Name: Mesure des taux de consommation d’oxygène intactes de Caenorhabditis elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Découvrez comment mesurer les taux de consommation d'oxygène chez Caenorhabditis elegans vivants sans isolation mitochondriale. Cette méthode permet d'évaluer précisément la fonction mitochondriale et la santé cellulaire.

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Les auteurs tenons à remercier le Dr Kevin Bittman pour ses conseils dans l’établissement de l’hippocampe XFp dans le laboratoire. National Institutes of Health accorder que gm088213 prise en charge de ce travail.

NOTE : La Figure 2 donne un aperçu schématique du protocole complet.
1. la croissance et la synchronisation de la population des nématodes9,10
<ol><li>Transfert L4 larves d’origines génétiques souhaitées (par exemple, N2 [sauvage] et sel-12 animaux) sur des plaques de médias (NGM) croissance nématode (voir le tableau 1 pour la recette) fraîchement ensemencées avec une pelouse d' Escherichia coli (OP50)11. Utilisez au moins deux 100 mm ou trois plaques de 60 mm pour chaque souche. Incuber les vers à la température de croissance approprié (entre 15 et 25 ° C) pendant 3 à 4 jours ou jusqu'à ce que les plaques sont concentrés avec grand nombre de œufs et les vers gravides.</li>
	<li>Lavez les œufs et les vers sur les plaques à l’aide d’environ 6 mL de tampon de M9 (voir le tableau 1 pour la recette) par plaque de 100 mm des nématodes et transfert avec verre pipettes Pasteur en tubes à centrifuger bouteille de 15 mL pour chaque souche. Tournez ces tubes vers le bas pendant 3 min à 6 180 x g et aspirer à la mémoire tampon de M9, conservant simplement le culot d’animaux et d’oeufs.</li>
	<li>Ajouter 3 à 4 mL de solution d’eau de Javel (voir le tableau 1 pour la recette) à chaque tube et par intermittence vortexer pendant 6 min. ajouter M9 tampon pour remplir chaque tube et tournent à x 6 180 g pendant 1 min et aspirer le surnageant. Ce lavage avec M9 le répète trois fois et déplacez le culot de œuf dans un tube de frais 15 mL contenant environ 9 mL de tampon de M9.</li>
	<li>Synchroniser les vers fraîchement écloses en oscillant à 20 ° C pendant 16 à 48 h. Spin ces tubes vers le bas à 6 180 x g pendant 1,5 min et déposa les animaux L1 synchronisées sur assiettes individuelles de NGM fraîchement ensemencées avec une pelouse de OP50 (environ 6 000 – 10 000 animaux par plaque de 100 mm) et garder à 20 ° C.</li>
	<li>Ces animaux atteindra le stade larvaire de L4 après ~ 42 h. A cette époque, déplacer les larves de L4 à l’aide d’une pioche de platine à OP50 ensemencées NGM plaques contenant 0,5 mg / mL 5-fluoro-2'-déoxyuridine (FUdR) pour les empêcher de produire des descendants. NOTE : S’assurer que dans une expérience toutes les souches sont synchronisés pour une durée similaire. FUdR traitement stérilise les animaux et empêche la production de pose et de leur descendance oeuf, qui pourrait influencer les OCR. Ces animaux stérilisés on analysera le lendemain (animaux adultes jour 1 à ~ 66 h) pour le dosage. FUdR a été signalé à l’impact de physiologie et la durée de vie de certains vers mutants. Par conséquent, cela devrait prendre en considération lorsque le médicament est utilisé pour la stérilisation12,13,14. Vers peuvent également être stérilisés par le biais de féminisant mutations telles que fem-1(hc17) ou fem-3(e2006). Toutefois, ces mutations peuvent influer la fonction mitochondriale.</li>
</ol>2. préparation des composés à doser et hydratation des sondes
Remarque : Pendant l’épreuve, les deux taux de respiration basale et maximale des nématodes sont mesurés. La respiration maximale est déclenchée chez les animaux lors de l’addition de carbonyl cyanide-4 (trifluormethoxy) phénylhydrazone (FCCP), un ionophore découplante qui perturbe le potentiel de membrane mitochondrial et donc la synthèse de l’ATP en transportant les protons à travers la membrane mitochondriale, tout en permettant à proton pompage, transport d’électrons et la consommation d’oxygène de procéder4,15 dételé de synthèse de l’ATP (Figure 1). La dernière étape dans le test implique l’addition d’azide de sodium (NaN3), un médicament qui inhibe les complexes IV et V dans l’ETC, permettant de déterminer la respiration mitochondriale-non16 (Figure 1). Les étapes suivantes peuvent être effectuées la veille de la course de dosage réel.
