Name: Génération de peau 3D Organoïde de dérivés du sang de cordon induite par les cellules souches pluripotentes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Découvrez la génération d'organoides cutanés 3D à partir de cellules souches pluripotentes induites dérivées du sang de cordon. Cette méthode permet de créer des modèles de peau fonctionnels pour la recherche dermatologique et la médecine régénérative.

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Ce travail a été soutenu par une subvention du Corée Healthcare Technology R & D Project, ministère de santé, de bien-être et d’affaires de la famille, République de Corée (H16C2177, H18C1178).

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été réalisés conformément à la loi sur la protection des animaux du laboratoire, le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, et les lignes directrices et des politiques pour l’expérimentation de rongeur fourni par l’animalier institutionnel et Use Committee (IACUC) de l’école de médecine de l’Université catholique de Corée. Le protocole de l’étude a été approuvé par la Commission de révision institutionnelle de l’Université catholique de Corée (CCEM-2018-0191-01). L’IACUC et le département de laboratoire animaux (DOLA) de l’Université catholique de Corée, Songeui Campus accrédités par le laboratoire de Corée Excellence Animal de la Korea Food and Drug Administration en 2017 et acquis de liaison pour l’évaluation et Accréditation d’accréditation International Laboratory Animal Care International (AAALAC) en 2018.
1. peau la différenciation cellulaire des cellules souches pluripotentes induites
<ol><li>Moyenne préparation NOTE : Stocker tous les moyen à 4 ° C dans l’obscurité pendant 3 mois. Filtrer tous les moyens en utilisant un système de filtre de 0,22 μm polyéthersulfone avant de l’utiliser pour la stérilisation. Tous les moyen n’était disponible dans un volume total de 500 mL.<ol>
<li>Préparer KDM1 (moyen de différenciation des kératinocytes 1). Moyenne (DMEM de l’aigle de la modification de mix Dulbecco) / F12 moyen (3:1) avec 2 % sérum fœtal (SVF), 0,3 mmol/L d’acide L-ascorbique, 5 μg/mL d’insuline et 24 adénine µg/mL.</li>
		<li>Préparer KDM2 (moyen de différenciation des kératinocytes 2). Mix définis sans sérum moyen des kératinocytes (voir la Table des matières) avec 0,3 mmol/l d’acide L-ascorbique, 5 μg/mL d’insuline et adénine de 10 μg/mL. Remarque : Des kératinocytes défini un milieu sans sérum est optimisé pour soutenir la croissance et l’expansion des kératinocytes.</li>
		<li>Préparer KDM3 (moyen de différenciation des kératinocytes 3). Mix défini un milieu sans sérum kératinocytes et kératinocytes milieu sans sérum (1:1) voir la Table des matières pour plus de détails. Remarque : Un milieu sans sérum kératinocytes est optimisé pour la croissance et l’entretien des kératinocytes.</li>
		<li>Préparer FDM1 (moyen de différenciation fibroblastique 1). Mix DMEM/F12 moyen (3:1) avec 5 % FBS, 5 μg/mL d’insuline, adénine 0,18 mM et 10 ng/mL facteur de croissance épidermique (EGF).</li>
		<li>Préparer FDM2 (moyen de différenciation fibroblastique 2). Mix DMEM/F12 moyen (1:1) avec 5 % SVF et 1 % acides aminés non essentiels.</li>
		<li>Préparer l’EP1 (épithélial moyen 1). Mix DMEM/F12 (3:1) avec 4 mM de L-glutamine, 40 adénine μM, 10 la transferrine μg/mL, 10 μg/mL d’insuline et 0,1 % FBS.</li>
		<li>Préparer EP2 (épithélial moyen 2). Mélanger EP1 et chlorure de calcium de 1,8 mM.</li>
		<li>Préparer EP3 (épithélial medium 3, moyen de kératinisation). F12 mix moyen avec 4 mM de L-glutamine, 40 μM adénine, 10 transferrine μg/mL, 10 μg/mL d’insuline, 2 % FBS et chlorure de calcium de 1,8 mM.</li>
	</ol></li>
	<li>Génération de corps embryonnaire
	<ol>
<li>Générer des CBMC-CISP en utilisant le protocole indiqué dans une précédente étude12.</li>
		<li>Manteau pétri, à l’aide de la vitronectine. Préparation de 5 mL pour recouvrir un plat de 100 mm.<ol>
<li>Décongeler et remettre en suspension dans 50 μl de la vitronectine 0,5 mg/mL (concentration finale : 5 µg/mL) avec 5 mL de sérum physiologique tamponnée au phosphate (PBS). Ajouter la solution aux plats et incuber à température ambiante (RT) pendant 1 h. aspirer le produit avant utilisation (pour ne pas dessécher).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Maintenir le CISP CBMC dérivé à la vitronectine enduit 100 mm plaque et modifier le milieu de l’iPSC (E8) tous les jours à 37 ° C, avec 10 % de CO2.</li>
		<li>Générer des organes embryonnaires (EBs) en utilisant le protocole indiqué dans la précédente étude15 (décrit brièvement comme suit). Développez CISP en changeant le support jusqu'à ce que les cellules ont atteint 80 % confluence. Au confluent de 80 %, enlevez le milieu et laver avec du PBS.</li>
		<li>Traiter les cellules avec 1 mL de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 1 mM. Incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 2 min et récolter les cellules à l’aide de 3 mL de milieu de E8. Centrifuger les cellules à 250 x g pendant 2 min.</li>
		<li>Aspirer le surnageant et appliquer 5 mL de milieu de E8 aux cellules. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et 1 x 106 cellules de transfert dans un nouveau tube conique de 15 mL. Centrifuger les cellules à 250 x g pendant 2 min.</li>
