Name: Analyse colorimétrique d’activité Phosphatase alcaline dans le Biofilm de S. aureus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 59 s
Description: Apprenez une méthode colorimétrique pour quantifier l'activité phosphatase alcaline dans les biofilms de S. aureus en haut débit. Cette technique sensible facilite l'étude de la formation des biofilms.

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Nous remercions William Rainey Harper College et l’Université de l’Illinois à Chicago pour l’installation de procéder à ces expériences. Nous remercions également McGraw Hill Foundation pour leur soutien généreux.

1. préparation moyenne
<ol><li>Préparer 1 L de bouillon de soja tryptique (BST) : dans 1 L d’eau distillée, ajouter 15 g de hydrolysât de caséine, 5 g de papaique de farine de soja, 3 g de chlorure de sodium, 2,5 g de dextrose et 2,5 g de phosphate dipotassique. Stériliser avant usage.</li>
	<li>Pour Trypticase Soy Agar (TSA), ajouter 15 g d’agar à 1 L de TSB, autoclave. Puis laissez-le refroidir à température ambiante. Ensuite, verser à un ratio de 20 mL par boîte de pétri (100 x 15 mm).</li>
	<li>Milieu de culture de biofilm : ajouter 10 g de glucose dans 1 L de BST autoclavé. Stériliser par filtration à l’aide d’un filtre de 0,2 µm.</li>
</ol>2. Formation de Biofilm de S. aureus dans la plaque de Culture tissulaire bien 96
Remarque : Le biofilm de S. aureus est cultivé comme décrit précédemment6,21.
<ol><li>Ensemencer une colonie individuelle S. aureus de TSA dans 10 mL de TSB et croître une nuit à 37 ° C.</li>
	<li>Diluer la culture au jour le jour dans 10 mL de TSB/glucose (10 g/L) à un ratio de 1 : 100 (v/v). Vortex doucement pour mélanger pendant une concentration uniforme.</li>
	<li>Transférer 200 mL de culture diluée dans un total de 18 puits (plus pour les groupes expérimentaux, un tel contrôle non-biofilm pour suggérer une relation avec l’activité de l’ALP6) d’une 96 plaque bien. Utiliser des triplés pour chaque point dans le temps : 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min et 75 min. Reportez-vous à l’étape 3.2.</li>
	<li>Incuber la plaque 96 puits à 37 ° C pendant 24 h pour la formation de biofilm6,21.</li>
	<li>Décanter le liquide surnageant par aspiration.</li>
	<li>Laver chaque bien avec 1 x solution tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4), centrifuger pendant 5 min à 15 000 x g et éliminer le surnageant par aspiration.</li>
</ol>3. mesure de l’activité ALP en Biofilm de S. aureus
Remarque : Activité de l’ALP a été mesurée comme décrit6,18.
<ol><li>Ajouter 75 mL de substrat tamponné de ALP consistant pNPP commercialement disponible dans chaque puits de l’étape 2.6 et commencer l’enregistrement de l’époque. Enregistrer chaque point dans le temps en trois exemplaires.</li>
	<li>Après incubation pendant un temps varié : 0 min (contrôle), 15 min, 30 min, 45 min, 60 min et 75 min respectivement, ajoutent 75 µL de 5 M de NaOH pour arrêter la réaction.</li>
	<li>Centrifuger la plaque pendant 5 min à 15 000 x g.</li>
	<li>Transférer 100 µL de liquide surnageant dans une nouvelle plaque 96 puits pour mesure colorimétrique.</li>
	<li>Mesurer l’absorbance de chaque bien à 405 nm en utilisant un 96 plaque bien lecteur. Utiliser le temps min 0 point puits à contrôler pour le bruit de fond 405 nm.</li>
	<li>Répétez l’expérience entière dans trois assiettes bien 96 individuelles.</li>
</ol>

