Name: Imagerie longitudinale intravitale du comportement cellulaire de tumeur cérébrale en réponse à une biopsie chirurgicale invasive (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Découvrez l'imagerie longitudinale intravitale pour étudier le comportement des cellules tumorales cérébrales chez la souris après biopsie chirurgicale. Cette méthode révèle l'impact de l'intervention sur la migration et la prolifération tumorale.

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Les auteurs remercient Anko de Graaff et le Hubrecht Imaging Center pour leur soutien en imagerie et Ellen Wehrens et Hannah Johnson pour la relecture et l'édition du manuscrit.

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</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Ici nous décrivons une méthode pour étudier des changements dans le comportement de cellules de tumeur au niveau de cellules simples en réponse aux procédures chirurgicales envahissantes, telles qu'une biopsie, dans le cerveau d'un animal vivant. La combinaison de la formation image multiphoton longitudinale avec l'implantation chirurgicale d'un CIW chronique permet la quantification de la migration, de l'invasion et de la prolifération des cellules tumorales avant et après la biopsie chez le même animal4. Comparée à d'autres approches utilisées pour la surveillance multiquotidienne de tumeur, telle que l'imagerie bioluminescente12,MRI10, ou PET/CT11,cette méthode visualise de façon unique des tumeurs sur un niveau unicellulaire et, ainsi, fournit la perspicacité dans le comportement cellulaire progression tumorale sous-jacente.
Pour effectuer avec succès cette méthode, plusieurs procédures doivent être maîtrisées. Les étapes les plus critiques de ce protocole sont l'implantation et le remplacement de CIW. La complexité technique de ces étapes exige des compétences techniques et de précision qui peuvent être acquises avec une formation régulière. Les complications pendant la chirurgie de CIW, telles que le saignement qui peut couvrir la surface de cerveau, peuvent s'avérer provocants pour la formation image suivante. Le manque d'outils ou d'environnement stériles, ainsi que l'incapacité de sceller complètement la surface du cerveau, peuvent causer une infection à la surface du cerveau (liquide blanc sous la couverture), ce qui rendra l'imagerie problématique et compromettra fortement les interprétation. Un autre problème commun de ce protocole est le mouvement animal pendant l'imagerie de time-lapse. Bien que tout changement de xyz puisse être corrigé après l'expérience, il est recommandé de corriger le point de coordonnées de chaque position avant chaque point de temps afin d'éviter toute perte d'information. La déformation des tissus est un problème supplémentaire constaté lors de l'imagerie sur un microscope inversé. Le tissu cérébral souffre de compression lorsque la souris est placée en position de supine. Selon le degré de déformation des tissus, le suivi des cellules tumorales peut conduire à une quantification erronée du déplacement cellulaire. Pour éviter cela, un logiciel pour la déformation rigide et élastique peut être utilisé14.
Tandis que cette procédure offre une application large pour étudier des changements dans le comportement de tumeur, certaines limitations devraient être considérées. Cette méthode permet aux scientifiques d'imager jusqu'à une profondeur de 1,6 mm (avec l'utilisation d'un oscillateur paramétrique optique); cependant, cela signifie que l'imagerie est limitée aux zones superficielles du cortex cérébral15. Ainsi, quelques tumeurs de cerveau situées dans les structures profondes de cerveau, y compris les gliomes intrinsèques diffus de pontine situés dans la région de tronc cérébral, ne peuvent pas être étudiées dans leur environnement original de cerveau avec ce protocole. Une autre limitation de ce protocole est le volume de la tumeur qui peut être photographié. Bien que le balayage total de volume de tumeur soit désiré pour obtenir l'information maximale, souvent, la taille de tumeur et la vitesse des cellules migratrices peuvent être des facteurs limitants. Pour chaque type de tumeur, un time-lapse optimal pour la formation image doit être considéré. Si le délai entre les images est trop long, il peut être difficile de suivre les cellules tumorales. L'utilisation d'un scanner résonant peut fortement diminuer le temps de balayage, permettant l'imagerie d'une plus grande tumeur16. Enfin, l'analyse manuelle de l'image de ce protocole peut prendre beaucoup de temps, de sorte que les programmes de suivi 3D automatisé peuvent être utilisés. Cependant, les résultats du suivi doivent toujours être supervisés visuellement puisque les algorithmes de suivi automatisé des cellules sont rarement conçus pour récapituler exactement la migration des cellules d'intérêt.
