Name: Croissance et caractérisation des organoïdes irradiés des glandes mammaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Découvrez comment analyser le recrutement des cellules tumorales par irradiation d'organoides mammaires murins. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de récidive du cancer du sein triple négatif.

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Nous remercions le Dr Laura L. BRONSART d’avoir fourni des macrophages bruts 264,7 de GFP et de dTomato. Cette recherche a été financée financièrement par la subvention NIH #R00CA201304.

Des études sur les animaux ont été réalisées conformément aux directives et protocoles institutionnels approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Vanderbilt.
1. préparation des souris et acquisition de cellules (adapté de Nguyen-Ngoc et al.11)
<ol><li>Sacrifiez des souris nu/nu athymiques (8-10 semaines) en utilisant l’asphyxie du CO2 suivie d’une dislocation cervicale. Nettoyez la peau à l’aide de 70% d’éthanol.</li>
	<li>Resect glandes mammaires abdominales et inguinaux de souris à l’aide de ciseaux pré-stérilisés et forceps. Enlevez les ganglions lymphatiques avant la résection. Rincer dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) (figure 1a).</li>
	<li>Placez-le dans des tubes de 15 mL avec 10 mL de mélange de milieux/nutriments de Dulbecco modifié Eagle F12 (DMEM/F12) pour le transport. Les échantillons peuvent être conservés pendant la nuit à 4 ° c ou traités immédiatement. Continuez sur la glace.</li>
	<li>Irradier des échantillons à 20 Gy à l’aide d’une source de césium (figure 1b).</li>
	<li>45 min après irradiation, placer les glandes mammaires dans une plaque de cellule stérile de 35 mm et émincer avec des scalpels (figure 1c, D). Hacher avec environ 40 coups jusqu’à ce que le tissu se détend et que les morceaux soient obtenus qui ne sont pas plus grands que approximativement 1 mm2 dans la zone.</li>
	<li>Transférer à la solution de collagénase dans un tube de centrifugation de 50 mL. La solution de collagénase se compose de 2 mg/ml de collagénase (voir tableau des matériaux), de 2 mg/ml de trypsine, de 5% v/v de sérum bovin fœtal (FBS), de 5 μg/ml d’insuline et de 50 μg/ml de gentamicine dans les milieux DMEM/F12. Utilisez une solution de collagénase de 10 mL par souris.</li>
	<li>Placer dans un bain d’eau à 37 ° c, Vortex toutes les 10 min pour 30-60 min. la digestion est complète lorsque la solution de collagénase est trouble (figure 1e, F).</li>
	<li>Faire tourner la solution digéré à 450 x g pendant 10 min à température ambiante (RT). Trois couches seront observées. Le surnageant est composé de graisse, la couche intermédiaire est une solution aqueuse, et le fond est un culot. Le culot apparaîtra en rouge car il s’agit d’un mélange de cellules épithéliales, de cellules stromales individuelles et de globules rouges (figure 1g).</li>
	<li>Préenduire toutes les pipettes, pointes de pipette et tubes à centrifuger avec une solution d’albumine sérique bovine (BSA) avant le contact. La solution BSA se compose de 2,5 w/v% de BSA dans le sérum physiologique tamponné au phosphate de Dulbecco (DPBS). Pour le pré-enrobage, il suffit d’ajouter puis de retirer la solution BSA à l’intérieur de la pointe de la pipette et des tubes. La solution BSA peut être réutilisée, bien qu’elle doive être filtrée stérile avant chaque expérience.</li>
	<li>Pour une récupération supplémentaire, transférer le surnageant dans un tube de 15 mL frais recouvert de BSA. Pipetter de haut en bas vigoureusement pour disperser la couche grasse. Centrifugez à 450 x g pendant 10 min à la RT. aspirate le surnageant, laissant une petite quantité de médias dans le tube pour éviter d’aspirer le culot de la cellule.</li>
	<li>Aspirer la couche aqueuse du tube avec le culot d’origine.</li>
	<li>Ajouter 10 mL de DMEM/F12 au tube avec le culot d’origine et le transférer dans le deuxième tube. Pipetter vigoureusement pour combiner et Resuspendre les deux pastilles.</li>
	<li>Centrifuger à 450 x g pendant 10 min à RT. aspirer le surnageant et ajouter 4 ml de DMEM/F12 au tube.</li>
	<li>Ajouter 40 μL de désoxyribonucléase (DNase) à la suspension et agiter doucement à la main pendant 2-5 min à la solution RT. DNase se compose de 4 U/mL de DNase dans le DMEM/F12.</li>
	<li>Ajouter 6 mL de DMEM/F12 et Pipetter soigneusement. Centrifuger le tube à 450 x g pendant 10 min à RT.</li>
	<li>Aspirate surnageant à la marque de 0,5 mL. Résuspendez dans 10 mL de DMEM/F12 et Pipettez soigneusement.</li>
	<li>Impulsion à 450 x g et arrêt 4 s après avoir atteint cette vitesse.</li>
