Génération de peau 3D Organoïde de dérivés du sang de cordon induite par les cellules souches pluripotentes

Les cellules mononucléaires de sang de cordon ombilical, ou CBMC, sont apparues comme source potentielle de cellules pour la médecine régénérative, parce que la dactylographie humaine d’antigène de leucocyte est essentielle au système bancaire de cellules. Les cellules souches pluripotentes induites par cbmc, ou CMBC-iPSCs, peuvent être différenciées en kératinocytes et en fibroblastes. Pour générer des organoïdes cutanés 3D, nous utilisons la recherche dermatologique.

Commencez par faire la culture de CBMC-iPSC sur des plaques de 100 millilitres recouvertes de vitronectin à 37 degrés Celsius et à 10 % de dioxyde de carbone. Lorsque les cellules ont atteint 80% de confluence, laver les cultures avec PBS, et les traiter avec un millilitre d’EDTA d’un millimolaire par plaque pendant deux minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Lorsque les cellules se sont détachées, arrêter la réaction avec trois millilitres d’E8 moyen par plaque, et de recueillir les cellules par centrifugation.

Suspendre à nouveau les granulés dans cinq millilitres de milieu E8 pour le comptage, et transférer une fois 10 à la sixième cellules à un tube conique de 15 millilitres pour centrifugation. Suspendre à nouveau les cellules transférées avec 2,5 millilitres de milieu embryonnaire de formation du corps, complétées par une kinase rho-associée de 10 micromlaires, ou inhibiteur du ROCK. Utilisez une pipette pour transférer des gouttelettes de cellules de 125 microlitres sur un couvercle de plaque de culture non encoated.

Lorsque toutes les gouttelettes ont été placées, retourner le plat pour permettre aux gouttelettes de pendre du couvercle pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, lavez le couvercle avec un milieu E8 frais et transférez la solution embryonnaire du corps dans un tube conique de 50 millilitres. Permettre aux corps embryonnaires de se contenter d’une minute à température ambiante, avant d’aspirer le supernatant et de suspendre à nouveau les corps embryonnaires avec un milieu E8 frais pour leur culture dans une boîte de Pétri de 90 millimètres à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone jusqu’à leur différenciation.

Pour la différenciation des kératinocytes CBMC-iPSC, remplacer le milieu E8 de la culture du corps embryonnaire par un milieu E8 frais, complété par un nanogramme par millilitre de protéines morphogénétiques osseuses 4 pour une incubation de 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, récolter les corps embryonnaires dans un tube conique de 50 millilitres comme démontré, et permettre aux corps de se contenter d’une minute à température ambiante. Ensuite, remplacez le supernatant par six millilitres de milieu de différenciation kératinocyte 1, ou KDM1, complété par un inhibiteur rock de 10 micromolaires, et transférez les corps embryonnaires dans un plat de 100 millimètres recouvert de collagène de type IV.

Les jours zéro à huit de la culture, remplacer le milieu tous les deux jours par KDM1 frais, complété par de l’acide rétinoïque trois micromolaires et 25 nanogrammes par millilitre chacun de la protéine morphogenétique osseuse 4 et facteur de croissance épidermique. Entre les jours neuf à 12, remplacez le milieu tous les deux jours par KDM2, complété par de l’acide rétinoïque trois micromolaires, 25 nanogrammes par millilitre de protéine morphogénétique osseuse 4, et 20 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance épidermique. Entre les jours 13 à 30, changer le milieu tous les deux jours en KDM3, complété par 10 nanogrammes par millilitre de protéine morphogénétique osseuse 4, et 20 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance épidermique.

Pour la différenciation fibroblaste CBMC-iPSC, suspendre à nouveau la culture embryonnaire du corps en six millilitres du milieu de différenciation fibroblaste 1, complétée par un inhibiteur rock de 10 micromolaires, et transférer la suspension embryonnaire du corps dans un plat de 100 millimètres recouvert d’une matrice de membrane sous-sol. Après trois jours d’incubation, traiter la culture avec 0,5 nanomolar os morphogenétique protéine 4 pendant quatre jours, avant de changer le milieu en milieu de différenciation fibroblaste 2. Le septième jour de la culture, changer le milieu à FDM2 tous les deux jours pendant une semaine.