<ol><li>Coleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+alkaline+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of alkaline phosphatase.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).</li>
<li>Sharma, U., Pal, D., Prasad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+Phosphatase%3A+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Alkaline Phosphatase: An Overview.</a> Indian Journal of Clinical Biochemistry. 29 (3), July-Sept 269-278 (2014).</li>
<li>Mitchell, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequencies+of+elevated+alkaline+phosphatase+activity+and+rickets+exist+in+extremely+low+birth+weight+infants+despite+current+nutritional+support%5BTitle%5D)+AND+%22Boston+Medical+Center+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">High frequencies of elevated alkaline phosphatase activity and rickets exist in extremely low birth weight infants despite current nutritional support.</a> Boston Medical Center Pediatrics. 9, 47(2009).</li>
<li>Fawley, J., Gourlay, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+alkaline+phosphatase%3A+A+summary+of+its+role+in+clinical+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Intestinal alkaline phosphatase: A summary of its role in clinical disease.</a> Journal of Surgical Research. 202 (1), 225-234 (2016).</li>
<li>Derman, A. I., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+Alkaline+Phosphatase+Localized+to+the+Cytoplasm+Slowly+Acquires+Enzymatic+Activity+in+Cells+Whose+Growth+Has+Been+Suspended%3A+a+Caution+for+Gene+Fusion+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli Alkaline Phosphatase Localized to the Cytoplasm Slowly Acquires Enzymatic Activity in Cells Whose Growth Has Been Suspended: a Caution for Gene Fusion Studies.</a> Journal of Bacteriology. 177 (13), 3764-3770 (1995).</li>
<li>Danikowski, K. M., Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+Phosphatase+Activity+of+Staphylococcus+aureus+grown+in+Biofilm+and+Suspension+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alkaline Phosphatase Activity of Staphylococcus aureus grown in Biofilm and Suspension Cultures.</a> Current Microbiology. 75, 1226-1230 (2018).</li>
<li>Okabayashi, K., Futai, M., Mizuno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+Acid+and+Alkaline+Phosphatases+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Localization of Acid and Alkaline Phosphatases in Staphylococcus aureus.</a> Japanese Journal of Microbiology. 18 (4), 287-294 (1974).</li>
<li>Cheng, K. J., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+Phosphatase+Activity+of+Rumen+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alkaline Phosphatase Activity of Rumen Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. , 586-590 (1997).</li>
<li>Berezhetskyy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase+conductometric+biosensor+for+heavy-metal+ions+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Innovation+and+Research+in+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Phosphatase conductometric biosensor for heavy-metal ions determination.</a> Innovation and Research in Biomedical Engineering. 29 (2-3), 136-140 (2008).</li>
<li>Park, E. J., Kang, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+bacterial+alkaline+phosphatase+assay+for+rapid+monitoring+of+bacterial+counts+on+spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">The use of bacterial alkaline phosphatase assay for rapid monitoring of bacterial counts on spinach.</a> Journal of Food Science. 73 (5), M236-M238 (2008).</li>
<li>Barber, M., Kuper, S. W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Staphylococcus+pyogenes+by+the+phosphatase+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology+and+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Identification of Staphylococcus pyogenes by the phosphatase reaction.</a> The Journal of Pathology and Bacteriology. 63, 65-68 (1951).</li>
<li>Wolf, P. L., Von der Muehll, E., Ludwick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+test+to+differentiate+Serratia+from+Enterobacter%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">A new test to differentiate Serratia from Enterobacter.</a> American Journal of Clinical Pathology. 56, 241-243 (1972).</li>
<li>Rangam, C. M., Katdare, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase+activity+of+Staphylococci+as+an+indication+of+their+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Phosphatase activity of Staphylococci as an indication of their pathogenicity.</a> Indian Journal of Medical Science. 8, 610-613 (1954).</li>
<li>Flemming, H. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+an+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).</li>
<li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 35, 322-332 (2010).</li>
<li>Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+antibiotic+resistance+of+Escherichia+coli+in+mature+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).</li>
<li>Witherow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ten-Week+Biochemistry+Lab+Project+Studying+Wild-Type+and+Mutant+Bacterial+Alkaline+Phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), Nov/Dec (2016).</li>
<li>Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+human+placental+alkaline+phosphatase+gene+in+transfected+cells%3A+Use+as+a+reporter+for+studies+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).</li>
<li>Horney, B. S., Farmer, A. J., Honor, D. J., MacKenzie, A., Burton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+of+alkaline+phosphatase+isoenzymes+in+the+serum+of+hyperthyroid+cats%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of hyperthyroid cats.</a> Veterinary Clinical Pathology. 23 (3), 98-102 (1994).</li>
<li>Farley, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Skeletal+Alkaline+Phosphatase+in+Osteoporotic+Serum+by+Wheat+Germ+Agglutinin+Precipitation%2C+Heat+Inactivation%2C+and+a+Two-Site+Immunoradiometric+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay.</a> Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).</li>
<li>O’Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experience%22%5BJournal%5D)">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> Journal of Visualized Experience. , (2011).</li>
<li>Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Characterization+of+Extracellular+Alkaline+Phosphatase+from+an+Alkalophilic+Bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+and+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans notre test, nous avons utilisé des pNPP comme le substrat de l’ALP. Il s’agit d’une solution de travail conçue pour ELISA et aucune dilution n’est nécessaire. Après hydrolyse par ALP, un produit jaune se développe et peut être mesuré à 405 nm. À la fin de la réaction enzymatique, nous avons brièvement centrifugé la plaque 96 puits et transféré le surnageant sur une plaque bien 96 fraîches pour mesurer l’absorbance à l’aide du lecteur de plaques. Nous avons constaté que cette étape supplémentaire de centrifugation es...

