Name: Dissection de la rétine de pupes de drosophile pour immunohistochimie, analyse occidentale et isolement d’ARN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Apprenez la dissection de la rétine de pupes de Drosophila melanogaster pour l'immunohistochimie, l'analyse occidentale et l'isolement d'ARN. Cette méthode efficace préserve l'intégrité tissulaire et permet d'isoler rapidement de nombreux yeux de pupes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nous remercions Zack tambour et nos évaluateurs des commentaires utiles sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par R15GM114729.

1. préparation du tissu
<ol><li>Mise en place de Drosophila traverse (comme décrit plus haut20) ou la culture de certaines souches de Drosophila afin d’obtenir des nymphes du génotype désiré. Pour s’assurer qu’un grand nombre de nymphes émergence soit dit en passant, mettre en place ces cultures voler en double sur les médias d’aliments riches en nutriments ou norme alimentaire généreusement additionnée de levure-pâte.</li>
	<li>Maintenir les cultures de la drosophile à 25 ° C. Pour les croisements utilisant le système de GAL4-UAS, GMR-GAL4 est un pilote idéal exprimé dans des cellules de le œil larvaire disque postérieurs du sillon morphogénétique et tout au long de la pupe développement21,22,23, 24. la croix SAMU-lacZ X GMR-GAL4 sert un contrôle idéal cross comme il pousse l’expression de la protéine β-galactosidase non endogènes et inerte.</li>
	<li>Utiliser la pointe d’une tige de bambou 6" qui a été mouillée à l’eau distillée pour soulever des pupes avant blancs (Figure 1 b) du côté de flacons de culture sain (Figure 1 a) délicatement et placer dans un tube de microtubes de 1,5 mL (Figure 1).</li>
	<li>Placer les tubes dans une boîte de pointe de pipette en plastique avec un petit morceau de tissu imbibé d’eau distillée afin de maintenir la chambre à une humidité suffisante pour protéger les pupes de dessiccation (Figure 1). Incuber les pupes à 25 ° C jusqu'à la dissection.</li>
	<li>Utilisez une attelle de bambou sec 6" pour pousser doucement la pupe du tube de microcentrifuge et sur un noir plat de dissection. Posez un morceau frais de ruban adhésif double-face sur le plat de dissection de la pupe.</li>
	<li>À l’aide d’une paire de pinces, placer soigneusement la face dorsale de pupes vers le haut (c'est-à-dire, les opercules vers le haut, Figure 1 b) sur le ruban adhésif (Figure 2 a). Veiller à ce que les nymphes adhèrent parfaitement à la bande. Remarque : L’humidité sur la pupe sera inhibent l’adhésion sécurisée sur la bande, auquel cas, permettre les pupes sécher avant de les placer sur le ruban double-face à.</li>
</ol>2. dissection de l’oeil-cerveau Complexes
<ol><li>Utiliser les pinces pour enlever l’opercule de chaque chrysalide (Figure 2).</li>
	<li>Utiliser des ciseaux de microdissection à trancher ou couper la pupe de chaque chrysalide. Rabat ouvert la pupe de révéler la tête, le thorax et le segment abdominal antérieur, sécurisation des bords de la pupe à l’adhésif double face (Figure 2). Remarque : Il n’est pas nécessaire de révéler entièrement les pupes.</li>
	<li>Percer l’abdomen de chaque chrysalide avec une forte pince, pour saisir l’animal et de retirer de sa pupe (Figure 2).</li>
	<li>Placez les pupes sur le plat de dissection noir, loin de la bande et couvrir avec environ 400 µL de glacee-tampon-solution de phosphate (PBS, pH 7,4).</li>
	<li>Saisir chaque chrysalide de l’abdomen avec pinces et ciseaux de microdissection, faites une coupe propre transversale à travers le thorax entier, coupant la chrysalide en demi (Figure 2D).</li>
	<li>Retirez le vestige postérieur de chaque carcasse du PBS et mettre de côté sur le plat de dissection (ne pas jeter, reportez-vous à l’étape 3.2.1).</li>
	<li>À l’aide de deux paires de pinces fines, ouvrir le thorax et la tête de chaque chrysalide pour révéler le complexe de l’oeil-cerveau (Figure 2E). Pour ce faire, saisissez les coupe-bords de l’épithélium du thorax et peu à peu se déchirer pour ouvrir le thorax et la tête puis capsule, exposant ainsi le tissu graisseux oeil-cerveau complexe et les environs.</li>