De légères adaptations du protocole décrites ici peuvent permettre un éventail encore plus large d'applications. Au lieu d'effectuer des biopsies, d'autres interventions (chirurgicales) peuvent être mises en œuvre, telles que la résection partielle de tumeur ou la livraison des gaufrettes de chimiothérapie. L'ajout de composés par un microtube implanté chirurgicalement peut être combiné avec ce protocole pour cibler pharmacologiquement des molécules spécifiques d'intérêt. Nous nous attendons à ce que ce modèle soit utile dans les études visant à analyser l'impact d'une certaine intervention sur le comportement des cellules tumorales. La possibilité d'effectuer des mesures répétées chez le même animal fournit non seulement des données plus précises sur les changements se produisant dans la tumeur, mais réduit également considérablement le nombre d'animaux expérimentaux nécessaires par étude.

La norme de soin pour la plupart des tumeurs pleines inclut la biopsie de tissu pour le diagnostic, le pronostic, et la détermination personnalisée de traitement1,2. Dans l'ensemble, ces procédures donnent l'avantage clinique, mais les preuves récentes indiquent que la biopsie et d'autres procédures plus invasives, telles que la résection de tumeur, peuvent également influencer négativement la progression de tumeur3,4,5 , 6. Bien que ces procédures demeurent indispensables aux soins hospitaliers et que leurs bienfaits surmontent leurs effets négatifs, il est nécessaire de bien comprendre les mécanismes qui sous-tendent ces effets négatifs afin de maximiser la sécurité des patients et influences positives de ces procédures et les rendent encore plus bénéfiques sur le plan clinique.
Les effets indésirables de biopsie-négociés sur la progression de tumeur sont déclenchés par des altérations systémiques et des changements dans le microenvironnement de tumeur en réponse à la perturbation de tissu4,5. Ainsi, il est nécessaire d'étudier ce processus chez les animaux vivants. Cependant, les conséquences subtiles de ces procédures mini-invasives peuvent souvent être déguisées par de grandes variations entre les individus. Les méthodes conventionnelles basées sur l'immunohistochimie ou l'analyse transcriptionnelle d'expression peuvent négliger ces effets ou exiger un grand nombre d'animaux pour les identifier. En outre, ces approches statiques n'ont pas la capacité d'identifier des changements dans le comportement de cellules de tumeur tels que la migration et l'invasion, processus dynamiques qui corrélensont avec la malignité de tumeur. Ces dispositifs de cellules de tumeur sont d'importance particulière pour les tumeurs cérébrales fortement agressives, telles que le multiforme de glioblastoma (GBM), où la diffusion locale des cellules de tumeur limite la résection chirurgicale et diminue la surviepatient7. Pour bien comprendre comment les biopsies affectent le comportement des cellules GBM, une approche longitudinale qui permet la visualisation de ces cellules dans le contexte physiologique des organismes vivants est nécessaire.
Le développement récent de l'imagerie intravitale à haute résolution en combinaison avec des fenêtres d'imagerie chronique implantées chirurgicalement permet aux scientifiques d'étudier le comportement dynamique des cellules tumorales chez les souris vivantes sur plusieurs jours8,9. En utilisant cette approche puissante, nous pouvons étudier comment les cellules tumorales proliférant, migratoire, et le comportement infiltratif change sur plusieurs jours en réponse à une biopsie dans la même souris. Comparé à d'autres techniques qui permettent la surveillance de plusieurs jours des tumeurs chez les souris vivantes, telles que l'imagerie par résonance magnétique (MRI)10, la tomographie par émission de positrons/tomographie calculée (PET/CT)11, ou l'imagerie bioluminescente12, cette l'approche offre unique la possibilité d'étudier le comportement de cellule de tumeur au niveau de cellules simples et de démêler les changements subtils se produisant dans la tumeur.