Phosphatase alcaline (ALP) est partout exprimée dans les deux cellules procaryotes et eucaryotes1. Il peut catalyser l’hydrolyse de monophosphate de différentes molécules telles que les nucléotides, les protéines, les alcaloïdes, les esters de phosphate et anhydrides d’acide phosphorique. Chez l’homme, ALP eucaryote est présent dans de nombreux tissus, y compris le foie, les os, les intestins et placenta2. Il joue un rôle important dans la phosphorylation des protéines, la croissance cellulaire, l’apoptose, cellules souches processus ainsi que la minéralisation squelettique normale. ALP eucaryote est également un indicateur clé de sérum pour la présence de maladies dans les os, le foie et autres tissus/organes lorsque élevé3,4.
Procaryote ALP a été détectée dans une variété de cellules bactériennes, y compris e. coli5,6,de S. aureus7 et certaines bactéries du rumen commune dans les sols8. L’activité bactérienne ALP a été utilisée comme un biocapteur dans la détection des pesticides, métaux lourds,9 et10de la contamination bactérienne. L’expression constitutive de l’ALP a été utilisée pour identifier des staphylocoques11 et pour différencier Serratia Enterobacter12. Il est également suggéré que constitutive production ALP est corrélée à la pathogénicité à staphylocoques13. Bien que l’ALP a été étudiée dans différents contextes3,4, encore peu est inédite pour son activité et sa fonction dans les cultures de biofilms.
Un biofilm a été documenté pour avoir une vie bactérienne fonctionne différemment par rapport à son homologue de cellule bactérienne libres14. Chez S. aureus, la formation de biofilm a été identifiée dans une variété de conditions cliniques et représente la résistance aux antibiotique et l’inflammation chronique15,16. De nombreuses molécules avaient été signalés dans une matrice de biofilm tels que les polysaccharides, protéines, acides nucléiques et les lipides, mais le mécanisme de formation de biofilm n’est pas entièrement compris14. Pour comprendre le rôle de l’ALP dans la formation de biofilm, nous cultivées biofilms de Staphylococcus aureus dans les plaques de 96 puits de culture tissulaire et mesuré l’activité ALP à l’aide de para-nitrophénylphosphate (pNPP).
La molécule pNPP est un substrat prêt à l’emploi pour ALP et a été largement utilisé pour mesurer l’activité ALP6,17,18. Ce dosage colorimétrique est basé sur la conversion de para-nitrophényl phosphate (pNPP) en para-nitrophénol aboutissant à un produit coloré à 405 nm. Par rapport aux autre essai ALP classique, tels que l’agarose gel électrophorèse19, précipitations agglutinine (WGA) de germe de blé, et WGA-HPLC20, ce test est très spécifique, sensible, facile à reproduire et la plupart important, permet pour la grande débit.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>VWR</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Eppendorf</td><td>Thomas Scientific</td><td>5810</td><td></td></tr><tr><td>Gluose</td><td>VWR</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Pastilles de NaOH</td><td>VWR</td><td>SS0550-500GR</td><td></td></tr><tr><td>Para-nitrophénylphosphate (pNPP)&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>P7998-100ML</td><td>Les concentrations typiques des substrats liquides pNPP, souvent utilisés dans les tests immuno-enzymatiques (ELISA), varient entre 10 et 50 mM. À l’instar de la plupart des substrats liquides pNPP prêts à l’emploi comme celui utilisé ici, la concentration exacte de pNPP n’est pas divulguée en raison de sa nature exclusive.</td></tr><tr><td>10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P3288-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>Biotek</td><td>ELx808</td><td></td></tr><tr><td>S. aureus</td><td>ATCC</td><td>ATCC25923</td><td></td></tr><tr><td>Gélose tryptique de soja&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 15 g/L TSB</td><td>VWR</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Bouillon de soja tryptique :&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; g/L digestion pancréatique de la caséine............ 15.0 Digeste papaïque du tourteau de soja......... 5.00 Chlorure de sodium.............................. 3.00 Dextrose........................................ &nbsp ; 2,50 Phosphate dipotassique.................. 2.50</td><td>VWR</td><td>90006-098</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire à 96 puits</td><td>BD</td><td>6902D09</td><td>Fond en forme de U</td></tr></tbody></table>