	<li>Sans saisir le tissu, utiliser le forceps pour guider le complexe de l’oeil-cerveau loin les restes de la capsule céphalique ou évider le complexe de l’oeil-cerveau de la capsule céphalique ouvert déchiré. NOTE : Le complexe de l’oeil-cerveau est en forme d’haltère, blanc cassé et plus translucide que la graisse environnante de couleur crème (Figure 2 b, E).</li>
	<li>Avec une pince, retirer délicatement la plupart gras associés avec les complexes de l’oeil-cerveau sans toucher les tissus oculaires.</li>
</ol>3. le traitement du tissu pour l’Immunofluorescence
<ol><li>Disséquer les pupes d’au moins 6 à 10 comme décrits (étapes 2.1-2,9). NOTE : Trois ou quatre réplicats indépendantes de chaque dissection tendent à produire suffisamment de données pour tester une hypothèse.</li>
	<li>
Lavage et Fixation
	<ol>
<li>Couper l’extrémité d’un P20 ou P100 de pipette avec une lame de rasoir propre à accroître l’ouverture pointe à environ 1 mm de rayon et lubrifier en pipettant également, un mélange de PBS et de gras vers le haut et en bas. Cette graisse peut provenir des restes de carcasse retirées au point 2.6.</li>
		<li>Transférer les complexes de l’oeil-cerveau dans ~ 400 µL de PBS dans un plat en verre de 9 puits, sur la glace. Utiliser la pointe lubrifiée et une micropipette de déplacement d’air P20 ou P100 pour transférer. NOTE : Complexes de l’oeil-cerveau seront respecter des conseils non lubrifiés pendant le pipetage et endommagés ou perdus.</li>
		<li>Enlever le gras restant associé avec les tissus de le œil en pipettant également, le PBS haut et bas pour agiter doucement les complexes de l’oeil-cerveau. En cela et toutes les étapes de lavage ultérieure, ne pas directement pipetter complexes de l’oeil-cerveau de haut en bas car cela endommagerait les tissus de le œil fragile.</li>
		<li>Les complexes de l’oeil-cerveau dans un volume minimal de transfert (< 20 µL) de PBS au moins 250 µL de fixatif. Mélanger en pipettant également la solution de haut en bas. Incuber pendant 35 min, sur la glace. Remarque : La pointe lubrifiée même préparée à l’étape 3.1.1 peut être utilisée pour ce transfert.</li>
		<li>Avec la même pipette, transvaser les complexes de l’oeil-cerveau dans un bien contenant ~ 400 µL de PBS. Mélanger en pipettant également la solution de haut en bas et incuber pendant 5 à 10 minutes sur la glace, se laver. Répétez l’étape de la laver au moins deux fois. Remarque : Les complexes de l’oeil-cerveau peuvent être maintenus pendant plusieurs heures dans le lavage final de PBS, sur glace ou à 4 ° C, avant de passer à l’étape 3.3.1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Anticorps
	<ol>
<li>Pour bloquer le tissu avant des exposer aux solutions d’anticorps, transférer les complexes de l’oeil-cerveau à ~ 400 µL de PBT. Utiliser la pointe lubrifiée et une micropipette de déplacement d’air P20 ou P100 pour le transfert. Incuber pendant 10 à 60 minutes, sur la glace.</li>
		<li>Préparer la solution d’anticorps primaire en diluant anticorps appropriés en PBT. Complexes de l’oeil-cerveau sont incubés à 10 µL d’extraits de solution d’anticorps, le volume préparé sera une adaptation de 10.</li>
		<li>Aliquote de 10 µL de solution d’anticorps dans un bien propre d’un plateau de 72 puits microwell (voir discussion).</li>
		<li>Couper l’extrémité d’une pointe de pipette P10 avec une lame de rasoir propre à accroître l’ouverture pointe à ~0.5 mm de rayon et lubrifier par pipetage PBT de haut en bas.</li>
		<li>Pas plus de 5 complexes d’oeil-cerveau, dans un volume de transfert < 3 µL de PBS, dans chaque 10 µL de solution d’anticorps à l’aide d’une micropipette de déplacement aérien P10 et la pointe lubrifiée.</li>
		<li>Homogénéiser la solution d’anticorps en pipettant également la solution de haut en bas. Ne pas pipeter les complexes de l’oeil-cerveau de haut en bas, car cela endommagerait le tissu.</li>
		<li>Pour minimiser l’évaporation de la solution d’anticorps, placer un petit morceau de tissu imbibé d’eau distillée dans le bac de micropuits et sceller la barre d’État (par exemple, avec le couvercle fourni). Incuber une nuit à 4 ° C.</li>