<ol><li>Préparer les solutions de la FCCP 1 mL (10 mM dans le diméthylsulfoxyde [DMSO] : 1000 x la concentration d’essai final) et NaN3 (400 mM de dH2O: 10 x concentration dosage final) et les conserver à-20 ° C. Remarque : Exécutez une courbe de concentration afin d’optimiser la concentration de FCCP requis pour susciter la réponse maximale d’OCR pour chaque instrument et le laboratoire.</li>
	<li>Hydrater la cartouche de sonde en ajoutant 200 µL de dH2O à chaque puits (et le réservoir avoisinante) dans l’assiette, veiller à ce que le capteur de sondes sont submergées dans la dH2O et conserver pendant la nuit à température ambiante. NOTE : La cartouche de sondes peuvent être laissés submergé pendant 72 h mais dans le cas d’une hydratation prolongée, les plaques doivent être enveloppés dans le film de paraffine et stockés à 4 ° C. Si l’hydratation pendant la nuit n’est pas possible, la cartouche de sonde doit être hydratée pendant au moins 4 h avant le dosage.</li>
	<li>Désactiver l’élément de chauffage dans l’interface de respiromètre et conserver l’appareil à l’intérieur d’un incubateur de 15 ° C durant la nuit à basse température à coeur au sein de l’instrument pour empêcher les animaux de surchauffe pendant l’épreuve. Remarque : Le respiromètre est équipé d’un élément chauffant mais ne peut pas être refroidi. Dans un incubateur à 15 ° C, le respiromètre aura une température stable située entre 18 et 22 ° C, qui est une température saine pour l’entretien c. elegans .</li>
</ol>3. chargement et cartouche l’équilibration du médicament
<ol><li>Pipetter dehors et jeter la dH2O utilisé pour hydrater le capteur sondes et remplacez-le avec 200 µL de la solution de degré (pH 7,4) dans chaque puits. Diluer la solution mère de FCCP à 100 µM FCCP dH2O et ajouter 20 µL de la solution diluée au port A injection dans la cartouche de la sonde. Ajouter 22 µL d’azide de sodium 400 mM au port B de la cartouche de senor.</li>
	<li>Allumer le respiromètre et sur l’écran accueil, sélectionnez Démarrer; la page de modèles s’affiche. Sur la page de modèles, sélectionnez vide ou un modèle déjà conçu ; la page de groupes s’affiche. Sur la page groupes, sélectionnez les puits A et H comme les puits à fond et assigner les autres 6 cupules dans les groupes appropriés selon le plan expérimental.</li>
	<li>Appuyez sur la flèche sur le coin inférieur droit pour accéder à la page de protocole. Dans la page protocole, vérifiez que les boutons de stabiliser, les noyaux et les Injections 1 et 2 sont sélectionnés. Sur cette page, ajuster le nombre de lectures de OCR basale ainsi que OCR maximale (après injection 1 avec FCCP) et non-mitochondriale OCR (après injection 2 avec l’azoture de sodium). Remarque : Chaque mesure est précédée d’un mélange et l’étape d’attente et les délais d’exécution pour ces paramètres sont indiqués dans le tableau 2.</li>
	<li>Sélectionnez la flèche sur le coin inférieur droit et une invite pour la plaque de cartouche de capteur de charge s’affiche. Veiller à ce que la plaque de cartouche de capteur est chargée dans la bonne orientation, suivant les instructions sur l’écran de rappel rapide. Le respiromètre sera maintenant équilibrer la cartouche. NOTE : Cet équilibre donne amplement le temps de placer les animaux à doser dans le puits de la plaque cellulaire.</li>
</ol>4. préparation du ver plat et épreuve
<ol><li>Ajouter 200 µL de tampon de M9 dans chacun des 8 puits de la plaque cellulaire et dans les réservoirs qui entourent les puits.</li>
	<li>Ramasser 100 ~ vers de chaque souche sur des plaques de NGM non ensemencées et laisser reposer pendant 2-3 min. mouillé la fin de la pioche de platine avec un tampon M9 et choisir 20 animaux âge synchronisées dans puits B-G, laissant les puits de fond A et H vide. Remarque : Après le chargement chacun Eh bien, attendez environ 2 min pour que les animaux puissent s’installer dans le fond des puits. Il est également souhaitable qu’une courbe numéro ver être exécuté afin d’optimiser le nombre de vis sans fin / puits pour chaque instrument et le laboratoire.</li>