		<li>Remettre en suspension les cellules transférés avec 2,5 mL de milieu de formation EB avec inhibiteur de kinase associée à Rho (ROCK) 10 μM. Déposez 1 x 104 cellules (25 µL/drop) sur un couvercle de plaque de culture noncoated à l’aide d’une pipette multicanaux de 10 à 100 μL. Formulaire 100 EBs de 1 x 106 cellules (1 x 104 cellules/1 EB). Retournez le plat et accrocher sur la goutte sur le couvercle. NOTE : Inhibiteur de la roche est nécessaire au cours de l’étape de pièces jointes dans le processus de maintenance et de la différenciation. Ajouter l’inhibiteur ROCK qu’au stade de l’agrégation de EB.</li>
		<li>Incuber les gouttelettes à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 1 nuit.</li>
		<li>Le lendemain, récolter les 100 EBs et utilisez-les pour la différenciation. Nettoyez le couvercle de plaque avec iPSC milieu (milieu de E8) ou PBS et récolter son contenu dans un tube conique de 50 mL. Maintenir l’EBs à ta pendant 1 min à eux s’installent. Aspirer le surnageant et remettre en suspension l’EBs avec E8 moyen les maintenir dans une boîte de pétri de 90 mm jusqu'à la différenciation.</li>
	</ol></li>
	<li>Différenciation des CBMC-CISP en kératinocytes Remarque : Pour un schéma de la différenciation des kératinocytes de CBMC-CISP, voir Figure 1A.<ol>
<li>Récolte du 100 EBs dans un tube conique de 50 mL avec support iPSC ou PBS. Maintenir à ta pendant 1 min à l’EBs s’installent. Veillez à ce qu’ils s’installent au fond du tube conique. Aspirer le surnageant et remettre en suspension l’EBs avec E8 moyen avec 1 protéine morphogénétique de l’OS ng/mL 4 (BMP4). Transférer l’EBs vers un 90 mm boîte de Pétri et maintenir à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 1 nuit.</li>
		<li>Enrober les récipients de culture, à l’aide de collagène de type IV. Préparer 5 mL de collagène de type IV pour enduire un plat de 100 mm.<ol>
<li>Décongeler et remettre en suspension le type de solution de collagène IV (concentration finale : 50 µg/mL) avec 0,05 N HCl. Ajoutez la solution aux plats et incuber à RT pendant 1 h. aspirer le produit avant utilisation (pour ne pas dessécher). Remarque : Avant d’utiliser les plaques, laver la vaisselle 3 x avec PBS pour éliminer n’importe quel acide.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Récolter l’EBs (étape 1.3.1) dans un tube conique de 50 mL et de les entretenir à ta pendant 1 min à eux s’installent. S’assurer qu’ils s’installent au fond du tube conique, aspirer le surnageant et remettre en suspension l’EBs dans 6 mL de KDM1 avec inhibiteur de ROCK 10 µM. Transférer l’EBs dans le type IV collagène-enduit 100 mm plat. NOTE : Ajouter l’inhibiteur ROCK qu’à l’étape de fixation EB.</li>
		<li>Entre 0 – 8 jours, changer le support de tous les autres jours à KDM1 par l’acide rétinoïque 3 µM (RA) et 25 ng/mL chacune de BMP4 et EGF. Maintenir l’EBs à 37 ° C, avec 5 % de CO2.</li>
		<li>Entre les jours de 9 à 12, remplacez le milieu alternats KDM2 avec 3 µM RA, 25 ng/mL BMP4 et 20 ng/mL EGF.</li>
		<li>Entre les jours de 13 à 30, modifier le milieu tous les deux jours KDM3 avec 10 ng/mL BMP4 et 20 ng/mL EGF.</li>
	</ol></li>
	<li>Différenciation des CBMC-iPSC en fibroblastes Remarque : Pour un schéma de la différenciation des fibroblastes de CBMC-CISP, voir Figure 2A.<ol>
<li>Manteau pétri, à l’aide de la matrice de la membrane basale. Préparation de 5 mL pour recouvrir un plat de 100 mm.<ol>
<li>Décongeler la matrice de la membrane basale (concentration finale : 600 ng/mL) et le diluer avec milieu DMEM/F12. Ajoutez la solution aux plats et incuber à 37 ° C pendant 30 min. aspirer le produit avant utilisation (pour ne pas dessécher).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Récolte du 100 EBs dans un tube conique de 50 mL avec une pipette avec la moyenne de l’iPSC ou PBS. Maintenir à ta pendant 1 min à l’EBs s’installent. S’assurer qu'ils s’installent au fond du tube conique. Retirez le surnageant.</li>
		<li>Remettre en suspension l’EBs à l’aide d’une pipette 1 000 de µL dans 6 mL de FDM1 avec inhibiteur de ROCK 10 µM. Transfert de l’EBs (avec support) dans un plat enduit de matrice de 100 mm à membrane basale et incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2. Actualiser le FDM1 tous les deux jours pendant 3 jours. Remarque : Ajouter seulement l’inhibiteur ROCK au stade de la fixation de EB.</li>
		<li>Ajouter 0,5 protéine morphogénétique de l’OS nM 4 (BMP 4) à la FDM1 entre 4 et 6 jours.</li>
		<li>Au jour 7, remplacez le milieu FDM2 tous les deux jours pendant 1 semaine.</li>
		<li>Au jour 14, ajouter 1 mL d’EDTA 1 mM et incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 2 min. récolter les cellules avec 3 mL de FDM2 et centrifuger à 250 g pour 2 min. Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 5 mL de FDM1.</li>
		<li>Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre resuspendre 2 x 106 cellules avec support FDM1 et transférer les cellules dans le plat de noncoated. Maintenir les cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO2 et changer le support de tous les autres jours.</li>
		<li>Pétri de manteau, à l’aide de collagène de type I. Préparation de 5 mL pour recouvrir un plat de 100 mm. Diluer la solution de collagène de type I (concentration finale : 50 µg/mL) dans l’acide acétique 0,02 N. Ajouter la solution aux plats et incuber à RT pendant 1 h. aspirer le produit avant utilisation (pour ne pas dessécher). Remarque : Avant d’utiliser les plaques, laver la vaisselle 3 x avec PBS pour enlever l’acide.</li>
