénierie et fabrication des optimisations. Un défi pour ces efforts de développement, cependant, a été la mise en place d’essais in vitro pouvant étayer solidement la sélection des produits T voiture cellulaire optimales pour le succès thérapeutique in vivo. Des essais in vitro standard de tumeur-lysis échouent souvent afin de refléter le véritable potentiel antitumoral des cellules T de la voiture en raison de la durée relativement courte de co-culture et des lymphocytes T haut ratio de tumeur. Nous décrivons ici une méthode de culture in vitro de co pour évaluer voiture T cell récursive tuant potentiel avec des charges de cellule tumorale élevée. Dans ce test, la fonction cytotoxique à long terme et la capacité de prolifération des cellules T de voiture sont examinées in vitro pendant 7 jours avec cibles tumorales supplémentaire administrées à la co-culture tous les deux jours. Ce dosage peut être couplé avec l’activation des cellules T profilage, épuisement et phénotypes de la mémoire. À l’aide de ce test, nous avons distingué avec succès les différences phénotypiques et fonctionnelles entre CD4+ et CD8+ T voiture cellules contre le glioblastome (GBM), reflétant leur activité antitumorale in vivo différentielle dans orthotopique modèles de xénogreffes. Cette méthode fournit une approche facile pour évaluer la puissance de cellules de T de voiture et d’élucider les variations fonctionnelles à travers différents produits de cellules de T de voiture.