	<li>Répétez les étapes 1.16-1.17 trois fois de plus pour purifier les organoïdes par différenciation centrifuge. Le culot doit maintenant être une couleur blanc cassé composée uniquement d’organoïdes épithéliaux (figure 1H). Remarque: les organoïdes peuvent également être filtrés à l’aide de filtres à mailles stériles 40 μm. Après l’étape 1,16, les milieux de pipette contenant des organoïdes dans un filtre dans un tube de centrifugation, puis rincer avec 5 à 10 mL de support DMEM/F12. Retournez le filtre sur un nouveau tube à centrifuger de 50 mL. Passez 10 mL de média DMEM/F12 à travers, en allant dans le sens inverse pour rincer tout retentate. Le rétentat doit consister en organoïdes, et le filtrat doit se composer principalement de cellules stromales, qui peuvent être jetées ou conservées si désiré.</li>
</ol>2. détermination des organoïdes de densité et de placage
<ol><li>Resuspendre le pellet dans 10 mL de DMEM/F12. Pipetter soigneusement pour créer une solution homogène.</li>
	<li>Transférer 50 μL dans une boîte de Petri de 30 mm et voir sous un microscope à contraste de phase à 20x. Comptez le nombre d’organoïdes avec un compteur de décompte. Remarque: ici, les pointes de pipette ont été systématiquement utilisées avec un diamètre minimal de 457 μm, soit 5-10 fois le diamètre des organoïdes qui sont ensemencés. Pour le transfert de volumes de 2 mL ou plus (par exemple, les étapes 1,16 et 2,1), utiliser des Pipettes sérologiques dont le diamètre de pointe est supérieur à 1 500 μm.</li>
	<li>Calculez la densité organoïde à l’aide de l’équation suivante: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59293/59293eq1.jpg"> La densité souhaitée est de 1 000 organoïdes/mL pour simplifier la dilution. Si la densité est trop faible, centrifuger à 450 x g pendant 5 min et aspirer les médias. Ajouter le support nécessaire pour atteindre 1 000 organoïdes/mL, et Pipetter à fond pour créer un mélange homogène.<ol>
<li>Pour cultiver des organoïdes dans une matrice protéique, les organoïdes de semence à une concentration de 1 organoïde/L dans le collagène de type 1 dilué à 87% ou dans la membrane de sous-sol extraite du sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm. Tout en travaillant avec des échantillons, garder sur la glace.</li>
		<li>Pour geler les organoïdes, transférer le volume désiré à un tube de centrifugation distinct. Tourner vers le bas à 450 x g pendant 5 min. aspirer les médias, puis ajouter le même volume de 90% FBS/10% de DMSO. Résuspendez les organoïdes, puis aliquote dans les CryoTubes. Transférer à-80 ° c, puis à l’azote liquide dans une semaine.</li>
		<li>Pour décongeler, réchauffer dans un bain d’eau 37 ° c pendant une minute. Centrifuger à 450 x g pendant 5 min, puis aspirer les fluides de congélation. Rincer avec le DPBS stérile, puis centrifuger à nouveau. Aspirate DPBS et ajouter des médias organoïdes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pipetter 50 μL (50 organoïdes) dans chaque puits de la plaque à faible adhérence (figure 1I).</li>
	<li>Ajouter 150 μL de milieux organoïdes pour ramener le volume de travail total à 200 μL. les milieux organoïdes se composent de 1% de pénicilline-streptomycine et de 1% d’insuline-transferrine-sélénium (ITS) dans les milieux DMEM/F12.</li>
	<li>Tous les 2 jours, remplacez les médias avec précaution. Remarque: les plaques à faible adhérence ne sont pas traitées à la culture tissulaire; par conséquent, les cellules peuvent être facilement détachées. Aspirer les médias lentement en inclinant la plaque et en insérant l’embout de la pipette au bord de chaque puits. Laissez une petite quantité de médias dans le fond du puits. Ajouter un nouveau support lentement pour éviter d’appliquer des forces de cisaillement inutiles aux organoïdes.</li>
</ol>3. co-culturing avec les macrophages
<ol><li>Maintenir les macrophages bruts 264,7 marqués GFP ou dTomato dans les milieux DMEM additionnés de 10% de FBS et de 1% de pénicilline-streptomycine. Graine 1 x 104,5 x 104ou 1 x 105 cellules/ml dans un support organoïde.</li>
	<li>Utilisez le contraste de phase des cellules vivantes et l’imagerie fluorescente pour surveiller l’infiltration des macrophages au fil du temps.</li>
</ol>4. coloration immunofluorescence des organoïdes
Remarque: les organoïdes peuvent être colorés dans des puits à faible adhérence ou peuvent être transférés sur des lames de chambre. Pour transférer, Pipetter doucement vers le haut et vers le bas jusqu’à ce que les organoïdes se détachent des plaques. Transférer aux lames de chambre et incuber pendant 4-8 h pour permettre aux organoïdes d’adhérer à la surface de la plaque.
