Dissection de la rétine de pupes de drosophile pour immunohistochimie, analyse occidentale et isolement d’ARN

Ce protocole est significatif parce qu’il s’agit d’une méthode efficace pour l’isolement du tissu oculaire pupal Drosophila pour de multiples applications en aval. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet la dissection rapide d’un grand nombre d’yeux pupals sans endommager le tissu. La dissection de la rétine pupale de Drosophila sera difficile pour les novices.

Pratiquer la technique est la meilleure façon d’améliorer la vitesse des dissections et la qualité des résultats. Après avoir placé la pupe de Drosophile sur un plat de dissecting noir, mentez un morceau frais de ruban adhésif à double face sur le plat disséquant, loin des nymphes, et utilisez une paire de forceps pour placer soigneusement le côté dorsale des pupes vers le haut sur la bande. Placez le plat sous un microscope stéréo, et utilisez des forceps pour enlever l’operculum de chaque pupe.

Utilisez des ciseaux de microdissection pour trancher chaque cas pupal, lui permettant d’être ouvert pour révéler la tête, le thorax et le segment abdominal antérieur, et fixer les bords du boîtier pupal à la bande à double face. Percer l’abdomen de chaque pupe avec des forceps pointus, et enlever la pupe de son cas pupal. Déposer la pupe sur le plat de dissection, loin de la bande, et couvrir la pupe de 400 microlitres de PBS glacé.

Utilisez des forceps pour saisir chacun par l’abdomen, et utilisez les ciseaux de microdissection pour faire une incision transversale propre à travers le thorax, coupant les nymphes en deux. À l’aide de deux paires de forceps fins, saisir les bords coupés de chaque épithélium thorax et ouvrir progressivement le thorax et la capsule de la tête, exposant le complexe œil-cerveau et le tissu adipeux environnant. Ensuite, sans saisir le tissu, utilisez des forceps pour guider chaque complexe œil-cerveau translucide, blanc éteint et en forme d’haltère, loin des restes de la capsule de tête.

Après avoir disséqué de six à dix nymphes, couper une pointe de micropipette à l’aide d’une lame de rasoir propre à un diamètre d’environ un millimètre et lubrifier la pointe avec un mélange de PBS et de graisse. Utilisez la pointe lubrifiée de la pipette pour transférer les complexes œil-cerveau dans un puits d’un plat en verre de neuf puits contenant 400 microlitres de PBS sur la glace, puis transférez le tissu dans 20 microlitres de PBS dans au moins 250 microlitres de fixatif pour une incubation de 35 minutes sur la glace. À la fin de la fixation, utiliser la même pointe de pipette pour transférer le tissu dans un troisième puits contenant 400 microlitres de PBS frais pendant cinq à 10 minutes sur la glace.

Pour bloquer toute liaison anticorps non spécifique, transférez les complexes œil-cerveau en 400 microlitres de PBS plus Triton X pour une incubation de 10 à 60 minutes sur la glace. À la fin de l’incubation, aliquot 10 microlitres de la solution d’anticorps primaire dans le nombre nécessaire de puits d’une plaque microwell de 72 puits, et utiliser une micropipette de déplacement d’air P10 avec une pointe modifiée de 0,5 millimètre lubrifié avec PBS plus Triton X pour transférer pas plus de cinq complexes oeil-cerveau et pas plus de trois microlitres de PBS dans chaque puits de solution anticorps. Après une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius, lavez les échantillons deux fois dans 400 microlitres de PBS plus Triton X dans un puits d’un plat en verre de neuf puits pendant cinq à dix minutes par lavage.

Après le troisième lavage, transférer le tissu en 100 microlitres d’une solution d’anticorps secondaire appropriée pendant deux heures à température ambiante, à l’abri de la lumière, après trois lavages de cinq à dix minutes dans 400 microlitres de PBS plus Triton X et un lavage en PBS. Ensuite, équilibrer les échantillons en 200 microlitres de milieu de montage pendant une à deux heures. À la fin de l’incubation, transférez les échantillons à une lame de microscope et utilisez une aiguille de tungstène robuste pour épingler un complexe œil-cerveau sur la lame sous un microscope disséquant.