	<li>Maintenant, le respiromètre doit être étalonné et en cliquant sur OK sur l’écran, la plaque contenant un tampon d’étalonnage est éjectée et peut être retirée de la respiromètre, tandis que la cartouche de capteur reste à l’intérieur de l’instrument. Remettez la plaque calibrant avec la plaque contenant les animaux. Plaque de charge et fermer la porte en appuyant sur continuer et permettent le dosage à exécuter.</li>
</ol>5. analyse des données post expérience
<ol><li>Une fois la série de test est terminée, suivez les invites à l’écran et enlever la plaque cellulaire et la cartouche de sonde et insérer un lecteur flash dans le port USB pour enregistrer les données d’exécution au format .war. Retirez la cartouche de capteur et que les animaux puissent se déposent au fond des puits pour environ 2 min. placer les plaques de la cellule sous une stéréo binoculaire et compter le nombre d’animaux par puits.</li>
	<li>Ouvrez le logiciel d’analyse sur l’ordinateur et ouvrez l’onglet de normalisation pour normaliser les OCR à plusieurs animaux. Appliquer des étiquettes correspondant aux différents groupes sous l’onglet modifier et exporter le fichier comme un fichier de prisme pour une analyse ultérieure. Remarque : La moyenne des cinq premières mesures, avant l’ajout de FCCP est l’OCR basale, alors que la moyenne des cinq mesures après que addition de FCCP est l’OCR maximale et la moyenne des cinq dernières mesures (minimum de deux mesures devrait être fait) après que addition de l’azoture de sodium est le taux de respiration non-mitochondriale. Le test doit être répété trois fois pour assurer la reproductibilité.</li>
</ol>

<ol><li>Nelson, D. L., Cox, M. M. Ch. 19. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNelson%2C+DL+%22Lehninger+Principles+of+Biochemistry%22">Lehninger Principles of Biochemistry</a>. Ahr, K. , W. H. Freeman and Company. 707-772 (2008).</li>
<li>Marchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+and+endoplasmic+reticulum+calcium+homeostasis+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death.</a> Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).</li>
<li>Sarasija, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin+mutations+deregulate+mitochondrial+Ca%282%2B%29+homeostasis+and+metabolic+activity+causing+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Luz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Morphology+and+Fundamental+Parameters+of+the+Mitochondrial+Respiratory+Chain+Are+Altered+in+Caenorhabditis+elegans+Strains+Deficient+in+Mitochondrial+Dynamics+and+Homeostasis+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes.</a> PLoS One. 10, e0130940(2015).</li>
<li>Ryu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urolithin+A+induces+mitophagy+and+prolongs+lifespan+in+C.+elegans+and+increases+muscle+function+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents.</a> Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).</li>
<li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).</li>
<li>Schulz, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+restriction+extends+Caenorhabditis+elegans+life+span+by+inducing+mitochondrial+respiration+and+increasing+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress.</a> Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).</li>
<li>Koopman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screening-based+platform+for+the+assessment+of+cellular+respiration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).</li>
<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Mitochondrial+Structure+in+the+Body+Wall+Muscle+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li>
<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+ROS+in+Caenorhabditis+elegans+Using+a+Reduced+Form+of+Fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).</li>