		<li>Transférer les complexes de l’oeil-cerveau du plateau microwell dans ~ 400 µL de PBT dans un plat en verre 9-sourdait, se laver. Utiliser une micropipette de déplacement aérien P10 et embout PBT-lubrifié (préparer comme indiqué au point 3.3.4). Mélanger en pipettant également la solution de haut en bas. Incuber pendant 5 à 10 minutes sur la glace.</li>
		<li>Répétez l’étape de la laver au moins deux fois. Utiliser une micropipette de déplacement aérien P20 ou P100 et embout PBT-lubrifié pour transférer les complexes de l’oeil-cerveau entre solutions de lavage.</li>
		<li>Préparer la solution d’anticorps secondaire en diluant appropriés fluorophore-tag anticorps secondaires en PBT tel que requis. Il suffit de 100 µL de solution d’anticorps secondaire par lot de 6-10 chrysalides. Partie aliquote de la solution d’anticorps secondaire dans un plat en verre 9-sourdait dissection.</li>
		<li>Transférer les complexes de l’oeil-cerveau dans la solution d’anticorps secondaire. Utiliser une micropipette de déplacement aérien P20 ou P100 et embout PBT-lubrifié pour le transfert.</li>
		<li>Incuber les complexes de l’oeil-cerveau dans la solution d’anticorps secondaire pendant 1-2 h à température ambiante, ou 3-5 h à 4 ° C. Pour empêcher le blanchiment de fluorophores par la lumière, couvrir la préparation avec une feuille. Remarque : La durée optimale d’incubation dans une solution d’anticorps secondaire peut varier selon les anticorps primaires et secondaires utilisés.</li>
		<li>Transférer les complexes de l’oeil-cerveau dans ~ 400 µL de PBT dans un plat en verre de 9 puits, se laver. Mélanger en pipettant également la solution de haut en bas. Incuber pendant 5 à 10 minutes sur la glace. Cette étape de lavage doit être répétée au moins deux fois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fixation secondaire
	<ol>
<li>Pour une fixation secondaire, transférer les complexes de l’oeil-cerveau au moins 200 µL de fixateur et incuber pendant 20 min à température ambiante ou à 35 min à 4 ° C. Remarque : La fixation secondaire raidit le tissu oculaire, ce qui facilite le montage (étape 3.5).</li>
		<li>Utiliser une micropipette de déplacement aérien P20 ou P100 et embout PBT-lubrifié pour transférer des complexes de l’oeil-cerveau dans ~ 400 µL de PBT dans un plat en verre de 9 puits, sur la glace, se laver pendant 5 min.</li>
		<li>Répétez l’étape de la laver au moins une fois.</li>
		<li>Utiliser un P20 ou P100 micropipette de déplacement aérien et embout PBT-lubrifié pour transférer les complexes de l’oeil-cerveau dans ~ 400 µL de PBS dans un plat en verre de 9 puits, sur la glace, de rincer pendant 1-2 min. gardent le tissu en mouvement par pipetage PBS, mais pas le tissu , haut et bas pour éviter les complexes de l’oeil-cerveau de décantation et respectant le plat en verre au cours de PBS-rinçage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montage
	<ol>
<li>Transférer les complexes de l’oeil-cerveau dans ~ 200 µL de supports de montage. Utiliser une micropipette de déplacement aérien P20 ou P100 et embout PBT-lubrifié pour transférer les complexes de l’oeil-cerveau. Laisser le tissu s’équilibrer dans les médias pendant 1-2 h de montage.</li>
		<li>Déposer une goutte µL 5-8 de supports de montage fraîche sur une lame de microscope propre.</li>
		<li>Couper un bout de P10 avec une lame de rasoir propre à accroître l’ouverture pointe à ~0.5 mm de rayon et utiliser ceci et une micropipette de déplacement aérien P10 pour transférer les complexes de l’oeil-cerveau dans 5-8 µL de montage des médias dans la baisse du support de montage sur la diapositive.</li>
		<li>Deux aiguilles de tungstène permet de séparer les yeux des lobes optiques. Épingler un complexe oeil-cerveau à la diapositive avec une aiguille de tungstène robuste et trancher chaque oeil loin de son lobe optique associée avec une aiguille fine tungstène (Figure 2F).</li>