Ensuite, utilisez une aiguille de tungstène fine pour trancher chaque œil loin de son lobe optique associé et pour manœuvrer chaque œil à la surface de la glissière du microscope de sorte que la surface basale de l’œil est adjacente à la lame. Ensuite, appliquez un coverslip propre sur les échantillons, et sceller le coverslip avec du vernis à ongles. Pour préparer le tissu pupal d’oeil pour l’analyse occidentale de tache, disséquez d’abord 10 à 16 pupes comme précédemment démontré dans deux lots, 10 à 15 minutes d’intervalle dans PBS complété avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase.

Après avoir brièvement rincé les complexes isolés oeil-cerveau à deux reprises dans les puits individuels d’un plat en verre de neuf puits sur la glace dans 400 microlitres de PBS plus inhibiteurs, transférer tous les complexes oeil-cerveau en 400 microlitres de PBS glacé plus inhibiteurs décantés sur un plat de dissecting noir propre. Sous un microscope dissecting propre, utilisez une aiguille de tungstène robuste et une fine lame de rasoir pour couper proprement chaque œil du lobe optique, et utilisez une pointe lubrifiée pour transférer les complexes œil-cerveau en cinq microlitres de PBS plus inhibiteurs dans un tube de microcentrifugeuse de 500 microlitres sur la glace. Ajouter ensuite cinq microlitres de tampon de lyse tissulaire occidentale et 10 microlitres de tampon d’échantillon de protéines concentrées 2X au tube.

Pour traiter les complexes œil-cerveau pour l’extraction de l’ARN, le port de gants, nettoyer le banc, microscope, outils de dissection, et noir disséquant la vaisselle avec 70% d’éthanol et rnase décontamination réacgnt. Après avoir laissé sécher la zone, disséquer un total de 30 à 40 pupes par lots de six à huit. Après que chaque lot de complexes œil-cerveau ont été disséqués, transférez les complexes œil-cerveau du plat de neuf puits en 400 microlitres de PBS frais, glacé, sans nucléase sur un plat de dissecting propre, et utilisez une aiguille de tungstène robuste et une fine lame de rasoir pour couper proprement chaque œil du lobe optique.

Lorsque tous les yeux d’un lot ont été enlevés, transférez-les dans un tube de microcentrifugeuse stérile sans RNase et congèlez les échantillons dans de l’azote liquide avant de passer au lot suivant. L’œil pupal est un tissu facilement accessible qui sert d’excellent modèle pour étudier les processus de développement, y compris ceux qui conduisent la morphogenèse. Environ 40 heures après la formation de puparium, l’arrangement final des cellules est atteint.

Il s’agit d’un âge idéal pour évaluer les conséquences d’une mutation génétique ou d’une expression génétique modifiée. Par exemple, à la suite de l’expression ectopique de Diap1, un inhibiteur central de l’apoptose, l’augmentation conséquente du nombre de cellules en treillis peut être comparée à celle observée dans une rétine témoins. L’apoptose peut également être évaluée plus directement en utilisant des anticorps pour activer un caspase-1 mort ou en utilisant d’autres approches pour détecter les cellules mourantes.

Des analyses occidentales de taches de lysates oculaires peuvent être utilisées pour déterminer la présence ou l’expression relative de protéines d’intérêt ou pour comparer l’expression des protéines à différents moments de développement. Il est important de noter que la dissécation de plus de 60 yeux par génotype ou condition expérimentale est optimale pour isoler suffisamment d’ARN de haute qualité. La chose la plus importante à retenir est que la rétine pupale est extrêmement fragile, et un grand soin doit être pris pendant sa dissection pour assurer son intégrité.