<li>Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).</li>
<li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+5%27-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).</li>
<li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).</li>
<li>Heytler, P. G., Prichard, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+class+of+uncoupling+agents--carbonyl+cyanide+phenylhydrazones%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).</li>
<li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).</li>
<li>Levitan, D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+lin-12-mediated+signalling+by+sel-12%2C+a+Caenorhabditis+elegans+S182+Alzheimer%27s+disease+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene.</a> Nature. 377, 351-354 (1995).</li>
<li>Sherrington, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+a+gene+bearing+missense+mutations+in+early-onset+familial+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease.</a> Nature. 375, 754-760 (1995).</li>
<li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mitochondrial+Ca2%2B+in+the+regulation+of+cellular+energetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics.</a> Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).</li>
<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201, 1453-1466 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La respiration mitochondriale est un indicateur perspicace de la fonction mitochondriale ; par conséquent, être capable de mesurer les taux de consommation d’oxygène dans un système biologique, si in vitro ou in vivo est extrêmement précieux. Respiromètres détecte les niveaux d’oxygène à l’aide de phosphores axée sur la porphyrine qui s’éteint par l’oxygène ou par l’intermédiaire de capteurs d’oxygène ampérométrique qui reposent sur la génération d’une proportionnelle de courant électrique à pression d’oxygène. Électrode...

L’adénosine triphosphate (ATP), la principale source d’énergie cellulaire, est produit dans les mitochondries par les enzymes de la chaîne de transport d’électrons (etc.) situés dans la membrane mitochondriale interne. Un métabolite clé utilisé pour la production d’ATP mitochondriale, le pyruvate est importé dans la matrice mitochondriale où elle est décarboxylée pour produire du coenzyme A (CoA). Par la suite, acétyl-CoA pénètre dans le cycle de Krebs ayant pour résultat la génération de nicotinamide adénine dinucléotide (NADH), une molécule porteuse de clé électronique. Comme les électrons de NADH sont passés à l’oxygène par le CTE, protons s’accumuler dans l’espace intermembranaire mitochondrial, qui se traduit par la génération d’un gradient électrochimique à travers la membrane. Ces protons ensuite découleront de l’espace intermembranaire à travers ce gradient électrochimique dans la matrice mitochondriale par le pore de proton de l’ATP synthase, conduire sa rotation et la synthèse de l’ATP1 (Figure 1).
La fonction mitochondriale n’est pas limitée à la production d’énergie, mais est également cruciale pour l’homéostasie du calcium, espèces réactives de l’oxygène (ROS) nettoyage et apoptose, positionnement critique leur fonction organismique santé2. La fonction mitochondriale peut être évaluée en utilisant une variété de tests, y compris mais sans s’y limiter à des analyses qui mesurent le potentiel de membrane mitochondrial, les niveaux d’ATP et ROS et concentrations de calcium mitochondrique. Toutefois, ces analyses donnent un aperçu unique de la fonction mitochondriale et donc ne pourraient pas fournir une vision globale de la santé mitochondriale. Étant donné que la consommation d’oxygène pendant la génération d’ATP est tributaire d’une myriade de réactions séquentielles, il sert un indicateur supérieur de la fonction mitochondriale. Fait intéressant, les variations dans les taux de consommation d’oxygène ont été observées à la suite de dysfonctionnement mitochondrial3,4,5.