<ol><li>Retirer le milieu organoïde des puits en aspirant soigneusement. Fixer les échantillons avec 10% de formol tamponné neutre pendant 15 min à RT.</li>
	<li>Laver 3x 5 min en 1x PBS. Si désiré, des échantillons fixes peuvent être stockés à 4 ° c pendant une semaine pour une coloration ultérieure.</li>
	<li>Perméabilize avec 0,1% 4-(1, 1, 3, 3-tétraméthylbutyl) phényl-polyéthylène glycol pendant 5 min. NOTE: pour colorer l’actine F, incuber des échantillons avec de la phalloïdine diluée 1:1000 et 1,67 nM de colorant nucléaire de bisbenzimide dans 1% de PBS/BSA pendant 1 h à RT. Ensuite, passez à l’étape 4,8.</li>
	<li>Bermeabilize avec 0.5 PBS. Les échantillons peuvent être stockés sur des images 4opy et des images immunofluorescentes. les mécanismes qui contribuent à la rlock CTC avec 5% de sérum de chèvre normal dans 0,1% de PBS/polyéthylène glycol monolaurate de sorbitan (PBST) pendant 1 h à RT. laver 3x 5 min avec PBS.</li>
	<li>Incuber avec de l’anti-cytokératine 14 dilué 1:1000, E-cadherin dilué 1:200, ou protéine de jonction serrée One dilué 1:100 dans 1% NGS en PBST pendant 1 h à RT. laver 3x 5 min en PBST.</li>
	<li>Incuber avec goat anti-rabbit secondaire dilué 1:200 avec 1% NGS/PBST pendant 1 h à RT. recouvrir d’une feuille d’aluminium pour éviter toute exposition à la lumière.</li>
	<li>Laver 3x 5 min en PBS. Utiliser le colorant nucléaire (voir tableau des matériaux) pour colorer les noyaux.</li>
	<li>Laver 3x 5 min en PBS. Si vous utilisez une glissière de chambre, montez avec une lèvre. Conserver enveloppé dans une feuille d’aluminium à 4 ° c pendant 2 semaines.</li>
</ol>

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<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+M1%2FM2+ratio+of+tumor-associated+macrophages+is+associated+with+extended+survival+in+ovarian+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ovarian+Research%22%5BJournal%5D)">A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients.</a> Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).</li>
<li>Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+M1+form+of+tumor-associated+macrophages+in+non-small+cell+lung+cancer+is+positively+associated+with+survival+time%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Cancer%22%5BJournal%5D)">The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time.</a> BioMed Central Cancer. 10, 112(2010).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans ce protocole, nous avons développé une méthode pour la croissance reproductible et la caractérisation des organoïdes des mammaires irradiés (figure 1). Une dose d’irradiation de 20 GY a été appliquée pour refléter les précédents modèles in vivo de recrutement de cellules tumorales5. L’irradiation des glandes mammaires ex vivo avant la formation organoïde a permis l’isolement des effets de dommages de rayonnement sans infiltration correspondante des cellules immun...