		<li>Utilisez l’aiguille fine de tungstène de manœuvre de chacun des deux yeux à la surface de la lame de microscope avec la surface terrière de chaque œil adjacent à la diapositive. Doucement baisser une lamelle couvre-objet propre sur le tissu et fixer avec les vernis à ongles. NOTE : Organiser les yeux sur la diapositive pour qu’ils soient proches ou en ligne facilitera la microscopie ultérieure.</li>
		<li>Images de la rétine à l’aide de la microscopie fluorescente ou confocale. NOTE : Diapositives doivent être conservées à 4 ° C sinon imagés immédiatement.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. préparation du tissu oculaire pour éponger occidental :
<ol><li>Disséquer les pupes de 10-16 (étapes 2,1 à 2,9) avec les modifications suivantes : a) recueillir et disséquer les nymphes en deux lots, 10-15 min apart et b) découpent dans du PBS additionné d’inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase (PBS + pi).</li>
	<li>L’oeil-cerveau complexes à l’aide d’un P20 de transfert ou P100 micropipette de déplacement de l’air et lubrifié pointe (préparé comme au point 3.2.1) en ~ 400 µL de PBS + pi dans un plat en verre de 9 puits, sur la glace, de rincer brièvement. NOTE : Cette astuce lubrifiée peut être utilisée pour les étapes suivantes 4.3 et 4.4.</li>
	<li>Répéter deux fois l’étape de rinçage.</li>
	<li>Transférer tous les complexes de l’oeil-cerveau dans ~ 400 µL de PBS froid glace + pi décanté sur un plat de dissection propre noir.</li>
	<li>Retirez les lobes optiques en utilisant une aiguille solide de tungstène (pour stabiliser le complexe de l’oeil-cerveau) de chaque oeil et une fine lame de rasoir ou de la microdissection ciseaux pour couper proprement chaque œil du lobe optique. Remarque : Les yeux est « collantes » à ce stade et peut adhérer légèrement à la dissection plat. C’est avantageuse car elle peut aider à faciliter le retrait des yeux des lobes optiques (voir discussion).</li>
	<li>« Balayer » tous les regards dans une « pile » dans le PBS + pi sur le plat de dissection, à l’aide d’une lame d’une belle paire de pinces.</li>
	<li>Couper un bout de P10 avec une lame de rasoir propre d’élargir l’ouverture pointe à ~0.5 mm de rayon et lubrifier l’astuce-intérieur de pipetage Western tissu Lysis Buffer (WTLB) en haut et en bas.</li>
	<li>Transférer les complexes de l’oeil-cerveau dans 5 µL de PBS + pi dans un tube de microcentrifuge 500 µL. Utilisez cette astuce lubrifiée et une micropipette de déplacement aérien P10 pour effectuer le transfert.</li>
	<li>Placer le tube de microcentrifuge sur glace. Ajouter 1 volume (5 µL) de WTLB à l’échantillon et 10 µL de tampon 2 x concentré de protéine (ou 2,5 µL de tampon concentré de protéine x 5). Mélanger en tapotant.</li>
	<li>Vortex la microcentrifugeuse tube brièvement, puis tourner vers le bas de l’échantillon à l’aide d’une mini-centrifugeuse de bureau.</li>
	<li>Conserver l’échantillon à-20 ° C jusqu'à l’analyse. Analyser à l’aide de protocoles standard.</li>
</ol>5. préparation du tissu oculaire pour l’Extraction de l’ARN :
<ol><li>Porter des gants, paillasse propre, microscope, outils de dissection et noir dissection plat tout d’abord avec l’éthanol à 70 %, puis de réactif de décontamination de RNase. Laisser pour sécher.</li>
	<li>Disséquer les 30-40 nymphes comme décrits (étapes 2,1 à 2,9) avec les modifications suivantes : un) se rassemblent et disséquer les pupes de 6 à 8 par lots, 15-20 min d’intervalle ; b) disséquer exempte de nucléase PBS et c) isoler chaque lot d’yeux séparément mais accumuler le tissu rétinien tous dans le même tube de microcentrifuge (étape 5.5). NOTE : Ayant deux personnes à disséquer simultanément s’accélérera isolation efficace des tissus bon oeil.</li>
	<li>Pour chaque lot, isoler les oeil-cerveau complexes (étapes 2,1 à 2,9) et le transfert en ~ 400 µL de PBS exempte de nucléase dans un plat en verre de 9 puits de rincer brièvement, sur la glace, à l’aide d’une micropipette de déplacement aérien P20 ou P100 et astuce lubrifié (préparé comme indiqué au point 3.1.2). NOTE : Cette astuce lubrifiée peut être utilisée pour les étapes suivantes 5.4, 5.5 et 5.8.</li>
