Analyse colorimétrique d’activité Phosphatase alcaline dans le Biofilm de S. aureus
12 avril 2019
Dans ce manuscrit, nous avons mis en place une méthode de haut débit afin de quantifier l’activité de la phosphatase alcaline dans la culture de biofilm de S. aureus de plaque 96 puits vitroplants
Ce protocole a présenté une méthode facile et fiable pour mesurer l’activité alcalinisée de phosphatase dans la culture de biofilm de S.aureus. Il nous aidera à comprendre la fonction d’ALP dans la formation de biofilms. Le principal avantage de cette technique est le débit élevé.
Il est très sensible et facile à exécuter. Kevin Danikowski, un ancien élève du Harper College, démontrera la procédure. Pour préparer le BST, ajouter le digest pancréatique de la caséine, la digestion papaique de la farine de soja, le chlorure de sodium, le dextrose et le phosphate de dipotassium dans l’eau distillée.
Couvrir le flacon de papier d’aluminium et le mettre dans un autoclave pour stériliser avant utilisation. Pour préparer une TSA, ajouter une agar au BST et la mettre dans l’autoclave pour la stérilisation. Ensuite, laissez-le refroidir à température ambiante.
Ensuite, versez-le dans la boîte de Pétri à un rapport de 20 millilitres par plat. Pour préparer un milieu de culture biofilm, ajouter du glucose au BST autoclavé pour atteindre la concentration de 10 grammes par litre. À l’aide d’un kit de filtration sous vide, filtrer la solution à l’aide d’un filtre de la taille d’un pore de 0,2 micromètre.
Pour inoculer, utilisez une boucle d’inoculation stérilisée pour choisir une colonie individuelle de Staphylocoque dans la boîte de Pétri et la placer dans le tube de culture rempli de 10 millilitres de BST. Mettez le tube dans l’incubateur pour croître pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Avec une micropipette, dessiner 100 microlitres de la culture du jour au lendemain et le transférer dans un tube de culture rempli de 10 millilitres de BST avec du glucose pour une dilution de ratio de volume de 1:100.
Vortex doucement pour mélanger pour une concentration constante. Utilisez une micropipette pour transférer 200 microlitres de culture diluée dans un total de 18 puits à partir d’une plaque de puits de 96. Incuber la plaque de puits 96 à 37 degrés Celsius pendant 24 heures pour la formation de biofilms.
Pour la meilleure formation de biofilm de S.aureus, il est préférable de choisir une plaque de puits à fond plat ou rond 96. Après cela, inclinez légèrement la plaque pour décanter le surnatant par aspiration du bord de chaque puits. Lavez-les bien avec 1X PBS.
Mettez la plaque dans la centrifugeuse pour tourner pendant cinq minutes à 8000 tours par minute et décanter le supernatant par aspiration. Ajouter 75 microlitres de substrat ALP tamponné composé de PNPP disponible dans le commerce à chaque puits et utiliser une mise à jour pour enregistrer chaque point de temps en triplicate. Après chaque point de temps d’incubation, ajouter 75 microlitres de cinq hydroxyde de sodium molaire à chacun des trois puits pour arrêter la réaction.
Centrifuger la plaque pendant cinq minutes à 800 révolutions par minute. Utilisez une pipette pour transférer 100 microlitres de supernatant dans une nouvelle plaque de puits 96 pour la mesure calorimétrique. Utilisez un lecteur de plaques de puits de 96 puits pour mesurer l’absorption de chaque puits à 405 nanomètres.
Utilisez les puits de point de temps de 30 minutes pour contrôler le bruit de fond. Répétez l’expérience dans trois plaques de puits 96. Ce protocole développe un essai rapide et fiable pour mesurer l’activité d’ALP dans le biofilm de S.aureus qui ne nécessite pas l’isolement de protéine.
Le résultat représentatif de l’activité ALP montre une tendance accrue jusqu’à 75 minutes. Après 75 minutes, aucune augmentation de l’activité d’ALP n’a été observée. Il est très important d’établir une bonne culture biofilm et il peut prendre pas mal d’essais à maîtriser.
Vous pouvez confirmer la formation de biofilms en effectuant l’analyse de violette cristalline comme précédemment rapporté par nous et d’autres ou vous pouvez pré-traiter la plaque avec du plasma humain pour faciliter la formation de biofilms. Après son développement, vous pouvez dépister les inhibiteurs potentiels de l’ALP qui pourraient interférer avec la formation de biofilms. Le résultat fournira des informations importantes sur la gestion des biofilms dans le domaine médical.
Cinq hydroxyde de sodium molaire peuvent être dangereux en cas de contact. Assurez-vous de porter de l’équipement de protection individuelle lors de la manipulation.
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Aperçu
Ce manuscrit présente une méthode à haut débit pour quantifier l'activité de la phosphatase alcaline dans des cultures de biofilms de S. aureus en utilisant une plaque de culture tissulaire à 96 puits. La méthode est conçue pour être sensible et facile à réaliser, facilitant ainsi la recherche sur le rôle de la phosphatase alcaline dans la formation du biofilm.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Microbiologie
- Recherche sur les biofilms
- Enzymologie
Contexte
- La phosphatase alcaline (ALP) est une enzyme impliquée dans divers processus biologiques.
- Comprendre le rôle de l'ALP dans la formation des biofilms est essentiel pour les études en microbiologie.
- Les méthodes à haut débit sont indispensables pour une collecte efficace des données en recherche.
- Les biofilms sont des communautés complexes de micro-organismes pouvant avoir un impact sur la santé et l'industrie.