Environ 60% des patients atteints de cancer du sein à triple négatif (TNBC) choisissent une thérapie de conservation du sein (BCT) comme forme de traitement1. Dans cette modalité de traitement, la tumeur contenant une partie du tissu mammaire est enlevée, et le tissu normal environnant est exposé aux rayonnements ionisants pour tuer les cellules tumorales résiduelles. Le traitement réduit la récurrence dans une grande partie de la population de cancer du sein; Cependant, environ 13,5% des patients traités par TNBC éprouvent des récidives locorégionales2. Par conséquent, étudier comment le rayonnement peut recruter des cellules tumorales circulantes (CTCS) mènera à des aperçus importants sur la récurrence locale3,4.
Des travaux antérieurs ont montré que le rayonnement du tissu normal augmente le recrutement de divers types de cellules5. Dans les modèles précliniques de TNBC, l’irradiation du tissu normal augmentait le macrophages et subséquemment le recrutement des cellules tumorales dans les tissus normaux5. Le statut immunitaire a influencé le recrutement des cellules tumorales sur les sites irradiés, avec la migration des cellules tumorales observée chez les sujets immunodéprimés. La récapitulation de ces interactions à l’aide d’organoïdes dérivés de glandes mammaires permettra l’observation de la migration cellulaire et des interactions cellules-stromales en temps réel avec la microscopie et l’imagerie cellulaire en direct afin de déterminer le rôle des dommages causés par les radiations lors de l’altération comportement des cellules tumorales.
Souris mammaires organoïdes ont contribué à élucider les étapes clés dans le développement de la glande mammaire. Un organoïde mammaire est une construction multicellulaire en trois dimensions de l’épithélium mammaire isolé qui est plus grand que 50 μM6,7,8,9,10. À l’aide d’organoïdes épithéliaux primaires, Simian et coll. ont évalué les facteurs nécessaires à la ramification dans la glande mammaire7. Shamir et coll. ont découvert que la dissémination peut se produire sans transition épithéliale à médéchymateuses, ce qui donne un aperçu de la cascade métastatique8. Les méthodes de production et de caractérisation des organoïdes du tissu de la glande mammaire sont bien établies6,11,12,13. Cependant, à notre connaissance, les méthodes de croissance des organoïdes irradiés des glandes mammaires n’ont pas été rapportées. Un protocole pour la culture et la caractérisation des organoïdes irradiés serait une étape cruciale dans la récapitulation du recrutement immunitaire et des cellules tumorales induite par le rayonnement.
Dans cet article, nous rapmettons une méthode pour cultiver et caractériser les organoïdes épithéliaux mammaires irradiés dans des microplaques à faible adhérence recouvertes d’un polymère hydrophile qui soutient la formation de sphéroïïdes. Ces organoïdes ont été co-cultivés avec des macrophages pour examiner la cinétique d’infiltration des cellules immunitaires. Ce travail peut être étendu pour inclure les organoïdes de co-culturing avec les cellules adipeuses pour récapituler les caractéristiques mammaires, les cellules cancéreuses du sein pour visualiser le recrutement de cellules tumorales, et les cellules de T + + T pour étudier les interactions de cellules de tumeur-immunes. Des protocoles préalablement établis peuvent être utilisés pour évaluer les organoïdes irradiés. Les modèles antérieurs co-culturant les organoïdes mammaires et les cellules immunitaires ont mis en lumière les mécanismes de métastase et de dissémination. DeNardo et coll. ont constaté que la régulation des lymphocytes T CD4 + des macrophages associés aux tumeurs a amélioré le phénotype métastatique des adénocarcinomes mammaires14. Des modèles de co-culture ont également été utilisés pour élucider les mécanismes de développement biologique. Plaks et coll. ont clarifié le rôle des lymphocytes T CD4 + comme régulateurs de bas de l’organogenèse mammaire15. Cependant, notre groupe est le premier à établir une procédure de visualisation de la façon dont l’irradiation tissulaire normale influe sur le comportement des cellules immunitaires. Parce que l’irradiation normale des tissus a été montré pour améliorer le recrutement de cellules tumorales5, ce protocole peut être développé pour analyser comment le comportement des cellules tumorales est altéré par l’irradiation des tissus normaux et des cellules, conduisant à une meilleure compréhension de récidive du cancer.