Ici, nous décrivons une méthode détaillée pour exécuter la biopsie-comme des dommages et l'imagerie intravital longitudinale pré- et postbiopsie dans le cerveau des souris tumeur-portantes. Cette méthode peut potentiellement être appliquée pour étudier d'autres interventions chirurgicales, telles que la résection partielle de tumeur ou l'implantation des gaufrettes de chimiothérapie.

<table><tbody><tr><td>25g x 16 mm aiguilles hypodermiques</td><td>BD Microlance</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>701 RN 10uL SYR W/O NEEDLE</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>Éponge résorbable en gélatine</td><td>Pfizer</td><td>Gelfoam</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips ronds 6 mm</td><td>VWR international</td><td>631-0168</td><td></td></tr><tr><td>Colle cyanoacrylate</td><td>Pattex</td><td>Pattex Ultra gel</td><td></td></tr><tr><td>Dental ciment</td><td>Vertex Dental</td><td>Vertex Self-Curing</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Dremel</td><td>Dremel 3000 (la perceuse dentaire peut être plus pratique) + 105 Coupe-gravure</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler fine incurvée</td><td>Dumont</td><td>AGT508</td><td></td></tr><tr><td>Hypnorm</td><td>VetaPharma Ltd</td><td>Hypnorm (Citrate de fentanyl 0,315 mg/ml+ Fluanison 10 mg/ml)</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Actavis</td><td>Midazolam Actavis 5mg/ml</td><td></td></tr><tr><td>Pommade ophtalmique</td><td>Kela Veterinaria</td><td>Duodrops veter kela 10 m</td><td></td></tr><tr><td>Injecteur stéréotaxique Quintessential (QSI)</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>Huile de silicone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>181838</td><td></td></tr><tr><td>Cadre stéréotaxique</td><td>Stoelting</td><td>Lab stéréotaxique, rat et souris</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope chirurgical</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temgesic (0,3 mg/ml)</td><td>BD Pharmaceuticals</td><td>283732</td><td></td></tr><tr><td>Vannas T&uuml ; Bingen Ciseaux à ressort</td><td>Harvard Appareil</td><td>72-8508</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaïne (Lidocaïne 1 % + Épinéphrine 1:100 000) Anesthésique local</td><td>Astrazeneca</td><td>Xylocaïne (Lidocaïne 1 % + Épinéphrine 1:100 000)</td><td></td></tr></tbody></table>

imagerie longitudinale intravitale du comportement cellulaire de tumeur cérébrale en réponse à une biopsie chirurgicale invasive

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Les biopsies sont la norme de soin pour le traitement de cancer et sont médicalement salutaires car elles permettent le diagnostic plein de tumeur, le pronostic, et la détermination personnalisée de traitement. Cependant, la perturbation de l'architecture de tumeur par biopsie et d'autres procédures envahissantes a été associée aux effets indésirables sur la progression de tumeur, qui doivent être étudiés en profondeur pour améliorer davantage l'avantage clinique de ces procédures. Les approches statiques conventionnelles, qui fournissent seulement un instantané de la tumeur, sont limitées dans leur capacité de révéler l'impact de la biopsie sur le comportement de cellules de tumeur telle que la migration, un processus étroitement lié à la malignité de tumeur. En particulier, la migration de cellules de tumeur est la clef dans les tumeurs fortement agressives de cerveau, où la diffusion locale de tumeur rend la résection totale de tumeur pratiquement impossible. Le développement de l'imagerie multiphoton et des fenêtres d'imagerie chronique permet aux scientifiques d'étudier ce processus dynamique chez les animaux vivants au fil du temps. Ici, nous décrivons une méthode pour la formation image longitudinale à haute résolution des cellules de tumeur de cerveau avant et après une biopsie dans le même animal vivant. Cette approche permet d'étudier l'impact de cette procédure sur le comportement des cellules tumorales (migration, invasion et prolifération). En outre, nous discutons les avantages et les limites de cette technique, aussi bien que la capacité de cette méthodologie d'étudier des changements dans le comportement de cellules cancéreuses pour d'autres interventions chirurgicales, y compris la résection de tumeur ou l'implantation de la chimiothérapie Gaufrettes.