	<li>Répéter deux fois l’étape de rinçage.</li>
	<li>Transférer les complexes de l’oeil-cerveau dans une goutte de frais 400 µL de PBS d’exempte de nucléase glacée sur un propre noir plat de dissection.</li>
	<li>Retirer les lobes optiques utilisant une aiguille de tungstène robuste (pour stabiliser le cerveau oeil complex) de chaque oeil et une fine lame de rasoir ou de la microdissection ciseaux pour couper proprement chaque œil du lobe optique. Remarque : Les yeux est « collantes » à ce stade et peut adhérer légèrement à la dissection plat. C’est avantageuse car elle peut aider à faciliter le retrait des yeux des lobes optiques (voir Discussion).</li>
	<li>« Balayer » tous les regards dans une « pile » dans du PBS exempte de nucléase sur le plat de dissection, à l’aide d’une lame d’une belle paire de pinces.</li>
	<li>Transférer les yeux dans un tube de microcentrifuge stérile RNase-libre et flash-congélation dans l’azote liquide.</li>
	<li>Répétez la dissection (étapes 5.3-5,8) de chaque lot de pupes. Transférer chaque lot d’yeux dans le même tube de microcentrifuge qui a été conservé dans l’azote liquide (étape 5.5) d’accumuler tous les regards dans un tube.</li>
	<li>Conserver les échantillons à-80 ° C jusqu'à l’extraction de l’ARN.</li>
</ol>

<ol><li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+order+in+the+Drosophila+pupal+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">The emergence of order in the Drosophila pupal retina.</a> Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).</li>
<li>Wolff, T., Ready, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWolff%2C+T+%22The+development+of+Drosophila+melanogaster%22">The development of Drosophila melanogaster</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).</li>
<li>Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+genetics+%26+development%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the Drosophila eye.</a> Current opinion in genetics & development. 17 (4), 309-313 (2007).</li>
<li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).</li>
<li>Hayashi, T., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+mechanics+mediate+pattern+formation+in+the+developing+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina.</a> Nature. 431, 647(2004).</li>
<li>Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+Adhesion+Mediated+by+Hibris+and+Roughest+Regulates+Morphogenesis+and+Patterning+in+the+Drosophila+Eye%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye.</a> Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).</li>
<li>Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Decapentaplegic+signaling+regulates+patterning+and+adhesion+in+the+Drosophila+pupal+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina.</a> Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).</li>
<li>Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+behavior+in+the+developing+Drosophila+pupal+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+development%22%5BJournal%5D)">Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina.</a> Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).</li>
<li>Martín-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bellaïche, Y., Malartre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vav+oncogene+antagonises+EGFR+signalling+and+regulates+adherens+junction+dynamics+during+Drosophila+eye+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development.</a> Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).</li>
<li>Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Clément, R., Laugier, E., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+cortical+tension+mediated+by+N-cadherin+controls+cell+geometric+order+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye.</a> eLife. 6, e22796(2017).</li>
<li>Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wingless+eliminates+ommatidia+from+the+edge+of+the+developing+eye+through+activation+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis.</a> Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).</li>