<table><tbody><tr><td>10 % Neutre Buffered Formalin</td><td>VWR</td><td>16004-128</td><td></td></tr><tr><td>Anti-cytokératine 14</td><td>abcam</td><td>AB181595</td><td>Lot : GR3200524-3</td></tr><tr><td>Bovin Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A1933-25G</td><td></td></tr><tr><td>Collagène de type I</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de Clostridium histolyticum, Type VIII</td><td>Sigma</td><td>C2139</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase I</td><td>Gibco</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermofisher</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Fisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>E-Cadhérine</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>24E10</td><td>Lot : 13</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Gibco</td><td>15750</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-lapin secondaire</td><td>abcam</td><td>AB150077</td><td>vert Lot : GR3203000-1</td></tr><tr><td>Chèvre anti-lapin secondaire</td><td>abcam</td><td>ab150080</td><td>rouge Lot : GR3192711-1</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Fisher</td><td>62249</td><td>Lot : TG2611041</td></tr><tr><td>Insuline (10 mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Insuline-Transferrin-Selenium, 100x</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Membrane basale (membrane basale extraite du sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm)</td><td>Corning</td><td>356237</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat</td><td>Serum Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Nuclon Sphera 96 plaques</td><td>de puits Thermo</td><td>174927</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>10128-856</td><td></td></tr><tr><td>Pen/streptocoque</td><td>Fisher</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>Phalloidin</td><td></td><td>abcam ab176757</td><td>Lot : GR3214582-16</td></tr><tr><td>Protéine de jonction serrée 1</td><td>Novus</td><td>NBP1-85047</td><td>Lot : C115428</td></tr><tr><td>Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tétraméthylbutyl)phényl-polyéthylène glycol)</td><td>Sigma</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Gibco</td><td>27250-018</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 (monolaurate de sorbitan de polyéthylène glycol)</td><td>Sigma</td><td>P1379-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

croissance et caractérisation des organoïdes irradiés des glandes mammaires

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Les organoïdes dérivés du tissu digéré sont des constructions tridimensionnelles (3D) multicellulaires qui mieux récapitulent les conditions in vivo que les monocouches cellulaires. Bien qu’ils ne puissent pas complètement modéliser la complexité in vivo, ils conservent certaines fonctionnalités de l’orgue d’origine. Dans les modèles de cancer, les organoïdes sont couramment utilisés pour étudier l’invasion de cellules tumorales. Ce protocole vise à développer et caractériser les organoïdes du tissu de la glande mammaire de souris normale et irradiée pour évaluer la réponse de rayonnement dans les tissus normaux. Ces organoïdes peuvent être appliqués à de futures études de cancer in vitro pour évaluer les interactions des cellules tumorales avec des organoïdes irradiés. Les glandes mammaires ont été retouchées, irradiées à 20 Gy et digérées dans une solution de collagénase VIII. Les organoïdes épithéliaux ont été séparés par une différenciation centrifuge, et des organoïdes 3D ont été développés dans des microplaques à faible adhérence à 96 puits. Les organoïdes ont exprimé la cytokératine du marqueur épithélial caractéristique 14. L’interaction macrophage avec les organoïdes a été observée dans des expériences de co-culture. Ce modèle peut être utile pour étudier les interactions tumeur-stromale, l’infiltration des cellules immunitaires et la polarisation des macrophages dans un microenvironnement irradié.

Les organoïdes épithéliaux mammaires irradiés ont été obtenus avec succès à partir de glandes mammaires de souris, traitées et cultivées sur des plaques à faible adhérence (figure 1). Le rendement organoïde a été testé par ensemencement dans différents environnements de croissance (figure 2a-G). Les cellules ensemencées directement sur la culture tissulaire traitée sur des plaques cellulaires de 10 cm ont donné une prolifération de cellules fibroblastes. Les fibroblastes ont...

Les organoïdes développés à partir de glandes mammaires de souris ont été irradiés et caractérisés pour évaluer les traits épithéliaux et les interactions avec les cellules immunitaires. Les organoïdes irradiés peuvent être utilisés pour mieux évaluer les interactions de cellules cellulaires qui peuvent conduire au recrutement de cellules tumorales dans le tissu normal irradié.