Pour évaluer l'impact de la biopsie sur le comportement de cellules de tumeur de cerveau, nous avons exécuté la procédure décrite dans ce protocole. Glioma—GL261 cells—expressing a nuclear fluorescent protein (H2B-Dendra2) were injected in the brain of C57BL/6 mice, and a chronic CIW was implanted. L'imagerie intravitale time-lapse a été réalisée sur le même animal pré- et post-biopsie-comme la blessure à la tumeur (Figure 1A, B). La migration des cellules tumorales individuelles a été déterminée en suivant le chemin de migration au fil du temps dans différents plans xy de la z-pile (Figure 1C) et tracée en pourcentage des cellules migratrices avant et postbiopsie (Figure 1F). Le taux de prolifération des cellules tumorales a été quantifié en fonction de la condensation Dendra2 marquée par H2B sur la mitose (Figure 1D) et tracée en pourcentage des cellules de division avant et postbiopsie (Figure 1E). Nous avons comparé la répartition de la vitesse de migration avant et après la biopsie dans la même tumeur et nous avons constaté que le nombre de cellules migratrices (vitesse de 4 m/h) a augmenté après l'intervention, avec une diminution associée du nombre de cellules lentes/non-migratoires ( vitesse de lt; 4 m/h) (Figure 2A). En moyenne par tumeur, nous avons observé une augmentation de 1,75 (SD - 0,16) du pourcentage de cellules migratrices lorsqu'une lésion ressemblant à une biopsie a été pratiquée, comparativement à des souris témoins qui n'ont pas été biopsiées (figure 2B). Nous avons surveillé le comportement des cellules tumorales pendant une autre semaine et nous avons constaté que, bien que le pourcentage de cellules tumorales migratrices ait finalement diminué chez les souris témoins et biopsiées, les souris biopsiées présentaient encore une capacité migratoire plus élevée que les souris témoins ( Figure 2C). L'analyse du comportement proliférant des cellules tumorales au fil du temps a montré une augmentation de 1,52 (SD - 0,26) du nombre d'événements mitotiques lors de la biopsie, par rapport aux souris témoins non biopbiologiques (Figure 2D).
Pour tester si les effets observés de la biopsie sur la prolifération des cellules tumorales et le comportement migratoire était un artefact dû à la chirurgie de remplacement CIW (nécessaire pour effectuer une biopsie-comme la blessure), nous avons surveillé le comportement de cellules de tumeur dans un groupe de souris qui ont subi CIW remplacement sans biopsie. Dans ce groupe, nous n'avons observé aucune induction de migration ou prolifération des cellules tumorales, ce qui indique que l'augmentation de la prolifération des cellules tumorales et des taux de migration a été spécifiquement déclenchée par des lésions semblables à celles d'une biopsie (figure3A, B).
La photo-convertibilité stable de la protéine fluorescente Dendra2 permet d'étudier l'infiltration des cellules tumorales sur plusieurs jours. Lors de l'exposition à la lumière ultraviolette/bleue, Dendra2 passe du vert au rouge. À l'aide de cette propriété, une région carrée de la tumeur a été illuminée et 200 cellules tumorales exprimant Dendra2 ont été marquées par photo avant la biopsie (Figure 4). Un jour après la biopsie, nous avons relocalisé la région photo-commutée et mesuré le volume des cellules de tumeur qui s'étaient infiltrées dans le tissu de tumeur environnant. Nous avons constaté que la zone d'infiltration était 1,72 (SD - 0,41) fois plus grande dans les tumeurs après une biopsie-comme des dommages comparés aux tumeurs témoins non biopbiologiques (figure 4). Bien que cette approche ne fournit que des informations sur le comportement infiltrat en vrac des cellules tumorales et non sur un seul niveau cellulaire, elle prend moins de temps que l'approche d'imagerie en accéléré et peut être la méthode de choix pour les questions de recherche axées exclusivement sur l'étude du comportement infiltratif.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59278/59278fig1.jpg"> Figure 1 : Configuration expérimentale pour l'imagerie intravitale longitudinale de l'effet de biopsie sur le comportement des cellules tumorales. (A) Diagramme montrant la conception de l'anneau et du support magnétique. (B) Représentation schématique du flux de travail expérimental. Des cellules tumorales sont injectées dans le cerveau des souris et un CIW est établi. Au développement de tumeur, une première session de formation image de time-lapse (prébiopsie) est exécutée. Le lendemain, la biopsie et le remplacement de CIW sont mis en œuvre. Le lendemain de l'imagerie (postbiopsie), une deuxième séance d'imagerie en accéléré est effectuée. Pour les effets à long terme, des séances d'imagerie ultérieures peuvent