analyse colorimétrique d’activité phosphatase alcaline dans le biofilm de s. aureus

Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm

Phosphatase alcaline (ALP) est une enzyme commune exprimée dans les cellules procaryotes et eucaryotes. Elle catalyse l’hydrolyse des monoesters de phosphate de nombreuses molécules à pH basique et joue un rôle indispensable dans le métabolisme du phosphate. Chez l’homme, ALP eucaryote est l’un des signaux enzymatiques le plus souvent utilisés dans le diagnostic des maladies diverses, telles que la cholestase et le rachitisme. Dans S. aureus, ALP est détectée exclusivement sur la membrane cellulaire ; Elle est également exprimée en une forme sécrétoire ainsi. Pourtant, on connaît mal son rôle dans la formation de biofilm.
Le but de ce manuscrit est de développer un test rapide et fiable pour mesurer l’activité ALP en biofilm de S. aureus ne nécessitant pas l’isolement de la protéine. À l’aide de p-nitrophényl phosphate (pNPP) comme substrat, nous avons mesuré l’activité ALP dans S. aureus biofilm formé en plaques 96 puits vitroplants. L’activité était basée sur la formation du produit soluble réaction mesurée par 405 absorbance nm. La nature à haut rendement de la méthode de plaque 96 puits vitroplants fournit une méthode sensible et reproductible pour les tests d’activité ALP. Les mêmes expérimental mis en place peuvent être étendus pour mesurer les autres extracellulaires marqueurs moléculaires associés à la formation de biofilm.

Figure 1 montre un résultat représentatif de l’activité ALP de biofilm cultures de S. aureus en plaques de 96 puits de culture tissulaire. 75 μl de solution de pNPP disponibles dans le commerce a été ajouté à chaque puits et incubé à température ambiante. Après une incubation de différentes époques (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min et 75 min, respectivement) 75 μL de 5 M NaOH a été ajouté pour arrêter la réaction. Le produit a été ensuite mesuré...

Dans ce manuscrit, nous avons mis en place une méthode de haut débit afin de quantifier l’activité de la phosphatase alcaline dans la culture de biofilm de S. aureus de plaque 96 puits vitroplants

Analyse colorimétrique d’activité Phosphatase alcaline dans le Biofilm de S. aureus

Alkaline phosphatase (ALP) is a common enzyme expressed in both prokaryotic and eukaryotic cells. It catalyzes the hydrolysis of phosphate monoesters from ...