Taux de consommation d’oxygène (OCR) des échantillons vivants peuvent être mesurées à l’aide de techniques qui peuvent être largement divisés en deux groupes : ampérométrique sondes d’oxygène et phosphores axée sur la porphyrine qui peuvent être éteint par l’oxygène6. Sondes d’oxygène ampérométrique ont été largement utilisés à mesure OCR en cellules, tissus et dans les systèmes de modèle, comme c. elegans. Cependant, les phosphores axée sur les porphyrines contenant respiromètres possèdent les avantages suivants : (1) elles permettent une comparaison côte à côte de deux échantillons en trois exemplaires, (2) ils ont besoin de plus petite taille de l’échantillon (par exemple, 20 vers / puits contre ~ 2, 000−5, 000 vers chez le 7de la chambre) et (3) le respiromètre peut être programmé pour faire quatre injections de composés différentes à désiré fois tout au long de la course expérimentale, éliminant le besoin d’application manuelle.
Dans ce protocole, les étapes à suivre pour utiliser un respiromètre de détection oxygène porphyrine-basé à mesure OCR en live, intact c. elegans sont décrit. Bien qu’il y a un protocole écrit pour l’utilisation du format grand, haut débit respiromètre8, ce protocole a été adapté pour une utilisation avec un instrument plus d’échelle sympathique, accessible et plus petit budget. Ce protocole est particulièrement utile pour évaluer la différence de l’OCR entre deux souches, où criblage à haut débit n’est pas nécessaire et son utilisation serait excessive.

<table><tbody><tr><td>Boîtes de Pétri de 100 mm, 60 mm</td><td>Kord-Valmark Labware Products</td><td>2900, 2901</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger de 1,5 mL</td><td>Globe Scientific</td><td>6285</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques de 15 mL</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>22 &times ; 22 mm Globe</td><td>Scientific</td><td>1404-10</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques de 50 mL</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-2</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptone</td><td>BD, Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto tryptone</td><td>BD, Bacto</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Bacto</td> extrait de levure <td>BD, Bacto</td><td>212705</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Générique</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté (CaCl2&middot ; 2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Cyanure de carbonyle 4-(trifluorométhoxy)phénylhydrazone (FCCP)</td><td>Abcam</td><td>ab120081</td><td></td></tr><tr><td>Cholestérol</td><td>Fisher Scientific</td><td>C314-500</td><td></td></tr><tr><td>Eau déminéralisée (dH2O)</td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thomas Scientific</td><td>C987Y85</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur en verre</td><td>Krackeler Scientific</td><td>6-72050-900</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4&middot ; 7H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium dibasique (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique anhydre (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-1</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFp Analyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFp FluxPak</td><td>Agilent</td><td>103022-100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure des taux de consommation d’oxygène intactes de caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

La fonction mitochondriale optimale est critique pour l’activité cellulaire en bonne santé, en particulier dans les cellules qui ont des exigences de haute énergie comme ceux du système nerveux et musculaire. Compatible avec cela, dysfonctionnement mitochondrial a été associé à une multitude de maladies neurodégénératives et vieillissement en général. Caenorhabditis elegans ont été un système puissant modèle pour élucider les nombreuses subtilités de la fonction mitochondriale. La respiration mitochondriale est un bon indicateur de la fonction mitochondriale et respiromètres récemment développés offrent une plate-forme d’état-of-the-art pour mesurer la respiration dans les cellules. Dans ce protocole, nous fournissons une technique pour analyser live, intact c. elegans. Ce protocole s’étend sur une période d’environ 7 jours et inclut des étapes de croissance (1) et la synchronisation c. elegans, (2) préparation de composés à doser et l’hydratation des sondes, chargement et cartouche l’équilibration du médicament (3), (4) préparation du test de ver plaque et épreuve et analyse des données de test post (5).

En utilisant le protocole décrit dans les présentes, OCR des animaux de type sauvage et trois différents sel-12 mutant souches ont été déterminés. sel-12 encode les orthologues de c. elegans de préséniline17. Mutations humaine préséniline sont l’aberration génétique plus commune associée au développement de la maladie d’Alzheimer familiale18. Nos études ont montré des niveaux élevés de calcium mitochondrique du <em...

La respiration mitochondriale est critique pour la survie de l’organisme ; par conséquent, le taux de consommation d’oxygène est un excellent indicateur de la santé mitochondriale. Dans ce protocole, nous décrivons l’utilisation d’un respiromètre commercialement disponible pour mesurer basale et taux de consommation maximale d’oxygène en vivent, intact et librement mobiles Caenorhabditis elegans.