		<li>Au jour 21, ajouter 1 mL d’EDTA 1 mM et incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 2 min. récolter les cellules avec 3 mL de FDM1 et centrifuger à 250 g pour 2 min. Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 5 mL de FDM1. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et transfert 2 x 106 cellules au type j’ai plat enduit de collagène 100 mm avec support FDM1. Maintenir les cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO2 et changer le support de tous les autres jours.</li>
		<li>Le 28e jour, ajouter 1 mL d’EDTA 1 mM et incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 2 min. récolter les cellules avec 3 mL de FDM1 et centrifuger à 250 g pour 2 min. Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 5 mL de FDM1. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et 2 x 106 cellules de transfert dans un plat de noncoated avec le FDM1 moyen. Maintenir les cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO2 et changer le support de tous les autres jours. NOTE : dérivés iPSC fibroblastes prolifèrent comme une lignée de cellules de fibroblaste primaire et le passage jusqu'à 10 passages. Dans cette étude, nous avons utilisé des fibroblastes iPSC-dérivé de deux à cinq passages pour une analyse ultérieure.</li>
	</ol></li>
</ol>2. demande des cellules différenciées dérivées hiPSC
<ol><li>
Génération de peau 3D organoïde
	<ol>
<li>Préparer neutralisée type j’ai collagène sur la glace, suite aux recommandations du fabricant. Comme la concentration finale, utilisez 3 mg/mL de collagène de type I (stock concentration de type j’ai collagène est 3,47 mg/mL) et assurez-vous que le volume final du mélange est de 5 mL. Calculer le volume de 10 x PBS (volume final/10 = 0,5 mL). Calculer le volume de collagène pour servir de type I (volume final x concentration finale de collagène / concentration de collagène de stock = 5 mL x 3 mg / mL / 3,47 mg / mL = 4,32 mL). Calculer le volume de NaOH N 1 (volume de collagène à utiliser x 0,023 mL = 0,1 mL). Calculer le volume de dH2O (volume final - volume de collagène - volume de 10 x PBS - volume de NaOH N 1 = 5 et 4,32 mL-0,5 mL à 0,1 mL = 0,08 mL). Mélanger le contenu du tube et le maintenir sur la glace jusqu'à utilisation.</li>
		<li>Ajouter 1 mL d’EDTA dans les fibroblastes iPSC-dérivé de l’étape 1.4.10 et incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 2 min. récolter les cellules individuelles, compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et 2 x 105 cellules de transfert dans un nouveau tube conique de 15 mL. Centrifuger à 250 x g pendant 2 min et retirez le surnageant. Remettre en suspension les cellules des fibroblastes dérivés iPSC dans 1,5 mL de FDM1 et neutralisé le type j’ai solution de collagène (1:1). NOTE : Mélanger la solution doucement pour éviter les bulles.</li>
		<li>Placer l’insertion de la membrane sur une microplaque de 6 puits, transvaser le mélange dans l’insert et incuber 30 min à RT. Remarque : Ne pas déplacer les plaques.</li>
		<li>Après avoir confirmé la gélification, ajouter 2 mL de milieu vers le haut de l’insert et 3 mL jusqu’au fond du puits. Incuber la matrice de fibroblastes et de collagène à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 5 à 7 jours, jusqu'à ce que la gélification est complète et non plus de contrats.</li>
		<li>Après la congélation complète, détacher les kératinocytes iPSC-dérivé (de l’étape 1.3.6) sur EDTA. Ajouter 1 mL d’EDTA et incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 2 min. récolter les cellules individuelles, les compter à l’aide d’un hémocytomètre et 1 x 106 cellules de transfert dans un nouveau tube conique de 15 mL. Centrifuger à 250 x g pendant 2 min.</li>
		<li>Retirez le surnageant et remettre en suspension de 1 x 106 cellules pour 50-100 µL de milieu épithéliales de faible teneur en calcium 1 (EP1).</li>
		<li>Aspirer toutes les moyennes dans la matrice (voir étape 2.1.5) et 1 x 106 cellules de kératinocytes iPSC dérivé sur chaque couche de fibroblastes de graines. Incuber les plaques à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 30 min. Remarque : Ne pas déplacer la plaque et n’ajoutez pas de n’importe quel support pour la fixation de kératinocytes.</li>
		<li>Ajouter 2 mL de EP1 à la partie supérieure de l’insert et 3 mL de EP1 jusqu’au fond du puits.</li>
		<li>Après 2 jours, aspirer tous les moyen de la plaque d’insert membrane et changer le milieu au calcium normal EP2 durant 2 jours.</li>
		<li>Après 2 jours, aspirer tous les moyen et ajouter 3 mL de milieu kératinisation seulement vers le bas pour générer une interface air-liquide.</li>
		<li>Maintenir la peau 3D organoïde jusqu'à 14 jours à 37 ° C, avec 5 % de CO2 et changer le support de tous les autres jours. Récolter l’organoïde peau 3D en coupant le bord de l’insert et utilisez-le pour un complément d’étude de la souillure et de la greffe de peau.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Greffe de peau
	<ol>
<li>Réaliser l’anesthésie par inhalation sur souris NOD/scid (mâles, 6 semaines), à l’aide d’une méthode standard, approuvée sur le plan institutionnel. Pour greffe de peau, raser la fourrure de la peau du dos de la souris.</li>
		<li>Supprimer une section de 1 cm sur 2 cm de peau de la souris, à l’aide de ciseaux courbes avec une pince.</li>
		<li>Placez l’organoïde CBMC iPSC-dérivé de peau 3D sur le site de défaut et la suture utilisant une méthode de pansement sur cravate soie suturer.</li>
		<li>Observer les souris pendant 2 semaines et les sacrifier pour faire une analyse histologique. Le protocole de coloration a été vérifié dans précédentes études16.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