Ce protocole a présenté une méthode facile et fiable pour mesurer l’activité alcalinisée de phosphatase dans la culture de biofilm de S.aureus. Il nous aidera à comprendre la fonction d’ALP dans la formation de biofilms. Le principal avantage de cette technique est le débit élevé.Il est très sensible et facile à exécuter. Kevin Danikowski, un ancien élève du Harper College, démontrera la procédure. Pour préparer le BST, ajouter le digest pancréatique de la caséine, la digestion papaique de la farine de soja, le chlorure de sodium, le dextrose et le phosphate de dipotassium dans l’eau distillée.Couvrir le flacon de papier d’aluminium et le mettre dans un autoclave pour stériliser avant utilisation. Pour préparer une TSA, ajouter une agar au BST et la mettre dans l’autoclave pour la stérilisation. Ensuite, laissez-le refroidir à température ambiante.Ensuite, versez-le dans la boîte de Pétri à un rapport de 20 millilitres par plat. Pour préparer un milieu de culture biofilm, ajouter du glucose au BST autoclavé pour atteindre la concentration de 10 grammes par litre. À l’aide d’un kit de filtration sous vide, filtrer la solution à l’aide d’un filtre de la taille d’un pore de 0,2 micromètre.Pour inoculer, utilisez une boucle d’inoculation stérilisée pour choisir une colonie individuelle de Staphylocoque dans la boîte de Pétri et la placer dans le tube de culture rempli de 10 millilitres de BST. Mettez le tube dans l’incubateur pour croître pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Avec une micropipette, dessiner 100 microlitres de la culture du jour au lendemain et le transférer dans un tube de culture rempli de 10 millilitres de BST avec du glucose pour une dilution de ratio de volume de 1:100.Vortex doucement pour mélanger pour une concentration constante. Utilisez une micropipette pour transférer 200 microlitres de culture diluée dans un total de 18 puits à partir d’une plaque de puits de 96. Incuber la plaque de puits 96 à 37 degrés Celsius pendant 24 heures pour la formation de biofilms.Pour la meilleure formation de biofilm de S.aureus, il est préférable de choisir une plaque de puits à fond plat ou rond 96. Après cela, inclinez légèrement la plaque pour décanter le surnatant par aspiration du bord de chaque puits. Lavez-les bien avec 1X PBS.Mettez la plaque dans la centrifugeuse pour tourner pendant cinq minutes à 8000 tours par minute et décanter le supernatant par aspiration. Ajouter 75 microlitres de substrat ALP tamponné composé de PNPP disponible dans le commerce à chaque puits et utiliser une mise à jour pour enregistrer chaque point de temps en triplicate. Après chaque point de temps d’incubation, ajouter 75 microlitres de cinq hydroxyde de sodium molaire à chacun des trois puits pour arrêter la réaction.Centrifuger la plaque pendant cinq minutes à 800 révolutions par minute. Utilisez une pipette pour transférer 100 microlitres de supernatant dans une nouvelle plaque de puits 96 pour la mesure calorimétrique. Utilisez un lecteur de plaques de puits de 96 puits pour mesurer l’absorption de chaque puits à 405 nanomètres.Utilisez les puits de point de temps de 30 minutes pour contrôler le bruit de fond. Répétez l’expérience dans trois plaques de puits 96. Ce protocole développe un essai rapide et fiable pour mesurer l’activité d’ALP dans le biofilm de S.aureus qui ne nécessite pas l’isolement de protéine.Le résultat représentatif de l’activité ALP montre une tendance accrue jusqu’à 75 minutes. Après 75 minutes, aucune augmentation de l’activité d’ALP n’a été observée. Il est très important d’établir une bonne culture biofilm et il peut prendre pas mal d’essais à maîtriser.Vous pouvez confirmer la formation de biofilms en effectuant l’analyse de violette cristalline comme précédemment rapporté par nous et d’autres ou vous pouvez pré-traiter la plaque avec du plasma humain pour faciliter la formation de biofilms. Après son développement, vous pouvez dépister les inhibiteurs potentiels de l’ALP qui pourraient interférer avec la formation de biofilms. Le résultat fournira des informations importantes sur la gestion des biofilms dans le domaine médical.Cinq hydroxyde de sodium molaire peuvent être dangereux en cas de contact. Assurez-vous de porter de l’équipement de protection individuelle lors de la manipulation.

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Les biofilms formés sur les surfaces dentaires sont très complexes et constamment exposés à innée et exogènes aux défis environnementaux, qui modulent leur architecture, la physiologie et du transcriptome. Nous avons développé une boîte à outils pour examiner la composition, l'organisation structurelle et l'expression des gènes des biofilms buccaux, qui peut être adapté à d'autres domaines de la recherche biofilm.

Une analyse boîte à outils de l&#39;évaluation biochimique, structurel et transcriptomique globale des biofilms buccaux médiée par Streptococcus mutans

Source : Vidilaseris, K., et al. Dépistage des inhibiteurs de la pyrophosphatase liés à la membrane de Thermotoga maritima . J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo présente un test colorimétrique pour dépister les inhibiteurs de la pyrophosphatase liée à la membrane bactérienne (mPPase) en quantifiant la libération d’orthophosphate. La méthode permet d’identifier des composés qui inhibent la mPPase de Thermotoga maritima, une cible potentielle de médicament antimicrobien.

Inhibiteurs de criblage de la pyrophosphatase liée à la membrane bactérienne à l’aide d’un dosage colorimétrique 

Source : Tay, S. B., et al. Perturbation antivirulente des biofilms pathogènes utilisant des lactonases modifiées pour l’extinction du quorum.  J. Vis. Exp. (2016)La vidéo démontre une méthode pour quantifier la biomasse de biofilm dans une bactérie pathogène, en comparant des témoins non traités à des échantillons traités avec une enzyme quorum-quenching. L’enzyme perturbe la signalisation bactérienne lors de l’incubation précoce, réduisant l’adhésion cellulaire. Après lavage et incubation...