À l’aide de l’essai décrit ci-dessus, nous avons distingué la puissance différentielle effecteur et tuant dynamique par l’intermédiaire de CD4+ et CD8+ T voiture cellules. Les résultats présentés ici illustrent la différence entre CD4+ et CD8+ T voiture cellules, produits d’un donneur sain et indépendant de notre précédente publication21.
Grâce à un test de dégranulation standard, nous avons pu observer que les deux CD4+ et CD8+ T voiture cellules est devenu tout aussi activées contre des cellules GBM qui expriment l’antigène cible, comme indiqué par l’expression des CD107a et des cytokines intracellulaires (Figure 2A). Toutefois, à l’aide de l’essai de défi de tumeur répétitives, nous avons constaté que CD4+ mais pas CD8+ T voiture cellules ont la capacité de tuer rondes multiples (Figure 2B). CD4+ T voiture cellules également atteinte expansion mieux par rapport à des cellules CD8 + au cours de cet essai (Figure 2C). La différence de dilatation entre les sous-ensembles de cellules de T de voiture ont été seulement observés de D3 après deux tours de défi de tumeur (1:12 E:T), tandis que la différence de la cytotoxicité a été observée dès D5 après trois manches du challenge (1:20 E:T) de la tumeur, ce qui indique que les essais à court terme n’a pas pu élucider les différences dans l’activité des différents produits de cellules de T de voiture. Lorsque 1:1 mélangé CD4+ et CD8+ T de voiture cellules ont été appliqués à ce test, ils ont été trouvés à surperformer CD8+ mais pas de CD4 des cellules+ T de voiture sur la cytotoxicité à long terme (Figure 2B). L’expansion des CD8+ T de voiture cellules a été induite par le CD4 conjointement appliquées, tandis que CD4 des cellules+ + expansion des cellules T de voiture est inhibée en présence de CD8+ des cellules (Figure 2C).
Pour expliquer le mécanisme qui distingue l’activité effectrice entre CD4+ et CD8 cellules+ T de voiture, nous avons d’abord confirmer que 24h après initiale co-culture, deux CD4+ et CD8+ T voiture cellules étaient activés comparable (Figure 3 A). Pendant ce temps, comme en témoigne l’expression CD45RO et CD62L, deux CD4+ et CD8+ T voiture cellules montrent une transition de mémoire centrale (CD45RO+, CD62L+) à la mémoire de l’effecteur (CD45RO+, CD62L–) phénotype au cours du défi répétitives de tumeur (Figure 3B). Puis nous avons caractérisé les cellules D3 de ce test, un temps avant que les sous-ensembles de cellules de T de voiture commence à afficher une différence fonctionnelle. Épuisement de lymphocytes t a été marquée par la co-expression de récepteurs inhibiteurs PD-1, 3-LAG et TIM-315,21, qui a montré que CD8+ T voiture cellules étaient plus enclins à l’épuisement par rapport aux CD4+ voiture T cells () Figure 3 C). en outre, il a été vu aucune différence sur CD8+ épuisement de cellules T voiture dans la présence ou l’absence des CD4 appliquée conjointement+ cellules (Figure 3C), ce qui indique qu’induite par le CD4 CD8+ expansion des cellules T de voiture n’est pas associé à une meilleure fonction effectrice.
Ensemble, les résultats de cette analyse a identifié que CD4+ T voiture cellules CD8 surperformé+ cellules spécifiquement dans la cytotoxicité à long terme. Malgré la cytotoxicité similaire à court terme (1-3 jours, une fois résorbées), CD4 des cellules de+ T voiture fonction effectrice soutenue après provocation tumeur répétitive, tandis que CD8+ cellules devient épuisés et pas réussis à maîtriser la croissance des cellules tumorales. Quand les deux sous-ensembles ont été mélangés, CD4+ T voiture cellules favorisé l’expansion de CD8+ voiture T cells, mais l’état d’épuisement