CISP humaine ont été suggérés comme une nouvelle alternative pour la médecine régénérative personnalisée17. CISP personnalisé dérivé de patient reflète les caractéristiques du patient qui peuvent être utilisés pour la modélisation de maladies, dépistage de drogue et autogreffe18,19. L’utilisation de dérivés de patient CISP peut aussi surmonter les problèmes relatifs aux éléments primaires, un manque d’un nombre adéquat de cellules et des r...

La peau recouvre la surface extérieur du corps et protège les organes internes. La peau a des fonctions diverses, y compris la protection contre les agents pathogènes, d’absorber et de stocker de l’eau, régulation de température du corps et excréter l’organisme des déchets2. Greffes de peau peuvent être classés selon la source de la peau ; greffes à l’aide de la peau d’un autre donneur sont appelés des allogreffes et greffes à l’aide de la peau du patient sont des autogreffes. Bien qu’une autogreffe est privilégiée dans le traitement en raison de ses risques de rejet faible, biopsies de la peau sont difficiles à effectuer sur des patients atteints de lésions graves ou un nombre insuffisant de cellules de la peau. Chez les patients atteints de graves brûlures, trois fois le nombre de cellules de peau est nécessaire pour couvrir de grandes surfaces. La disponibilité limitée des cellules de la peau du corps du patient se traduit dans les situations où les transplantations allogéniques sont nécessaire. Une allogreffe est utilisée temporairement jusqu'à ce que la greffe autologue est possible puisqu’il est généralement rejeté par le système immunitaire de l’hôte après environ 1 semaine3. Pour surmonter le rejet par le système immunitaire du patient, greffes doivent provenir d’une source avec la même identité immunitaire comme le patient4.
CISP humaine est une source émergente de cellules des cellules souches thérapie5. CISP humaine est générés à partir des cellules somatiques, à l’aide de facteurs de reprogrammation comme OCT4, SOX2, Klf4 et c-Myc,6. À l’aide de CISP humaine permet de surmonter les enjeux éthiques et immunologiques des cellules souches embryonnaires (CSE)7,8. CISP humaine ont pluripotence et peut se différencier en trois couches de germe9. La présence de HLA, un facteur critique dans la médecine régénérative, détermine la réponse immunitaire et la possibilité de rejet10. L’utilisation de dérivés de patient CISP résout les problèmes de rejet de la limitation et le système immunitaire cellulaire-source. CBMCs ont également émergé comme une source de cellule de rechange pour la médecine régénérative,11. Obligatoire HLA typage, qui survient au cours d’opérations bancaires CBMC, peut facilement être utilisé pour la recherche et de la transplantation. En outre, homozygote de type HLA CISP peut largement applicable à divers patients12. Une banque de CBMC-iPSC est un roman et une stratégie efficace pour la thérapie cellulaire et médecine régénératrice allogénique12,13,14. Dans cette étude, nous utiliser CBMC-CISP, se différencient en kératinocytes et des fibroblastes et générer des couches stratifiées de peau 3D. Les résultats de cette étude suggèrent qu’un organoïde CBMC iPSC-dérivé de peau 3D est un nouvel outil de recherche dermatologique in vitro et in vivo.