Le jour 14 de la culture, détachez les cellules avec edta d’un millimolaire comme démontré, et recueillez les cellules dans trois millilitres du milieu de différenciation de fibroblaste 2 pour la centrifugation. Re-suspendre les cellules en cinq millilitres de milieu de différenciation fibroblaste 1 pour le comptage, et transférer deux fois-10-à-la-sixième cellules à un plat non enduit. Le jour 21 de la culture, transférez deux fois 10 à la sixième cellule de la culture vers un plat de type I recouvert de collagène de 100 millimètres dans un milieu de différenciation fibroblaste frais 1.

Le jour 28 de la culture, transférez deux fois 10 à six fibroblastes dérivés de l’iPSC à un nouveau plat non enduit. Pour la génération organoïde de peau tridimensionnelle, récoltez les fibroblastes iPSC-dérivés de la culture, et transférez deux fois-fois-10-au-cinquième cellules à un tube conique de 15 millilitres pour la centrifugation. Suspendre à nouveau la pastille fibroblaste en 1,5 millilitres de milieu de différenciation fibroblaste 1 et 1,5 millilitres de solution neutralisée de collagène de type I.

Incuber les cellules sur un insert dans une microplaque de six puits pendant 30 minutes à température ambiante. Lorsque la solution s’est solidifiée, ajouter deux millilitres de milieu au sommet de l’insert, et trois millilitres au fond du puits. Ensuite, placez la matrice fibroblaste dans l’incubateur pendant cinq à sept jours, jusqu’à ce que la gelation soit terminée, et que la matrice ne se contracte plus.

À la fin de l’incubation, récolter les kératinocytes dérivés de l’iPSC et transférer une fois 10 à la sixième cellule vers un tube conique de 15 millilitres pour centrifugation. Suspendre à nouveau la pastille dans 50 à 100 microlitres de faible teneur en calcium milieu épithélial 1, et remplacer le milieu sur la matrice fibroblaste par la solution cellulaire kératinocyte. Après 15 minutes à 37 degrés Celsius, remplacer le milieu en haut de l’insert par deux millilitres de milieu épithélial 1, et le milieu dans le puits inférieur avec trois millilitres de la même, et retourner la plaque à l’incubateur.

Après deux jours, remplacer le milieu dans l’insert et le puits par un milieu épithélial normal de calcium 2 pour deux jours supplémentaires de culture. Au quatrième jour de la culture, enlever tout le milieu, et ajouter trois millilitres de milieu de cornification au fond bien seulement, pour générer une interface air-liquide. Ensuite, retournez la plaque à l’incubateur jusqu’à 14 jours avant de récolter l’organoïde cutané 3D pour analyse en aval.

Les kératinocytes dérivés de CBMC-iPSC ont la morphologie semblable aux kératinocytes primaires, et l’expression des marqueurs de kératinocyte est augmentée dans ces cellules. Les fibroblastes dérivés du CBMC-iPSC ont une morphologie similaire aux fibroblastes primaires, et l’expression du marqueur pluripotent des cellules souches Oct-4 est régulée à la baisse, tandis que les marqueurs fibroblastes sont régulés. L’épaisseur de l’organoïde cutané 3D augmente au cours de la culture 3D, confirmant que l’organoïde cutané 3D est généré à partir de kératinocytes et fibroblastes dérivés de l’iPSC.

Après deux semaines, une greffe organoïde de peau 3D transplantée incorpore efficacement dans une peau de souris destinataire, comme confirmé par l’analyse de HNE. En outre, la maturation des kératinocytes et les marqueurs de différenciation épidermique sont exprimés dans les organoïdes de la peau 3D dérivés de CBMC-iPSC, démontrant une différenciation fonctionnelle, une greffe efficace et une guérison efficace des défauts cutanés de la souris. Nous utilisons dans le passé avec le milieu de calcium élevé qui induit des couches stratifiées d’organoïde de la peau 3D pour imiter près de la peau.

l’analyse montre que la peau est stratifiée. Les CBMC-iPSC sont une source potentielle de cellules pour les greffes de peau, et les organoïdes 3D dérivés de CBMC-iPSC peuvent être utilisés dans des études liées à la dermatologie, au criblage cosmétique, et à la médecine régénérative.