<li>Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+wingless+in+an+early+pupal+cell+death+event+that+contributes+to+patterning+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+development%22%5BJournal%5D)">A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye.</a> Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).</li>
<li>Mendes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c%E2%80%90d+regulates+developmental+apoptosis+in+the+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c‐d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina.</a> EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).</li>
<li>Monserrate, J., Brachmann, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+death+zone%3A+a+spatially+restricted+region+for+programmed+cell+death+that+sculpts+the+fly+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye.</a> Cell Death & Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).</li>
<li>Bushnell, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNK+is+antagonized+to+ensure+the+correct+number+of+interommatidial+cells+pattern+the+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina.</a> Developmental Biology. 433 (1), 94-107 (2018).</li>
<li>Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+techniques+for+pupal+and+larval+Drosophila+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li>
<li>Hsiao, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+Immunohistochemistry+of+Larval%2C+Pupal+and+Adult+Drosophila+Retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347(2012).</li>
<li>Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+Mounting+of+Drosophila+Pupal+Eye+Discs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315(2014).</li>
<li>Johnson, R. I., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Quantitative+Method+to+Analyze+Drosophila+Pupal+Eye+Patterning%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning.</a> PLoS ONE. 4 (9), e7008(2009).</li>
<li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreenspan%2C+RJ+%22Fly+pushing+%3A+the+theory+and+practice+of+Drosophila+genetics%22">Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Ellis, M. C., O'Neill, E. M., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Drosophila+glass+protein+and+evidence+for+negative+regulation+of+its+activity+in+non-neuronal+cells+by+another+DNA-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein.</a> Development. 119 (3), 855-865 (1993).</li>
<li>Duffy, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+system+in+drosophila%3A+A+fly+geneticist%27s+swiss+army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22genesis%22%5BJournal%5D)">GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife.</a> genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li>
<li>Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broad+expression+profile+of+the+GMR-GAL4+driver+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Mol+Res%22%5BJournal%5D)">A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster.</a> Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).</li>
<li>Song, Z., McCall, K., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCP-1%2C+a+Drosophila+Cell+Death+Protease+Essential+for+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development.</a> Science. 275 (5299), 536-540 (1997).</li>
<li>Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+homologs+of+baculovirus+inhibitor+of+apoptosis+proteins+function+to+block+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death.</a> Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La méthode de dissection de pupes oeil Drosophila décrite ici permet l’isolement des complexes d’oeil-cerveau 6 à 10 de 10 à 15 min. Cependant, patience et pratique sont indispensables afin de maîtriser la technique de dissection et d’améliorer la qualité et la rapidité des dissections. Ce temps de dissection court s’assure que chaque oeil est approximativement le même stade de développement, réduisant la variabilité dans l’expression de phénotype ou gène des rétines dans un ensemble de données. Tandis que d’aut...