<table><tbody><tr><td>Adénine</td><td>Sigma</td><td>A2786</td><td>Composant du milieu de différenciation pour fibroblaste</td></tr><tr><td>Milieu AggreWell (milieu de formation EB)</td><td>STEMCELL</td><td>05893</td><td>Formation EB</td></tr><tr><td>Anticorps anti-fibronectine</td><td>abcam</td><td>ab23750</td><td>Marqueur de fibroblaste</td></tr><tr><td>Anticorps anti-KRT14</td><td>abcam</td><td>ab7800</td><td>Marqueur kératinocytaire</td></tr><tr><td>Anticorps anti-loricrine</td><td>abcam</td><td>ab85679</td><td>Marqueur de la couche cornée</td></tr><tr><td>Anticorps anti-p63</td><td>abcam</td><td>ab124762</td><td>Marqueur kératinocytaire</td></tr><tr><td>Anticorps anti-vimentine</td><td>Santa cruz</td><td>sc-7558</td><td>Marqueur de fibroblaste</td></tr><tr><td>BAND AID TISSU FLEXIBLE</td><td>Johnson & </td><td></td><td>Johnson-Bandage</td></tr><tr><td>Matrice de membrane basale (Matrigel)</td><td>BD</td><td>354277</td><td>Composant du milieu de différenciation pour fibroblaste</td></tr><tr><td>SUTURE BLACK SILK</td><td>AILEEE</td><td>SK617</td><td>Greffe de peau</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>Composant du milieu épithélial pour organoïde cutané 3D</td></tr><tr><td>Collagène de type I</td><td>BD</td><td>354236</td><td>organoïde</td></tr> <tr><td>cutané 3DCollagène de type IV</td><td>Santa-cruz</td><td>sc-29010</td><td>Composant du milieu de différenciation pour les kératinocytes</td></tr><tr><td>Milieu libre de kératinocytes-sériques définis</td><td>Gibco</td><td>10744-019</td><td>Composant du milieu de différenciation pour les kératinocytes</td></tr><tr><td>DMEM, à haute teneur</td><td>en glucose Gibco</td><td>11995065</td><td>Composant du milieu de différenciation</td></tr><tr><td>DMEM/F12 Milieu</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>Composant de milieu de différenciation</td></tr><tr><td>Essential 8 medium</td><td>Gibco</td><td>A1517001</td><td>milieu iPSC</td></tr><tr><td>FBS, qualifié</td><td>Corning</td><td>35-015-CV</td><td>Composant du milieu de différenciation pour fibroblastes et kératinocytes</td></tr><tr><td>Glutamax Supplement&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Composant du milieu de différenciation pour fibroblaste</td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Invtrogen</td><td>12585-014</td><td>Composant du milieu de différenciation pour fibroblaste et kératinocyte</td></tr><tr><td>Iris ciseaux courbés standard</td><td>Professional</td><td>PC-02.10</td><td>Instrument chirurgical</td></tr><tr><td>Kératinocyte Serum Free Medium</td><td>Gibco</td><td>17005-042</td><td>Composant du milieu de différenciation pour kératinocyte</td></tr><tr><td>Acide L-ascorbique 2-phosphata sesquisel de magnésium hydraté</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td>Composant du milieu de différenciation pour kératinocyte</td></tr><tr><td>MEM Acide aminé non essentiel</td><td>Gibco</td><td>1140050</td><td>Composant du milieu de différenciation pour fibroblaste</td></tr><tr><td>Meriam Forceps Pouce 16 cm</td><td>HIROSE</td><td>HC 2265-1</td><td>Instrument chirurgical</td></tr><tr><td>NOD. CB17-Prkdc SCID/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>001303</td><td>Souris souche pour greffe de peau</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 90 mm</td><td>Hyundai Micro</td><td>H10090</td><td>Plastic ware</td></tr><tr><td>Recombinant Human BMP-4</td><td>R& D</td><td>314-BP</td><td>Composant du milieu de différenciation pour la</td></tr><tr><td>protéine EGF humaine recombinante</td> kératinocyte <td>R& D</td><td>236-EG</td><td>Composant du milieu de différenciation pour kératinocytes</td></tr><tr><td>Acide rétinoïque</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>Composant du milieu de différenciation pour kératinocytes</td></tr><tr><td>T/C Pétridure 100 mm, 240/bx</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Récipient en plastique</td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma</td><td>T3705</td><td>Composant du milieu épithélial pour organoïde cutané 3D</td></tr><tr><td>Inserts de membrane recouverts de collagène Transwell-COL nbsp ;</td><td>Corning</td><td>CLS3492</td><td>Vaisselle en plastique pour organoïde de peau 3D&nbsp ;</td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Life technologies</td><td>A14700</td><td>Culture iPSC</td></tr><tr><td>Y-27632 Dichlorhydrate</td><td>peprotech</td><td>1293823</td><td>culture iPSC</td></tr></tbody></table>

génération de peau 3d organoïde de dérivés du sang de cordon induite par les cellules souches pluripotentes