de CD8+ cellules n’étaient pas améliorées, résultant en l’absence d’effet synergique entre les deux groupes. Une différence semblable entre CD4+ et CD8+ T voiture cellules a été vu dans un modèle in vivo comme décrit précédemment21. En effet, CD8+ T voiture cellules étaient capables de médiation à court terme clairance de tumeur mais suivie avec récidive de l’antigène-positif ; en revanche, les CD4+ traitement des cellules T de voiture permis à long terme de l’éradication tumeur21, qui fait penser à leur potentiel de meurtre répétitives à l’aide de l’essai de reprise du traitement in vitro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig1.jpg"> Figure 1 : Stratégie de schéma et analyse du test défi répétitives. (A) schéma et chronologie du test défi tumeur répétitives. Pour chaque puits, lymphocytes T de voiture ont d’abord cultivés conjointement avec des cellules PBT030-2 GBM (cellules voiture + 4 000, 16 000 cellules tumorales) et re-contesté avec 32 000 cellules tumorales tous les deux jours (D2, D4 et D6). Analyse de la cellule tumorale et le nombre de cellules T de la voiture, ainsi que phénotype cellulaire T voiture est effectuée à D1, D3, D5 et D7. (B) Gating stratégie afin de déterminer le % de voitures en T des cellules avant de configurer la co-culture. (C) Gating stratégie de cellules vivantes, des cellules tumorales et des cellules de T de voiture de l’essai de défi répétitives. (D) tumeur des cellules nombre à des moments différents de l’essai de reprise du traitement, conjointement mis en culture avec des cellules de T untransduced. Barres d’erreur = ±ét. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig1large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig2.jpg"> Figure 2 : Défi répétitive test révèle des différences dans la mise à mort et prolifération puissance entre CD4+ et CD8+ T voiture cellules. (A) dégranulation et cytokines intracellulaires la coloration des CD4+ et CD8+ T voiture cellules après 5 h de co-culture avec des cellules GBM (E:T = 1:1). CD4 (B)+, CD8+ ou mixtes (CD4:CD8 = 1:1) voiture NKT donnèrent leur dosage défi répétitives, et les cellules tumorales viables ont été quantifiées. p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01, ***p &lt; 0,001 comparativement à CD4+, avec ANOVA à plusieurs Tests de comparaison de Bonferroni. CD4 (C)+ et CD8+ expansion des cellules T de voiture au cours de l’essai de défi tumeur répétitives. Comparaison de (gauche à droite) CD4+ vs CD8+, seul sous-ensemble ; CD4+ vs CD8+, au sein du groupe « mixte » ; CD4+, une seule / mixé ; CD8+, une seule / mixé. p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01, ***p &lt; 0,001 en utilisant le test t de l’étudiant un non appariés. Barres d’erreur = ±ét. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig3.jpg"> Figure 3 : Analyse du phénotype des lymphocytes T au cours de l’essai de défi répétitives. (A) 4-1BB et CD69 souillure sur les cellules de T de voiture au D1 du dosage. (B) CD45RO CD62L souillure et de lymphocytes T de la voiture avant de contester le dosage (entrée) et à D3 et D7 du dosage. (C) la co-expression de PD-1, 3-LAG et TIM-3 sur les cellules de T de voiture à D3 du dosage. (En haut) Blocage des stratégies pour identifier les cellules T exprimant les récepteurs inhibiteurs 1, 2 ou 3. (En bas) Comparaison de : CD4+ (sous-ensemble unique), les cellules CD8+ (sous-ensemble unique), les cellules CD8+ cellules (au sein du groupe « mixte »). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59275/59275table1.jpg"> Tableau 1 : Carte de plaque représentatif de l’installation de reprise du traitement.