La rétine de la drosophile est composée d’environ 750 ommatidies entourés de cellules pigmentaires disposés en nid d’abeilles trellis1,2,3,4. Chaque Ommatidie contient les neurones photorécepteurs huit, quatre cellules de cône sécrétant des lentilles et deux cellules de pigment primaires. Entourant chaque Ommatidie est les cellules productrices de pigment de treillis et de groupes de soies sensorielles. En raison de sa nature post-mitotique et stéréotypée arrangement hexagonal, la rétine de pupes de Drosophila fournit un système d’excellent modèle pour l’étude des processus morphogénétiques dont cell adhesion5,6, 7,8,9,10 et apoptose11,12,13,14,15.
Plusieurs protocoles publiés utilisent la pression d’air pour extraire des complexes de l’oeil-cerveau de Drosophila nymphes16,17,18. Le protocole décrit ici plutôt utilise microdissection outils soigneusement et isoler précisément complexes de l’oeil-cerveau dans le but d’obtenir des tissus rétiniens intact. Cela est crucial si les rétines ne doivent être utilisées pour morphologiques, protéine, ou l’expression des gènes analyse puisque la rétine peut endommager le stress cellulaire ou la mort, qui pourrait modifier l’expression de phénotype ou gène cellulaire. En outre, après l’entraînement, complexes d’oeil-cerveau de 6 à 10 peuvent être isolés dans 10 à 15 min, facilitant le but de réduire au minimum la variabilité dans l’âge et le stade de développement du tissu oculaire disséqués.
La fixation et immunostaining entier-montez le protocole décrit ci-dessous convient pour la préparation des yeux de drosophile pour la microscopie de fluorescence. Rétines peuvent être incubées avec l’anticorps ciblant les protéines d’intérêt. Par exemple, anticorps dirigés contre des composants de jonction adherens peut être utilisé pour visualiser les circonférences apicales des cellules pour que les caractéristiques y compris le type de cellule, forme et la disposition peuvent être mises en recouvrement19. Avant la fixation, les yeux peut plutôt être clivé du cerveau aux fins d’extraction de protéine pour l’analyse de l’ouest, ou ARN devant servir à qRT-PCR ou RNA-sequencing.

<table><tbody><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Logiciel de traitement d’images</td><td>Adobe</td><td></td></tr><tr><td>Attelles en bambou, 6"&nbsp ;</td><td>Ted Pella Inc</td><td>116</td><td></td></tr><tr><td>Bêta-mercaptoéthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de bêta-glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50020</td><td></td></tr><tr><td>Plat</td><td></td><td></td> de dissection noir <td>Boîte de Pétri en verre remplie jusqu’au bord de SYLG170 ou de SYLG184 (colorée en noir avec de la poudre de charbon de bois finement moulue). Laisser à température ambiante pendant 24-48 h pour polymériser.</td></tr><tr><td>Porte-lame</td><td>Fine Science Tools</td><td>10053</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>comprimés cocktail d’inhibiteurs de protéase sans EDTA Roche</td><td></td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal (Zeiss LSM 501)</td><td>Microscope Carl Zeiss</td><td></td><td>ou similaire</td></tr><tr><td>Pyrocarbonate de diéthyle (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>40718</td><td></td></tr><tr><td>Ruban adhésif double face</td><td>3M</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila supports alimentaires, riches en nutriments&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>7,5 % de saccharose, 15 % de glucose, 2,5 % d’agar, 20 % de levure de bière, 5 % de peptone, 0,125 % de MgSO4.7H2O, 0,125 % de CaCl2.2H20</td></tr><tr><td>Drosophila milieux alimentaires, recette standard de</td><td></td><td></td><td>semoule de maïs Bloomington Drosophila Stock Center.