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

La peau est l’organe du plus grand et a de nombreuses fonctions. La peau agit comme une barrière physique et protecteur du corps et régule les fonctions corporelles. Biomimetics est l’imitation des modèles, systèmes et éléments de la nature dans le but de résoudre des problèmes complexes de l’homme1. Peau biomimetics est un outil utile pour la recherche sur les maladies in vitro et in vivo en médecine régénérative. Les cellules souches humaines pluripotentes induites (CISP) ont la particularité de la prolifération illimitée et la capacité de différenciation à trois couches de germe. CISP humaine est générés à partir des divers éléments primaires, telles que les cellules sanguines, les kératinocytes, fibroblastes, etc.. Parmi eux, les cellules mononucléaires de sang de cordon (CBMCs) ont émergé comme une source de cellules alternative du point de vue de la médecine régénérative allogénique. CBMCs sont utiles en médecine régénérative parce que human leucocyte antigen (HLA) tapant est essentielle à la cellule système bancaire. Nous fournissons une méthode pour la différenciation des CBMC-CISP en kératinocytes et des fibroblastes et génération d’une peau 3D organoïde. Fibroblastes et des kératinocytes CBMC iPSC-dérivés ont des caractéristiques semblables à une ligne de cellules primaires. Les organoids de peau 3D sont générés en superposant une couche épidermique sur une couche dermique. Par la transplantation de cette organoïde peau 3D, un modèle de souris humanisées est généré. Cette étude montre qu’un organoïde 3D peau humaine d’iPSC dérivé peut être un outil nouveau, alternatif pour la recherche dermatologique in vitro et in vivo.

La peau est composée, pour l’essentiel, de l’épiderme et le derme. Les kératinocytes sont le type de cellule principale de l’épiderme, et fibroblastes sont le type de cellule principale du derme. Le schéma de la différenciation des kératinocytes est montré dans la Figure 1A. CBMC-iPCSc ont été maintenus dans un plat enduit de vitronectine (Figure 1B). Dans cette étude, nous avons différencié CBMC-CISP en kératinocytes et des fib...

Nous vous proposons un protocole qui montre comment différencier des fibroblastes et des kératinocytes de dérivés de cellules souches pluripotentes induites et générer un organoïde peau 3D, à l’aide de ces kératinocytes et des fibroblastes. Ce protocole comporte une étape supplémentaire de la génération d’un modèle de souris humanisées. La technique présentée ici permettra d’améliorer la recherche dermatologique.

Génération de peau 3D Organoïde de dérivés du sang de cordon induite par les cellules souches pluripotentes