Nous décrivons ici une méthode de culture in vitro de co aux cellules de T de tumeur ciblée de défi de manière récursive, qui permet une analyse phénotypique et fonctionnelle de l’activité antitumorale des lymphocytes T.

En reprise cellule tumorale in Vitro pour l’évaluation prédictive de l’antigène chimérique fonction antitumorale des récepteurs des lymphocytes T

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Ce protocole fournit une méthode fonctionnelle à long terme, in vitro, pour l’évaluation du récepteur chimérique d’antigène, ou cellules de T de CAR, par le défi répétitif de cellules de tumeur. Cette technique prend moins de temps, et moins laborieuse que l’évaluation in vivo de fonction de cellule T de CAR tout en réalisant toujours une représentation précise de l’efficacité vraie d’anti-tumeur. Cette technique in vitro permet le criblage et la différenciation à haut débit de la puissance anti-tumorale des cellules T de la RCA.Qui a l’application potentielle pour évaluer l’efficacité clinique des produits de cellule T de CAR. Commencez par dissocier les tumeurs du glioblastome d’une culture tumorale du glioblastome. Avec un millilitre d’accutase froide, et 30 à 60 secondes de pipetage.Quand les tumorspheres ont été perturbés, arrêtez la réaction avec cinq millilitres de milieu chaud de co-culture. Et pelleter les suspensions des cellules tumorales par centrifugation. Suspendre à nouveau les cellules du glioblastome à 1,6 fois 10 à la cinquième cellule tumorale par millilitre de concentration moyenne de coculture fraîche, et diluer les lymphocytes T récoltés à partir d’une culture des lymphocytes T car au pourcentage approprié de lymphocytes T positifs en RCA par millilitre de concentration moyenne de coculture.Ensuite, ajoutez 100 microlitres des cellules tumorales diluées à chaque puits d’une plaque de culture de tissu de fond bien plate de 96 puits. Et 100 microlitres de cellules T CAR dans chaque puits de cellules tumorales avec mélange doux. Placez ensuite la plaque dans un incubateur de dioxyde de carbone de 37 degrés Celsius et de 5 %.Les jours deux, quatre et six de la culture, soigneusement enlever 50 microlitres de milieu de chaque puits de la cellule tumorale, T cellule plaque de co-culture prévue pour rechallenge selon le tableau. Ensuite, ajouter 50 microlitres de suspension cellulaire glioblastome frais, préparé comme il vient de le démontrer, mais avec deux fois le nombre de cellules de la co-culture initiale à chaque puits avec un mélange doux. Et rendre la plaque à l’incubateur de culture cellulaire.Les jours un, trois, cinq et sept de la co-culture, transfèrent le surnatant de chaque puits pour être récolté dans une nouvelle plaque inférieure ronde de 96 bien selon le tableau et ajoutent 50 microlitres de 0,5% préchauffé Trypsin EDTA dans chaque milieu bien épuisé. Après cinq minutes à 37 degrés Celsius, confirmer que les cellules se sont détachées du fond de chaque puits par microscopie légère, et pipette doucement la solution enzymatique autour du fond de chaque puits pour résuspendre les cellules. Avant de transférer la suspension cellulaire détachée dans les puits correspondants appropriés de la nouvelle plaque de 96 puits.Pelleter les cellules par centrifugation, et laver les cellules avec 200 microlitres de fluorescents activé solution debout de tri cellulaire, ou FFS par puits avec une deuxième centrifugation. Suspendre à nouveau les granulés dans 100 microlitres du cocktail d’anticorps d’intérêt pour 100 microlitres de SSS par puits pendant une incubation de 30 minutes à quatre degrés Celsius. A la fin de l’incubation enlever tout anticorps non lié par séquentiel 100 et 200 microlitres FSS lave et re-suspendre les cellules dans 100 à 200 microlitres de tache nucléaire DAPI et FSS.Ensuite, analyser les cellules selon les protocoles standard d’analyse cytométrique de flux. Pour l’analyse fonctionnelle et phénotypique des cellules T de CAR après co-culture de cellules de tumeur, récupérez les fichiers de données du cytomètre d’écoulement, et portez toutes les cellules négatives réelles de DAPI. Pour quantifier les cellules tumorales, portez la population négative de CD45.Pour quantifier la barrière de cellules T de la RCA, la population positive de CD45 en RCA. Puis tracer les nombres de tumeurs et de cellules T CAR au cours de l’expérience, en identifiant l’activation des lymphocytes T par la co-expression de 41BB, et CD69. Épuisement des lymphocytes T par l’expression de PD1, LAG3 et TIM3, et le statut de mémoire des lymphocytes T LAG3, et TIM3, et le statut de mémoire des cellules T par CD45RO, et cd62 ligand expression.par CD45RO, et CD62 ligand expression. Les lymphocytes T CD4 positifs et CD8 positifs en RCA sont également activés contre les cellules du glioblastome qui expriment l’antigène cible tel qu’indiqué par leur expression CD107a et cytokine intracellulaire. Cependant, comme évalué par le défi répétitif de tumeur SA, CD4 positif, mais pas CD8 positif, cellules de T de CAR sont capables de tuer rond multiple.Les lymphocytes T CD4 positifs en RCA réalisent également une expansion plus robuste. Lorsque les lymphocytes T CD4 positifs et CD8 positifs en RCA sont mélangés à un rapport d’un à un, cette combinaison cellulaire permet d’obtenir des lymphocytes T CD8 positifs, mais non positifs au CD4 en termes de cytotoxicité à long terme. En outre, l’expansion des lymphocytes T CD8 positifs car est induite par l’ajout de lymphocytes T CD4 positifs.Tandis que l’expansion positive de cellule T de CAR cd4 est inhibée en présence des cellules positives de CDa. 24 heures après la co-culture initiale, les lymphocytes T CD4 positifs et CD8 positifs car sont activés de la même manière. Pendant le défi répétitif de tumeur, les cellules positives de CD4 et de CD8 positives de CAR T démontrent une transition d’un phénotype positif de mémoire centrale positif de CD45RO, de CD62 ligan, à un phénotype positif de mémoire d’effecteur de CD45RO de CD62 ligan.Les lymphocytes T CD8 positifs en RCA sont également plus sujets à l’épuisement que les lymphocytes T CD4 positifs en RCA évalués par leur expression PD1, LAG3 et TIM3 après trois jours de co-culture. De plus, aucune différence observée dans l’épuisement positif des lymphocytes T du CDa en présence ou en l’absence de lymphocytes T cd4 positifs, ce qui indique que l’expansion positive des lymphocytes T CD8 induits par CD4 n’est pas associée à une meilleure fonction effectrice. Cet essai peut également être couplé avec le tri des cellules T forment la co-culture pour effectuer une analyse plus approfondie sur les transcriptomes, la protéomique, et des gènes spécifiques d’intérêt.Ce défi répétitif de tumeur pourrait également être employé comme plate-forme pour étudier les événements biologiques après reconnaissance de tumeur de cellule T de CAR.