Quantification de la suppression du biofilm induite par les enzymes chez les bactéries pathogènes

Cette vidéo présente un test in vitro pour étudier l’interaction neutrophile-biofilm. Les bactéries pathogènes intégrées dans le biofilm et les neutrophiles isolés ont été marqués à l’aide de marqueurs fluorescents, et la réponse immunitaire des neutrophiles et l’évasion de la réponse immunitaire par les bactéries ont été évaluées à l’aide d’un microscope à fluorescence.

Un essai in vitro pour étudier l’interaction entre les neutrophiles et le biofilm

Contrairement à celle observée pour les eucaryotes, il ya un manque d'études qui dépolarisation de la membrane de détail et de la concentration d'ions changements dans les bactéries, principalement que leur petite taille rend les méthodes conventionnelles de mesure difficile. Ici, nous avons des protocoles détaillés pour le suivi de ces événements dans le Gram-positif important agent pathogène Streptococcus pneumoniae en utilisant des techniques de fluorescence.

La surveillance des changements dans la membrane de polarité, Membrane intégrité, et intracellulaires d&#39;ions concentrations dans<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Utilisation des colorants fluorescents

Ici, nous présentons des protocoles pour cribler et caractériser rapidement l’activité antimicrobienne des enzymes. Le test de diffusion sur microlames et le test de libération de colorant utilisent des substrats bactériens cibles pour l’évaluation qualitative et quantitative de l’activité enzymatique.

Les analyses qualitatives et quantitatives pour la détection et la caractérisation des antimicrobiens en protéines

La plupart des infections bactériennes produisent un biofilm. En raison de leur environnement, les bactéries associées au biofilm sont souvent phénotypiquement résistantes aux médicaments. Les nouvelles molécules antibactériennes qui tuent les bactéries dans les biofilms sont donc une priorité élevée. Nous établissons un test pour dépister rapidement les composés antimicrobiens efficaces pour éradiquer les biofilms.

Ciblage biofilm Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Utilisation de résazurine Basé Essai de sensibilité aux médicaments

Ce manuscrit décrit un protocole afin d’étudier l’effet antimicrobien de la thérapie photodynamique induite par l’acide 5-aminolévulinique (ALA-PDT) sur un biofilm de Staphylococcus aureus . Ce protocole peut être utilisé pour développer un modèle in vitro afin d’étudier le traitement des biofilms bactériens par PDT à l’avenir.

Un modèle In Vitro pour étudier l’effet de la thérapie photodynamique véhiculée par 5-Acide aminolévulinique sur Staphylococcus aureus Biofilm

Le protocole décrit la culture de biofilms inter-royaume s'composés de Candida albicans et Streptococcus mutans et présente une méthode confocale basée sur la microscopie pour la surveillance du pH extracellulaire à l'intérieur de ces biofilms.

Surveillance du pH extracellulaire dans les biofilms Cross-Kingdom à l'aide de la microscopie confocale

Cet article fournit une méthodologie détaillée pour la mesure des isolévuglandines dans les tissus par immunofluorescence à l’aide d’anticorps ScFv D11 conjugués à la phosphatase alcaline. Des modèles d’hypertension chez la souris et l’homme sont utilisés pour expliquer les procédures étape par étape et les principes fondamentaux associés à la mesure de l’isolévuglandine dans des échantillons de tissus.

Détection directe des isolévuglandines dans les tissus à l’aide d’une protéine de fusion phosphatase alcaline D11 scFv et d’une immunofluorescence

Le présent protocole décrit l’étude des interactions neutrophiles-biofilm. Les biofilms de Staphylococcus aureus sont établis in vitro et incubés avec des neutrophiles humains dérivés du sang périphérique. La réponse oxydative des neutrophiles est quantifiée et la localisation des neutrophiles dans le biofilm est déterminée par microscopie.

Essais in vitro standardisés pour visualiser et quantifier les interactions entre les neutrophiles humains et les biofilms de Staphylococcus aureus

Apprenez une méthode colorimétrique pour quantifier l'activité phosphatase alcaline dans les biofilms de S. aureus en haut débit. Cette technique sensible facilite l'étude de la formation des biofilms.

Analyse colorimétrique d’activité Phosphatase alcaline dans le Biofilm de S. aureus

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