Mesure des taux de consommation d’oxygène intactes de Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

La fonction mitochondriale est essentielle à l’homéostasie cellulaire et le taux de consommation d’oxygène est un indicateur décisif de la santé mitochondriale. Ce protocole fournit des instructions détaillées pour analyser le taux de consommation d’oxygène dans C.elegans. Ce protocole utilise des C.elegans mobiles vivants fournissant une mesure légale de la fonction mitochondriale.Élever la nécessité d’isoler les mitochondries, une étape qui pourrait potentiellement avoir un effet sur son intégrité. Pour commencer, transférez les larves L4 des milieux génétiques désirés sur une pelouse fraîchement ensemencée d’Escherichia coli sur des supports de croissance de nématode ou des plaques de NGM. Utilisez au moins deux plaques de 100 mm ou trois plaques de 60 mm pour chaque souche.Incuber les vers à la température de croissance appropriée pendant trois à quatre jours, ou jusqu’à ce que les plaques soient concentrées avec un grand nombre d’œufs et de vers gravids. Lavez les œufs et les vers des plaques à l’aide d’environ 6 millilitres de tampon M9 par plaque de nématodes de 100 millimètres. À l’aide de pipettes de pâturage en verre, transférer les œufs et les vers dans des tubes de centrifugeuse individuels de 15 millilitres pour chaque souche.Faites tourner ces tubes vers le bas pendant trois minutes à 6, 180 g. Après centrifugation, aspirez le tampon M9 en conservant seulement l’animal et la pastille d’oeuf. Ajouter trois à quatre millilitres de solution d’eau de Javel à chaque tube et vortex par intermittence pendant six minutes.Ajouter ensuite le tampon M9 pour remplir chaque tube et tourner à 6 180 g pendant une minute. Aspirer le supernatant et répéter ce lavage avec le M9, trois fois. Après le lavage, déplacez la pastille d’œuf dans un tube frais de 15 millilitres contenant environ neuf millilitres de tampon M9.Synchronisez les vers fraîchement éclos en les nutant à 20 degrés Celsius pendant 16 à 48 heures. Après avoir fait tourner ces tubes à 6 180 g pendant 1,5 minute, ez les animaux synchronisés L-1 sur une pelouse fraîchement ensemencée d’OP50 sur des plaques NGM individuelles. Gardez les plaques à 20 degrés Celsius jusqu’à ce que les animaux atteignent le stade larvaire L-4 après environ 42 heures.À l’heure actuelle, utilisez une pioche au platine pour déplacer les larves de L4 vers des plaques de MNM ensemencées OP50 contenant 0,5 milligramme par millilitre de FUdR pour empêcher la progéniture de produire. Hydratez la cartouche du capteur en ajoutant 200 microlitres d’eau distillée à chaque puits de la plaque, en veillant à ce que les sondes du capteur soient submergées. Conserver les assiettes toute la nuit à température ambiante.Éteignez l’élément chauffant à l’intérieur de l’interface du respiromètre. Le stockage de la machine à l’intérieur d’un incubateur de 15 degrés Celsius abaisse la température centrale à l’intérieur de la machine et empêche les animaux de surchauffer pendant l’essai. Après l’incubation pendant la nuit, pipette et jeter l’eau distillée utilisée pour hydrater les sondes capteur, et le remplacer par 200 microlitres de la solution calibrant dans chaque puits.Diluer la solution de stock FCCP à 100 micromolar FCCP dans de l’eau distillée. Ensuite, ajoutez 20 microlitres de la solution diluée au port d’injection A dans la cartouche du capteur. Ajouter 22 microlitres d’azides de sodium de 400 millimlaires au port d’injection B de la cartouche du capteur.Maintenant, allumez le respiromètre. Sur l’écran d’accueil, sélectionnez démarrer et les pages de modèle s’afficheront. Sur la page des modèles, sélectionnez blank » ou un modèle précédemment conçu.La page groupes s’affiche. Sur la page groupes, sélectionnez les puits A et H comme puits