Croissance et caractérisation des organoïdes irradiés des glandes mammaires

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Ce protocole peut être utilisé et développé pour analyser comment le rayonnement ionisant affecte le recrutement de cellules tumorales, conduisant à une meilleure compréhension de la récidive du cancer. Les organoïdes mammaires sont des modèles puissants. Ils imitent les caractéristiques in vivo de base, mais ils permettent un isolement facile des variables biologiques.L’utilisation de plaques à faible adhérence annule les défis liés au flux de travail associés aux matrices protéiques. Les patientes triple-négatives de cancer du sein éprouvent la répétition régionale locale aux taux plus élevés suivant la thérapie. L’étude de la façon dont le rayonnement influence le comportement tumoral et immunitaire des cellules mènera à des aperçus importants des mécanismes de répétition.Javier Gomez, étudiant diplômé du laboratoire Silvera Batista, fait la démonstration de la microscopie confoccale des organoïdes. Commencez cette procédure avec l’ablation des glandes mammaires abdominales et inguinales des souris sacrifiées comme détaillé dans le protocole de texte. 45 minutes après l’irradiation des échantillons tel que décrit dans le protocole de texte, placez les glandes mammaires dans une plaque cellulaire stérile de 35 millimètres et hachettez avec des scalpels.Hacher avec environ 40 coups jusqu’à ce que le tissu se détende et des morceaux sont obtenus qui ne sont pas plus grands qu’environ un millimètre carré dans la zone. Maintenant, transférez le tissu à la solution de collagène dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres. Utilisez 10 millilitres de solution de collagène par souris.Placez les tubes d’échantillon dans un bain d’eau pendant 30 à 60 minutes à 37 degrés Celsius, en tourbillonnant pendant cinq secondes toutes les 10 minutes. La digestion est complète lorsque la solution de collagène est trouble. Faites tourner la solution digérée à 450 fois G pendant 10 minutes à température ambiante.Maintenant, trois couches sont observées. Le supernatant est composé de graisse, la couche moyenne est une solution aqueuse, et le fond est une pastille. La pastille apparaît rouge, car il s’agit d’un mélange de cellules épithéliales, de cellules stromales individuelles et de globules rouges.Pré-enrober toutes les pipettes, les pointes de pipette et les tubes de centrifugeuse avec la solution BSA avant le contact par ajout et retrait de la solution BSA. La solution BSA peut être réutilisée, bien qu’elle soit filtrée stérilement avant chaque expérience. Pour une récupération supplémentaire, transférez le supernatant dans un tube frais de 15 millilitres recouvert de BSA.Pipette de haut en bas vigoureusement pour disperser la couche de graisse. Centrifuger l’échantillon à 450 fois G pendant 10 minutes à température ambiante. Aspirer le supernatant, en laissant une petite quantité de médias dans le tube pour éviter d’aspirer la pastille cellulaire.Aspirez maintenant la couche aqueuse du tube avec la pastille d’origine. Ajouter 10 millilitres de DMEM/F12 au tube avec la pastille d’origine, et transférer au deuxième tube. Pipette vigoureusement pour combiner et résuspendre les deux granulés.Après avoir centrifugé à 450 fois-G pendant 10 minutes à température ambiante, aspirer le supernatant et ajouter quatre millilitres de DMEM/F12 au tube. Ajouter 40 microlitres de désoxyribonuclease à la suspension et serrer doucement à la main pendant deux à cinq minutes à température ambiante. Ajouter six millilitres de DMEM/F12 et bien pipette.Après avoir centrifugé le tube à 450 fois G pendant 10 minutes à température ambiante, aspirez le supernatant à la marque de 0,5 millilitre. Resuspendez la pastille en 10 millilitres de DMEM/F12 et pipette à fond. Maintenant centrifuger le tube en pulsant à 450 fois-G et en s’arrêtant quatre secondes après avoir atteint cette vitesse.Répétez les étapes de lavage trois fois de plus pour purifier les organoïdes par différenciation centrifuge. La pastille doit maintenant être une couleur blanc clair composée uniquement d’organoïdes épithéliales. Resuspendez la pastille en 10 millilitres de DMEM/F12.Pipette à fond pour créer une solution homogène. Transférer 50 microlitres dans une boîte de Petri de 30 millimètres et la voir sous un microscope à contraste de phase à 20X. Comptez le nombre d’organoïdes avec un compteur de décompte.Pipette 50 microlitres d’organoïdes dans chaque puits d’une plaque à faible adhérence. Ajouter 150 microlitres de milieu organoïde pour porter le volume de travail total à 200 microlitres. Remplacez soigneusement le milieu tous les deux jours.Maintenir