être effectuées. (C) Les images montrent des instantanés représentatifs d'un film en time-lapse où les cellules tumorales GL261 H2B-Dendra2 ont été suivies. Les lignes rouges dépeignent des traces individuelles de cellules tumorales. La barre d'échelle de 50 m . (D) Représentant in vivo des images en time-lapse affichant des cellules de division dans les tumeurs GL261 H2B-Dendra2. Différentes étapes de la mitose sont indiquées : prophase (P), proméaphase (Pm), métaphase (M), anaphase (A) et télophase (T). La barre d'échelle de 50 m.Les graphiques indiquent le pourcentage de cellules migratrices (E) et (F) qui divisent les cellules avant et après la postbiopsie. Chaque point indique le pourcentage de cellules migratrices dans toutes les positions mesurées chez un animal individuel. Les données sont présentées comme moyennes - S.E.M. de six souris (P 'lt; 0.01, t-testjumelé). Ce chiffre a été modifié àpartir d'Alieva et al.4 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59278/59278fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59278/59278fig2.jpg"> Figure 2 : Résultats représentatifs montrant l'impact de la biopsie sur les taux de migration et de prolifération des cellules tumorales. (A) Parcelles de chute d'eau montrant le changement dans la distribution de la vitesse cellulaire par rapport à la migration basale chez les souris individuelles. Les données sont présentées comme moyennes - S.E.M. de cinq souris. (B) Le nombre de cellules migratrices contrôlées (bleues) et biopsiées (rouges) animaux normalisés au nombre de cellules migratrices pré-intervention (n - 6 souris,P lt; 0,0001, Student's t-test). (C) Le comportement des cellules tumorales a été suivi sur plusieurs jours. On montre le nombre normalisé (par rapport à la pré-intervention) de cellules migratrices chez les souris individuelles au fil du temps(n 'gt; 4 souris par condition, 'P 'lt; 0.0001, bidirectionnelle ANOVA). (D) Le nombre normalisé de cellules de division sous contrôle (bleu) et d'animaux biopsiés (rouges). Par animal, les valeurs post-intervention ont été normalisées aux valeurs pré-intervention (n ' 5 souris, 'P 'lt; 0.01, Student's t-test). Ce chiffre a été modifié àpartir d'Alieva et al.4 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59278/59278fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59278/59278fig3.jpg"> Figure 3 : Le remplacement de CIW n'a aucun effet sur le comportement des cellules tumorales. L'imagerie intravitale longitudinale montre que le remplacement du CIW sans biopsie n'a aucun effet sur les taux de migration et de prolifération. (A) L'augmentation du nombre de cellules migratrices pour les conditions indiquées. Chaque symbole représente la moyenne d'une souris individuelle, et n4 souris. (B) L'augmentation du nombre de cellules proliférantes pour les conditions indiquées. Chaque symbole représente la moyenne d'une souris individuelle (n 4 souris, P 'lt; 0.01,'P 'lt; 0.001, ns 'non significatif, anocel way avec Newman-Keuls post hoc test). Ce chiffre a été modifié àpartir d'Alieva et al.4 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59278/59278fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59278/59278fig4.jpg"> Figure 4 : Diagramme montrant la configuration expérimentale et les résultats représentatifs obtenus avec dendra2 photo-switching. Pour surveiller l'infiltration de cellules de tumeur sur la biopsie, les cellules de tumeur Dendra2-exprimant sont photo-commutées dans une région carrée par l'illumination UV/lumière bleue et imaged, 1 jour avant la biopsie. Un jour après la biopsie, la région photo-commutée est relocalisée et réimage. Sont montrées les images représentatives de Dendra2 de l'infiltration de cellules de tumeur, corrigées utilisant la soustraction de canal. La ligne pointillée blanche représente la zone d'infiltration. La barre d'échelle de 50 m. Le graphique montre l'augmentation de la zone photo-commutée tracée pour les souris biopsiées (rouges) et de contrôle (bleues). Chaque point représente la valeur moyenned'une souris individuelle (n 5 souris,P lt; 0,05, Student's t-test). Ce chiffre a été modifié àpartir d'Alieva et al.4 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59278/59278fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Ici nous décrivons une méthode pour l'imagerie multiphoton de time-lapse de haute résolution des cellules de tumeur de cerveau avant et après l'intervention chirurgicale invasive (par exemple, biopsie) dans le même animal vivant. Cette méthode permet d'étudier l'impact de ces procédures chirurgicales invasives sur le comportement migratoire, invasif et proliférant des cellules tumorales à un seul niveau cellulaire.