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Dans cette vidéo, nous démontrons le test de provocation tumorale répétitive pour évaluer le potentiel de destruction tumorale répétitive des cellules CAR-T lors de charges élevées de cellules tumorales. De plus, les cellules CAR-T peuvent être analysées à l’aide de la cytométrie en flux pour déterminer les différentes sous-populations de cellules CAR-T dans l’échantillon.

Essai de provocation tumorale répétitive : un essai de culture in vitro pour évaluer le potentiel de destruction des tumeurs répétitives des lymphocytes T du récepteur antigénique chimérique (CAR)

Cette vidéo présente une technique de fabrication ex vivo de lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR). Les lymphocytes T humains sont incubés avec des billes magnétiques recouvertes d’anticorps anti-CD3 et anti-CD28, ainsi qu’un milieu complété par l’interleukine-2 (IL-2), conduisant à l’activation et à la prolifération des lymphocytes T. Des vecteurs lentiviraux transgéniques sont introduits, ce qui permet à l’ARN transgénique de s’intégrer dans le génome de l’hôte et d’exprimer...

Une technique ex vivo pour fabriquer des lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique

Cette vidéo présente une technique de génération ex vivo de lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) spécifique de l’antigène tumoral. Des vecteurs rétroviraux porteurs d’ARN transgénique sont mélangés à des cellules de la rate dans un milieu complété par de l’interleukine-2 pour favoriser la survie et la prolifération des lymphocytes T. Le mélange est ensuite transféré sur une plaque recouverte de fragments de fibronectine humaine recombinante et centrifugée pour faciliter la...

Une technique ex vivo pour générer des lymphocytes T récepteurs antigéniques chimériques spécifiques à une tumeur

Cette vidéo présente un test in vitro pour valider l’activité des lymphocytes T du récepteur antigénique chimérique (CAR). Les cellules de lymphome à cellules B exprimant l’antigène CD19 et la luciférase cytoplasmique sont co-cultivées avec des cellules CAR-T spécifiques de CD19. La liaison des CAR aux CD19 sur une tumeur induit les cellules CAR T à libérer des cytokines et des toxines qui provoquent la cytotoxicité des cellules tumorales. L’activité des cellules CAR-T est évaluée en...

Un test in vitro pour évaluer l’activité antitumorale des cellules CAR-T spécifiques de la tumeur

Ce protocole est conçu pour évaluer la cytotoxicité de lymphocytes (cellules T voiture) redirigée immunothérapeutique contre les cellules cancéreuses structurés (sphéroïdes) 3D en temps réel.

Un essai de mise à mort de sphéroïde par les cellules de T de voiture

Nous décrivons un système d'essai in vitro quantitatif de cytolyse en temps réel pour évaluer la puissance des cellules De T de récepteur d'antigène chimérique ciblant les cellules tumorales liquides et pleines. Ce protocole peut être étendu pour évaluer d'autres cellules effectrices immunitaires, ainsi que des traitements combinés.

Un analyse de puissance en temps réel pour les cellules T de récepteur d'antigène chimérique ciblant les cellules cancéreuses solides et hématologiques

Ce protocole décrit la génération chirurgicale des tumeurs pancréatiques orthopiques et la digestion rapide des tumeurs pancréatiques murines fraîchement isolées. Après la digestion, les populations viables de cellules immunitaires peuvent être employées pour l'analyse plus en aval, y compris la stimulation ex vivo des cellules de T pour la détection intracellulaire de cytokine par cytométrie d'écoulement.

Génération de tumeurs pancréatiques orthopiques et caractérisation ex vivo de la cytotoxicité des cellules T infiltrantes

Ici, nous décrivons un protocole dans lequel un modèle de xénogreffe dérivée d’un patient atteint de leucémie lymphoblastique aiguë est utilisé comme stratégie pour évaluer et surveiller les toxicités associées aux lymphocytes T du récepteur de l’antigène chimérique CD19.

Évaluation des toxicités associées aux lymphocytes T du récepteur de l’antigène chimérique à l’aide d’un modèle murin xénogreffé dérivé d’un patient atteint de leucémie lymphoblastique aiguë

Ici, nous décrivons une méthode de création de gouttelettes à double émulsion encapsulant un lymphocyte T et une cellule cible cancéreuse afin d’examiner la destruction cellulaire au niveau de la cellule unique. Cette méthode permet une double quantification des molécules cytotoxiques et de l’apoptose des cellules cibles au sein d’une large population de lymphocytes T.

Essai de cytotoxicité basé sur des gouttelettes pour évaluer les lymphocytes T à récepteur de l’antigène chimérique au niveau de la cellule unique

Ce protocole est de récupérer et de préparer des cellules-cibles rares à partir d’un mélange avec des cellules non cibles fond pour la caractérisation génétique moléculaire au niveau unicellulaire. Qualité de l’ADN est égale à cellules individuelles non traitées et permet application unicellulaires (les deux dépistage basé et ciblée d’analyse).

Cible cellulaire pré-enrichissement et Whole Genome Amplification pour la cellule unique caractérisation en aval

Découvrez une méthode de co-culture in vitro pour évaluer la fonction antitumorale des cellules CAR-T par défis tumoraux répétés. Cette technique permet d'analyser l'activation et l'épuisement des lymphocytes T contre les cellules de glioblastome.

En reprise cellule tumorale in Vitro pour l’évaluation prédictive de l’antigène chimérique fonction antitumorale des récepteurs des lymphocytes T (Vidéo) | JoVE Journal

En reprise cellule tumorale in Vitro pour l’évaluation prédictive de l’antigène chimérique fonction antitumorale des récepteurs des lymphocytes T

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