les macrophages crus GFP ou D-tomato-labeled 264.7 dans les médias de DMEM complétés avec 10%FPS et 1%penicilline-streptomycine. Ensemencer les cellules dans le milieu organoïde à la densité désirée. Utilisez le contraste de phase cellulaire vivante et l’imagerie fluorescente pour surveiller l’infiltration des macrophages au fil du temps.Retirer le milieu organoïde des puits en aspirant soigneusement. Fixer les échantillons avec de la formaline tamponnée à 10 % pendant 15 minutes à température ambiante. Laver les organoïdes fixes trois fois pendant cinq minutes en 1X PBS.Si désiré, des échantillons fixes peuvent être conservés à quatre degrés Celsius pendant une semaine pour d’autres taches. Après le lavage, perméabiliser les organoïdes fixes pendant cinq minutes. Bloquer les organoïdes fixes avec 5% de sérum de chèvre normal dans 0,1%PBST pendant une heure à température ambiante avant de laver trois fois pendant cinq minutes avec PBS.Incuber les organoïdes fixes avec de l’anti-cytokératine-14, de l’É-cadhérine ou de la protéine à jonction serrée, en 1% NGS en PBST pendant une heure à température ambiante. Puis laver trois fois pendant cinq minutes en PBST. Maintenant, incuber les organoïdes avec des anticorps secondaires anti-lapin de chèvre avec 1%NGS PBST pendant une heure à température ambiante.Couvrir de papier d’aluminium pour éviter l’exposition à la lumière. Après le lavage comme avant, utiliser le colorant nucléaire pour tacher les noyaux pendant environ une demi-heure. Laver les organoïdes tachés pendant cinq minutes en PBS trois fois.Si vous utilisez une glissière de chambre, montez avec un bordereau de couverture. Conserver les organoïdes enveloppés dans du papier d’aluminium à quatre degrés Celsius jusqu’à deux semaines. Les organoïdes irradiés pourraient être cultivés dans des plaques à faible adhérence, ou dans la membrane du sous-sol, mais la croissance la plus rapide s’est produite dans les plaques à faible adhérence.Organoïdes récapitulés caractéristiques de la glande mammaire. Des constructions morphologiquement semblables aux conduits et lobes ont été observées. Les tendances de croissance ont indiqué que lorsque les organoïdes ont été immédiatement ensemencés après digestion et tri, les organoïdes non irradiés ont augmenté plus rapidement que les organoïdes irradiés, probablement en raison de l’arrêt de la croissance cellulaire résultant de mécanismes de réparation des dommages à l’ADN.Les organoïdes ont exprimé des caractéristiques épithéliales, qui ont été évaluées par coloration immunofluorescente. Les organoïdes irradiés ont exprimé des marqueurs épithéliales. La cytokératine-14, un marqueur du myoepithelium, a été fortement exprimée à la surface des organoïdes irradiés.En outre, l’E-cadhérine et la protéine à jonction serrée ont été exprimées dans les jonctions cellulaires des organoïdes. Ces protéines sont essentielles pour une adhérence cellulaire appropriée. Après irradiation, les organoïdes ont continué à conserver leurs caractéristiques épithéliales.La coloration fluorescente des organoïdes pourrait être visualisée dans les plaques à faible adhérence à l’aide de microscopie par fluorescence. Cependant, la visualisation la plus claire a été obtenue par microscopie confoccale. L’intensité totale corrigée de fluorescence a été calculée en soustrayant l’arrière-plan, et en normalisant par zone organoïde.La culture d’organoïdes dans les plaques de co-culture de 96 puits à faible adhérence a également simplifié les expériences de co-culture. Une fois ensemencée à des concentrations typiques dans la glande mammaire, la colocalisation de macrophage a augmenté avec les organoïdes irradiés. Lors de l’exécution de cette procédure, les choses les plus importantes à retenir sont de ne pas trop digérer les organoïdes, et de purifier adéquatement la différenciation centrifuge.Suite à cette procédure, d’autres expériences de co-culture peuvent être réalisées. Les organoïdes peuvent être co-cultivés avec des cellules tumorales, d’autres cellules immunitaires et des cellules stromales pour recréer le microenvironnement irradié associé à la récidive. Cette méthode sera importante pour évaluer comment les dommages normaux de tissu influencent spécifiquement la dynamique de cellules immunisées, et seront par la suite employées pour comprendre des mécanismes de recrutement de cellules de tumeur.Organoïdes mammaires ont élucidé les mécanismes du développement de la glande mammaire, et ont solidement récapitulé le cancer du sein in vitro. Nous espérons que notre modèle fournit des aperçus sur le recrutement de cellules tumorales induites par la radiation.

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