Imagerie longitudinale intravitale du comportement cellulaire de tumeur cérébrale en réponse à une biopsie chirurgicale invasive

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Ce protocole permet à l’utilisateur d’étudier l’impact des interventions chirurgicales invasives utilisées dans la clinique sur les comportements tumoraux cellulaires, tels que la migration, l’invasion et la prolifération. Cette méthode permet uniquement la visualisation de la même tumeur avant et après une procédure invasive, fournissant un aperçu qui pourrait être manqué dans une approche non longitudinale. Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des orteils chez une souris adulte anesthésiée, monter la souris sur un cadre stéréotaxique et fixer la tête avec une pince nasale et deux barres d’oreille.Utilisez une lampe chauffante pour préserver la température corporelle et appliquez de l’onguent sur les yeux de l’animal. À l’aide de ciseaux pointus, raser la fourrure sur le crâne des yeux à la base du crâne, et utiliser 70% d’éthanol pour stériliser la peau exposée. Couper la peau d’une manière circulaire, et utiliser un coton-tige pour gratter le périoste exposé.Traitez la zone chirurgicale avec une baisse de 1% de lidocaïne, et une concentration de 1:100 000 d’épinéphrine pendant cinq minutes avant d’enlever la solution excédentaire avec un coton-tige. Utilisez de la colle cyanoacrylate pour coller les bords de la peau au crâne, et placez le cadre stéréotaxique sous un microscope stéréo dissection avec un grossissement 4x. Ensuite, percez soigneusement une rainure circulaire superficielle de cinq millimètres de diamètre sur l’os pariétal droit.Et appliquez une goutte de tampon de cortex sur la rainure. Utilisez des forceps minces pour soulever le rabat d’os pour visualiser la surface du cerveau, et utilisez des forceps incurvés, coniques et très fins pour enlever le dura mater. Si le saignement se produit, utilisez une éponge de gélatine absorbable pour atteindre l’hémostase.Pour l’injection de cellules tumorales, chargez environ trois microlitres des cellules dans une seringue étanche au gaz de cinq microlitres équipée d’une aiguille de type point deux. Fixez l’aiguille sur le bras manipulateur stéréotaxique et retirez le tampon du cortex du tissu exposé. Placez la pointe de la seringue au milieu de la craniotomie et insérez l’aiguille à une profondeur de 0,5 millimètre de la surface du crâne.Ensuite, ajoutez une goutte de cortex tampon à la craniotomie, et utilisez un injecteur de pompe à microsyringe pour livrer les cellules à un taux de 250 à 400 nanolitres par minute. Pour préparer la fenêtre d’imagerie crânienne, remplacez le tampon du cortex par une goutte d’huile de silicone au site de craniotomie pour éviter les bulles d’air sous la fenêtre. Sceller le cerveau exposé avec un coverslip de six millimètres, et appliquer de la colle cyanoacrylate entre le coverslip et le crâne.Ensuite, utilisez de fines pinces à épiler pour appuyer doucement sur le coverslip contre le crâne. Au point de temps expérimental approprié, placez la souris face vers le haut dans une boîte d’imagerie, et réglez l’objectif d’eau 25x à la position z la plus basse. Ajoutez une grande goutte d’eau à l’objectif et transférez la boîte d’imagerie dans la chambre climat sombre de 37 degrés Celsius du microscope.Apportez l’objectif à la fenêtre d’imagerie crânienne coverslip jusqu’à ce que la goutte d’eau touche le coverslip. Et en utilisant le mode d’épifluorescence, observez la tumeur à travers l’oculaire pour mettre les cellules au point. Réglez le laser à la longueur d’onde correcte et sélectionnez le mode live.Après avoir sélectionné plusieurs postes d’intérêt pour l’imagerie, enregistrez leurs coordonnées dans le logiciel. Définissez une z-stack pour chaque position pour acquérir le volume maximal de cellules tumorales sans compromettre la résolution des cellules