d’arrière-plan et assignez les six puits restants en groupes appropriés selon le plan expérimental. Accédez à la page du protocole en cliquant sur la flèche en bas à droite, et assurez-vous que l’équilibre, basal et injections un et deux boutons sont sélectionnés.Ajustez le nombre de lectures de l’OCR basal ainsi que l’OCR maximum et l’OCR non mitochondrial. Sélectionnez la flèche dans le coin inférieur droit. Une invite à charger la plaque de cartouche du capteur apparaîtra.Assurez-vous que la plaque de cartouche du capteur est chargée dans la bonne orientation, en suivant les instructions sur l’écran d’invite de rappel. Le respirameter va maintenant équilibrer la cartouche. Ajouter 200 microlitres de tampon M9 dans chacun des huit puits et réservoirs environnants de la plaque cellulaire.Cueillez environ 100 vers de chaque souche sur des plaques de NGM non enseillées et laissez reposer pendant deux à trois minutes. Ensuite, mouillez l’extrémité de la pioche platine avec le tampon M9 et choisissez des animaux synchronisés de 20 âges dans les puits B à G, laissant les puits de fond A et H vides. Maintenant, cliquez sur OK sur le logiciel de respiromètre pour éjecter la plaque contenant tampon d’étalonnage.Retirez la plaque du respiromètre en laissant la cartouche du capteur à l’intérieur de l’instrument. Remplacer la plaque calibrée par la plaque contenant les animaux. Chargez les plaques et fermez la porte en frappant continuer et permettre à l’essai de courir.Une fois l’analyse terminée, suivez les invites sur l’écran pour enlever la plaque cellulaire et la cartouche du capteur. Insérez un lecteur flash dans le port USB pour enregistrer le format de guerre des données en cours d’exécuter. Retirez la cartouche du capteur et laissez les animaux s’installer au fond des puits pendant environ deux minutes.Placez les plaques cellulaires sous un microscope à disséquer stéréo et comptez le nombre d’animaux par puits. Ouvrez le logiciel d’analyse, suivi de l’onglet normalisation, pour normaliser les taux de consommation d’oxygène au nombre d’animaux. Appliquez les niveaux appropriés pour les différents groupes sous l’onglet modifier et exportez le fichier sous forme de fichier prisme pour une analyse plus approfondie.La moyenne des cinq premières mesures est l’OCR basal. La moyenne des cinq mesures après l’ajout de FCCP est l’OCR maximal. Enfin, la moyenne des cinq dernières mesures après l’ajout d’azide de sodium est le taux de respiration non mitochondriale.Puisque la dysrégulation de calcium peut avoir comme conséquence la fonction mitochondrique altérée, ocr dans les mutants sel-12 et les animaux sauvages de type ont été mesurés pour examiner l’effet des mutations sel-12 sur la fonction mitochondrique et la santé. Les animaux de type sauvage présentaient constamment des taux basaux d’OCR inférieurs à cinq picomoles par minute, par ver. Tandis que les trois souches des mutants sel-12 ont montré l’OCR sensiblement élevé, d’approximativement sept picomoles par minute, par ver.Lors de l’ajout de FCCP, il y avait une augmentation de l’OCR de type sauvage, ainsi que sel-12 mutants, comme prévu. Les animaux de type sauvage présentaient un taux maximum d’OCR d’environ sept picomoles par minute, par ver. Tandis que les mutants sel-12 ont eu ocr d’approximativement 10 picomoles par minute, par ver.Utilisez des animaux vivants, bien nourris et asynchronisés dans cet essai, et évitez le transfert d’œufs ou de carcasses dans des puits d’analyse. De plus, la température interne de l’instrument ne doit pas dépasser 25 degrés Celsius. L’eau de Javel, le FCCP, le FUdR et l’azide de sodium sont toxiques.Par conséquent, il faut prendre soin de porter des gants de protection pendant la préparation des solutions de stock et le chargement des médicaments.

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