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Les cellules mononucléaires de sang de cordon ombilical, ou CBMC, sont apparues comme source potentielle de cellules pour la médecine régénérative, parce que la dactylographie humaine d’antigène de leucocyte est essentielle au système bancaire de cellules. Les cellules souches pluripotentes induites par cbmc, ou CMBC-iPSCs, peuvent être différenciées en kératinocytes et en fibroblastes. Pour générer des organoïdes cutanés 3D, nous utilisons la recherche dermatologique.Commencez par faire la culture de CBMC-iPSC sur des plaques de 100 millilitres recouvertes de vitronectin à 37 degrés Celsius et à 10 % de dioxyde de carbone. Lorsque les cellules ont atteint 80% de confluence, laver les cultures avec PBS, et les traiter avec un millilitre d’EDTA d’un millimolaire par plaque pendant deux minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Lorsque les cellules se sont détachées, arrêter la réaction avec trois millilitres d’E8 moyen par plaque, et de recueillir les cellules par centrifugation.Suspendre à nouveau les granulés dans cinq millilitres de milieu E8 pour le comptage, et transférer une fois 10 à la sixième cellules à un tube conique de 15 millilitres pour centrifugation. Suspendre à nouveau les cellules transférées avec 2,5 millilitres de milieu embryonnaire de formation du corps, complétées par une kinase rho-associée de 10 micromlaires, ou inhibiteur du ROCK. Utilisez une pipette pour transférer des gouttelettes de cellules de 125 microlitres sur un couvercle de plaque de culture non encoated.Lorsque toutes les gouttelettes ont été placées, retourner le plat pour permettre aux gouttelettes de pendre du couvercle pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, lavez le couvercle avec un milieu E8 frais et transférez la solution embryonnaire du corps dans un tube conique de 50 millilitres. Permettre aux corps embryonnaires de se contenter d’une minute à température ambiante, avant d’aspirer le supernatant et de suspendre à nouveau les corps embryonnaires avec un milieu E8 frais pour leur culture dans une boîte de Pétri de 90 millimètres à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone jusqu’à leur différenciation.Pour la différenciation des kératinocytes CBMC-iPSC, remplacer le milieu E8 de la culture du corps embryonnaire par un milieu E8 frais, complété par un nanogramme par millilitre de protéines morphogénétiques osseuses 4 pour une incubation de 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, récolter les corps embryonnaires dans un tube conique de 50 millilitres comme démontré, et permettre aux corps de se contenter d’une minute à température ambiante. Ensuite, remplacez le supernatant par six millilitres de milieu de différenciation kératinocyte 1, ou KDM1, complété par un inhibiteur rock de 10 micromolaires, et transférez les corps embryonnaires dans un plat de 100 millimètres recouvert de collagène de type IV.Les jours zéro à huit de la culture, remplacer le milieu tous les deux jours par KDM1 frais, complété par de l’acide rétinoïque trois micromolaires et 25 nanogrammes par millilitre chacun de la protéine morphogenétique osseuse 4 et facteur de croissance épidermique. Entre les jours neuf à 12, remplacez le milieu tous les deux jours par KDM2, complété par de l’acide rétinoïque trois micromolaires, 25 nanogrammes par millilitre de protéine morphogénétique osseuse 4, et 20 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance épidermique. Entre les jours 13 à 30, changer le milieu tous les deux jours en KDM3, complété par 10 nanogrammes par millilitre de protéine morphogénétique osseuse 4, et 20 nanogrammes par millilitre de facteur de croissance épidermique.Pour la différenciation fibroblaste CBMC-iPSC, suspendre à nouveau la culture embryonnaire du corps en six millilitres du milieu de différenciation fibroblaste 1, complétée par un inhibiteur rock de 10 micromolaires, et transférer la suspension embryonnaire du corps dans un plat de 100 millimètres recouvert d’une matrice de membrane sous-sol. Après trois jours d’incubation, traiter la culture avec 0,5 nanomolar os morphogenétique protéine 4 pendant quatre jours, avant de changer le milieu en milieu de différenciation fibroblaste 2. Le septième jour de la culture, changer le milieu à FDM2 tous les deux jours pendant une semaine.Le jour 14 de la culture, détachez les cellules avec edta d’un millimolaire comme démontré, et recueillez les cellules dans trois millilitres du milieu de différenciation de fibroblaste 2 pour la centrifugation. Re-suspendre les cellules en cinq millilitres de milieu de différenciation fibroblaste 1 pour le comptage, et transférer deux fois-10-à-la-sixième cellules à un plat non enduit. Le jour 21 de la culture, transférez deux fois 10 à la sixième cellule de la culture vers un plat de type I recouvert de collagène de 100 millimètres dans un milieu de différenciation fibroblaste frais 1.Le jour 28 de la culture, transférez deux fois 10 à six fibroblastes dérivés de l’iPSC à un nouveau plat non enduit. Pour la génération organoïde de peau tridimensionnelle, récoltez les fibroblastes iPSC-dérivés de la culture, et transférez deux fois-fois-10-au-cinquième cellules à un tube conique de 15 millilitres pour la centrifugation. Suspendre à nouveau la pastille fibroblaste en 1,5 millilitres de milieu de différenciation fibroblaste 1 et 1,5 millilitres de solution neutralisée de collagène de type I.Incuber les cellules sur un insert dans une microplaque de six puits pendant 30 minutes à température ambiante. Lorsque la solution s’est solidifiée, ajouter deux millilitres de milieu au sommet de l’insert, et trois millilitres au fond du puits. Ensuite, placez la matrice fibroblaste dans l’incubateur pendant cinq à sept jours, jusqu’à ce que la gelation soit terminée, et que la matrice ne se contracte plus.À la fin de l’incubation, récolter les kératinocytes dérivés de l’iPSC et transférer une fois 10 à la sixième cellule vers un tube conique de 15 millilitres pour centrifugation. Suspendre à nouveau la pastille dans 50 à 100 microlitres de faible teneur en calcium milieu épithélial 1, et remplacer le milieu sur la matrice fibroblaste par la solution cellulaire kératinocyte. Après 15 minutes à 37 degrés Celsius, remplacer le milieu en haut de l’insert par deux millilitres de milieu épithélial 1, et le milieu dans le puits inférieur avec trois millilitres de la même, et retourner la plaque à l’incubateur.Après deux jours, remplacer le milieu dans l’insert et le puits par un milieu épithélial normal de calcium 2 pour deux jours supplémentaires de culture. Au quatrième jour de la culture, enlever tout le milieu, et ajouter trois millilitres de milieu de cornification au fond bien seulement, pour générer une interface air-liquide. Ensuite, retournez la plaque à l’incubateur jusqu’à 14 jours avant de récolter l’organoïde cutané 3D pour analyse en aval.Les kératinocytes dérivés de CBMC-iPSC ont la morphologie semblable aux kératinocytes primaires, et l’expression des marqueurs de kératinocyte est augmentée dans ces cellules. Les fibroblastes dérivés du CBMC-iPSC ont une morphologie similaire aux fibroblastes primaires, et l’expression du marqueur pluripotent des cellules souches Oct-4 est régulée à la baisse, tandis que les marqueurs fibroblastes sont régulés. L’épaisseur de l’organoïde cutané 3D augmente au cours de la culture 3D, confirmant que l’organoïde cutané 3D est généré à partir de kératinocytes et fibroblastes dérivés de l’iPSC.Après deux semaines, une greffe organoïde de peau 3D transplantée incorpore efficacement dans une peau de souris destinataire, comme confirmé par l’analyse de HNE. En outre, la maturation des kératinocytes et les marqueurs de différenciation épidermique sont exprimés dans les organoïdes de la peau 3D dérivés de CBMC-iPSC, démontrant une différenciation fonctionnelle, une greffe efficace et une guérison efficace des défauts cutanés de la souris. Nous utilisons dans le passé avec le milieu de calcium élevé qui induit des couches stratifiées d’organoïde de la peau 3D pour imiter près de la peau.l’analyse montre que la peau est stratifiée. Les CBMC-iPSC sont une source potentielle de cellules pour les greffes de peau, et les organoïdes 3D dérivés de CBMC-iPSC peuvent être utilisés dans des études liées à la dermatologie, au criblage cosmétique, et à la médecine régénérative.