tumorales, avec la taille de l’étape entre les images réglées à trois micromètres. Ensuite, acquérir des images du volume tumoral à différentes positions toutes les 20 minutes pendant deux heures, en ajoutant de l’eau à l’objectif avant chaque acquisition d’image.Après l’acquisition de la dernière image, transférez la souris sur un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à la récupération complète. Un jour après la première séance d’imagerie, fixez la souris anesthésiée dans le cadre stéréotaxique comme démontré, et utilisez un coton-tige imbibé d’acétone pour essuyer les bords du coverslip jusqu’à ce que la colle soit ramollie. Faites glisser une aiguille de calibre 25 sous le coverslip et utilisez des forceps à point mince pour la soulever, et hydratez la craniotomie avec un tampon de cortex frais.Perforer la tumeur à une profondeur d’un millimètre avec une aiguille de calibre 25, arrêter tout saignement avec une éponge de gélatine stérile, et sceller la surface du cerveau avec de l’huile de silicone frais. Collez ensuite une nouvelle couverture de six millimètres sur la plaie. Pour l’analyse d’image, ouvrez le fichier LIF en accéléré dans le logiciel microscope et sélectionnez le processus d’onglet, les outils de processus et la fusion.Sélectionnez la première image de la séquence de temps et cliquez en premier. Sélectionnez la deuxième image de la séquence de temps et cliquez sur deuxième. Dans Merge Dimensions, sélectionnez t pour le temps, puis cliquez sur appliquer.Un nouveau fichier avec deux points de temps sera généré. Après avoir suivi chaque série time-lapse pour trois z-stacks consécutifs séparément, faites glisser le dossier contenant les images time-lapse à ImageJ. Sélectionnez l’onglet Plugins, Tracking et MtrackJ.Pour suivre chaque cellule, sélectionnez Ajouter et cliquez sur chaque cellule à chaque point de temps. Cliquez ensuite sur mesurer, et enregistrer le fichier pour extraire la mesure des pistes. La migration des cellules tumorales individuelles peut être déterminée en suivant la trajectoire de migration au fil du temps dans différents plans xy de la pile z et tracée en pourcentage des cellules migratrices avant et après biopsie.Le taux de prolifération des cellules tumorales peut être quantifié en fonction de la condensation Dendra2 taguée H2B sur la mitose et tracée en pourcentage des cellules de division avant et après biopsie. La comparaison de la distribution de la vitesse de migration avant et après la biopsie dans la même tumeur, révèle que le nombre de cellules migratrices augmente après l’intervention, avec une diminution associée du nombre de cellules lentes à nonmigratoires. En moyenne par tumeur, une augmentation de 1,75 fois du pourcentage de cellules migratrices est observée lorsqu’une lésion de la biopsie est effectuée, par rapport aux souris témoins non biopsiées.Bien que le pourcentage de cellules tumorales migratrices diminue par la suite chez les souris témoins et biopsiées, les souris biopsiées présentent toujours une capacité migratoire plus élevée que les souris témoins dans l’ensemble. Le comportement prolifératif de cellules de tumeur démontre également une augmentation de 1,52 fois du nombre d’événements mitotiques sur la biopsie au fil du temps, par rapport aux souris témoins non biopsied. De noter qu’aucune induction de la migration ou de la prolifération des cellules tumorales n’est observée après le remplacement de la fenêtre d’imagerie crânienne sans biopsie, ce qui indique que l’augmentation des taux de prolifération et de migration des cellules tumorales est spécifiquement déclenchée par les lésions de la biopsie.Il est important de travailler avec une grande précision et des compétences chirurgicales pendant les étapes d’imagerie crânienne, d’implantation et de remplacement. Une pratique extensive peut être nécessaire.

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