Objectif de l'étude
- Établir une méthode fiable pour mesurer l'activité de la phosphatase alcaline (ALP) dans les biofilms.
- Approfondir la compréhension de la fonction de l'ALP dans la formation des biofilms.
- Fournir un protocole facilement adoptable par les chercheurs.
Méthodes utilisées
- Préparation de TSB à l'aide de digest pancréatique de caséine, de digest papaïque de tourteau de soja, de chlorure de sodium, de dextrose et de phosphate dibasique de potassium.
- Utilisation d'une plaque de culture tissulaire à 96 puits pour une analyse à haut débit.
- Mesure de l'activité de la phosphatase alcaline dans des cultures de biofilm de S. aureus.
- Démonstration de la procédure par Kevin Danikowski, ancien étudiant du Harper College.
Résultats principaux
- La méthode quantifie avec succès l'activité de la phosphatase alcaline dans les cultures de biofilms.
- La grande sensibilité de la technique permet des mesures précises.
- Le protocole est simple et peut être facilement mis en œuvre dans divers laboratoires.
- Les connaissances acquises lors de cette étude peuvent orienter les futures recherches sur les biofilms.
Conclusions
- La méthode établie est efficace pour l'étude de la PAL dans les biofilms.
- Cette recherche contribue à la compréhension de la dynamique des biofilms.
- De futures études pourront s'appuyer sur ce protocole pour explorer d'autres aspects de la biologie des biofilms.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette méthode permet une quantification rapide et à haut débit de l'activité de la phosphatase alcaline dans le biofilm de S. aureus sans isolement protéique, soutenant ainsi la validation précoce de cibles dans la découverte d'agents antimicrobiens. En fournissant un signal sensible et reproductible de l'activité enzymatique extracellulaire, elle facilite l'élimination des risques mécanistiques liés aux hypothèses thérapeutiques associées aux biofilms. La compatibilité du test avec des formats de plaques de 96 puits permet une intégration fluide dans des cascades de criblage pour l'identification de composés leaders et l'acquisition d'une confiance prédictive.
Applications stratégiques en R-D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Étudie l'hypothèse thérapeutique selon laquelle la phosphatase alcaline contribue à la formation et à la persistance des biofilms.
- Valeur opérationnelle : Permet la validation fonctionnelle de cibles grâce à la mesure quantitative de l'activité enzymatique dans des systèmes de biofilm intacts.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des projets en associant la modulation de la PAL à des phénotypes d'inhibition du biofilm.
Développement de tests et criblage
- Prêt-à-l’emploi du test : Prépare un format standardisé et à haut débit pour évaluer les effets des composés sur des marqueurs enzymatiques extracellulaires.
- Production quantitative : Génère des mesures basées sur l'absorbance à 405 nm, permettant l'analyse de la relation dose-réponse et la confirmation des résultats positifs.
- Extensibilité : Utilise un format de plaque 96 puits pour soutenir le criblage à débit moyen de bibliothèques d'inhibiteurs.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Relie l'activité de la PAL à la formation du biofilm de S. aureus, un facteur de virulence clé dans les infections liées aux dispositifs médicaux et les infections chroniques.
- Continuité translationnelle : Fournit une lecture alignée sur un biomarqueur permettant de relier la découverte à l'évaluation préclinique de l'efficacité.
- Décisions ajustées au risque : Guide les critères de poursuite ou d'abandon selon l'engagement de la cible et l'impact phénotypique dans les modèles de biofilm.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Le test s'inscrit dans la phase précoce de la découverte, permettant la validation de la cible afin de guider l'identification de composés candidats et l'évaluation préclinique de stratégies anti-biofilm.
- Biologie du Développement : Soutient la vérification d'hypothèses en mesurant la PAL comme paramètre fonctionnel du métabolisme du biofilm.
- Criblage : Fournit des mesures quantitatives reproductibles, adaptées au criblage de bibliothèques de composés dans des plaques microtitration.
- Analytique : Permet des mesures cinétiques et à point final, autorisant la comparaison statistique entre conditions traitées et témoins.
- Recherche Translationnelle : S'inscrit dans le développement de biomarqueurs en associant l'activité enzymatique à la formation du biofilm et à d'éventuelles interventions thérapeutiques.
- Réutilisation en Environnement Professionnel : Met en place une plateforme réutilisable pour l'étude des enzymes extracellulaires dans les biofilms microbiens, applicable à plusieurs projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation de la cible en réduisant l'ambiguïté mécanistique entourant le rôle de la PAL dans le biofilm.
- Valeur opérationnelle : Assure une standardisation, une sensibilité et une reproductibilité grâce à une lecture colorimétrique simple.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en permettant le criblage rapide de modulateurs de la PAL associés clairement à des phénotypes liés au biofilm.
- Impact sur le portefeuille : Soutient les décisions d'avancement ajustées au risque en reliant la modulation de la cible à l'efficacité anti-biofilm.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite des connaissances de base en microbiologie pour la culture stérile de biofilms et la manipulation de S. aureus.
- Dépend de l'accès à un lecteur de plaques 96 puits capable de mesurer l'absorbance à 405 nm.
- Exige une standardisation des conditions de formation des biofilms entre les puits et les plaques afin d'obtenir des comparaisons fiables.
- Implique des ajustements d'optimisation lors de l'extension à d'autres espèces bactériennes ou à d'autres marqueurs extracellulaires.
- Comprend des limites pratiques, telles que la nécessité de contrôler l'absorbance du fond et de garantir une inhibition adéquate de la réaction par la soude (NaOH).