generation-3d-skin-organoid-from-cord-blood-derived-induced

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Cette vidéo décrit le protocole détaillé de génération de reconstructions cutanées organotypiques 3D in vitro pour étudier la progression du mélanome. Ce modèle de peau imite à la fois l’architecture et la complexité multicellulaire des organes in vivo.

Génération de reconstructions organotypiques de la peau complète : une procédure pour établir un modèle de peau 3D à l’aide d’échantillons de peau humaine

Cette vidéo montre un test permettant de générer des organoïdes cérébraux à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPSC). Les iPSC humaines sont amenées à former des corps embryoïdes (EB). Les EB sont cultivés sur un échafaudage polymère à l’aide d’un milieu d’induction, favorisant la différenciation en cellules souches neurales, cellules progénitrices et neurones immatures. Enfin, les EB sont intégrés dans une matrice et transférés dans un milieu d’entretien pour la formation...

Génération d’organoïdes cérébraux dérivés de cellules souches pluripotentes induites

Ce protocole a été généré comme un moyen de produire des organoïdes cérébraux d’une manière simplifiée et peu coûteuse sans facteurs de croissance exogènes ou matrice de membrane de sous-sol tout en maintenant la diversité des types de cellules cérébrales et de nombreuses caractéristiques de l’organisation cellulaire.

Une méthode statique auto-dirigée pour générer des organoïdes cérébraux à partir de cellules souches embryonnaires humaines

Nous décrivons ici un système d’induction organoïde rétinienne optimisé, qui convient à diverses lignées de cellules souches pluripotentes humaines pour générer des tissus rétiniens avec une reproductibilité et une efficacité élevées.

Système d’induction organoïde rétinienne pour la dérivation de tissus rétiniens 3D à partir de cellules souches pluripotentes humaines

L’article décrit la différenciation dirigée par étapes des cellules souches pluripotentes induites en organoïdes pulmonaires entiers tridimensionnels contenant à la fois des cellules pulmonaires épithéliales proximales et distales ainsi que du mésenchyme.

Génération d’organoïdes pulmonaires entiers 3D à partir de cellules souches pluripotentes induites pour la modélisation de la biologie et de la maladie du développement pulmonaire

Ce protocole décrit la génération de vaisseaux sanguins auto-organisés à partir de cellules souches pluripotentes et pluripotentes induites humaines. Ces réseaux de vaisseaux sanguins présentent un réseau endothélial étendu et connecté entouré de péricytes, d’actine musculaire lisse et d’une membrane basale continue.

Génération d’organoïdes de vaisseaux sanguins humains à partir de cellules souches pluripotentes

Ce protocole présente une méthode complète et efficace pour produire des organoïdes rénaux à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) en utilisant des conditions de culture en suspension. L’objectif principal de cette étude réside dans la détermination de la densité cellulaire initiale et de la concentration d’agonistes WNT, ce qui profite aux chercheurs intéressés par la recherche sur les organoïdes rénaux.

Génération d’organoïdes rénaux en suspension à partir de cellules souches pluripotentes induites

Ce protocole présente une méthode de génération d’organoïdes vasculaires à l’aide de cellules souches pluripotentes humaines.

Génération d’organoïdes vasculaires à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Ce protocole décrit une méthode de production d’organoïdes cutanés contenant des follicules pileux à partir de cellules souches pluripotentes humaines induites à l’aide d’un système de culture planaire et physiologiquement pertinent à l’interface air-liquide pour reproduire l’architecture et la fonction de la peau.

Génération d’organoïdes cutanés planaires poilus dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme à l’aide d’un système de culture à interface air-liquide

L’édition de gènes médiée par TALEN au locus AAVS1 permet l’ajout de transgènes à haute efficacité dans les iPSC humaines. Ce protocole décrit les procédures de préparation des CSPi pour l’administration de TALEN et du vecteur donneur, la transfection des CSPi, ainsi que la sélection et l’isolement des clones de CSPi afin de réaliser l’intégration ciblée d’un gène GFP pour générer des lignées rapporteures.

Transfection, sélection et Colony-cueillette des induite par l&#39;homme Cellules souches pluripotentes TALEN ciblées avec un gène de la GFP dans le AAVS1 Safe Harbor

Découvrez la génération d'organoides cutanés 3D à partir de cellules souches pluripotentes induites dérivées du sang de cordon. Cette méthode permet de créer des modèles de peau fonctionnels pour la recherche dermatologique et la médecine régénérative.

Génération de peau 3D Organoïde de dérivés du sang de cordon induite par les cellules souches pluripotentes

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