&nbsp ; (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)</td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td> fixatrice <td>de formadehyde à 4 % dans du PBS, pH 7,4.</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence (microscope TCS SP5 DM)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>ou microscope similaire</td></tr><tr><td>Pinces&nbsp ;</td><td>Outils de sciences fines</td><td>91150-20</td><td>Les pinces doivent être affûtées fréquemment.</td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Verre Plats 9 puits&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td>Aussi connu sous le nom de plats à 9 puits&nbsp ;</td></tr><tr><td>Lamelles en verre (22 x 22 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope en verre (25 x 75 x 1 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-413</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri en verre</td><td>Corning</td><td>3160-100BO</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Image Studio version 5.2.5</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>Logiciel de traitement d’images pour la quantification des Western blots.</td></tr><tr><td>Tampon d’échantillon Laemmli</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td>Tampon d’échantillon de protéines concentré 2X, supplément de bêta-mercaptoéthanol selon les instructions du fabricant.</td></tr><tr><td>Marqueur de voie réduisant le tampon d’échantillons&nbsp ;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>39000</td><td>5X tampon d’échantillon de protéines concentrées.</td></tr><tr><td>Tubes microcentrigures&nbsp ;</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de microdissection.</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Plateaux Microwell (72 x 10 & micro ; Puits en L)</td><td>Nunc</td><td>438733</td><td></td></tr><tr><td>Média</td><td></td><td></td> de montage <td>0,5 % de N-propylgallate et 80 % de glycérol dans du</td></tr><tr><td>PBS N-propylgallate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130</td><td></td></tr><tr><td>PBS sans nucléases (PBS en 0,1 % de DEPC, pH 7,4)</td><td></td><td></td><td>Ajouter un volume approprié de DEPC au PBS, bien mélanger et incuber toute la nuit à température ambiante en remuant constamment. Autoclave pendant au moins 20 minutes. Stocker à 4&deg ; C</td></tr><tr><td>PBS (solution saline tamponnée au phosphate pH 7,4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368</td><td>Préparer selon les instructions du fabricant</td></tr><tr><td>PBS+pi (PBS plus inhibiteurs de la protéase et de la phoshatase)</td><td></td><td></td><td>10 mM de NaF, 1 mM de bêta-glycérol phosphate et 1 mM de Na3VO4 dans du PBS, pH 7,4. &nbsp ;</td></tr><tr><td>PBT</td><td></td><td></td><td>0,15 % TritonX et 0,5 % d’albumine sérique bovine dans PBS, pH 7,4</td></tr><tr><td>Porte-broche</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps primaire : chèvre anti-GAPDH</td><td>Imgenex</td><td>IMG-3073</td><td>Pour le western blot. Utilisé à 1:3000</td></tr><tr><td>Anticorps primaire : lapin anti-clivé Dcp-1</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>9578S</td><td>Pour l’immunofluorescence. Utilisé à 1:100</td></tr><tr><td>Anticorps primaire : anti-DEcad de rat</td><td>Études de développement Banque d’hybridomes</td><td>DCAD2</td><td>Pour l’immunofluorescence. Utilisé à 1:20</td></tr><tr><td>Anticorps primaire : rat anti-DEcad</td><td>DOI : 10.1006/dbio.1994.1287</td><td>DCAD1</td><td>&nbsp ; Don de Tadashi Uemura. Utilisé à 1:100.</td></tr><tr><td>Kit d’extraction d’ARN : Relia Prep Kit Miniprep pour les tissus d’ARN&nbsp ;</td><td>Promega</td><td>Z6110</td><td></td></tr><tr><td>Réactif de décontamination à la RNASE (RNase Away)</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7002</td><td></td></tr><tr><td>Lames de scalpel</td><td>Outils de science fine</td><td>10050</td><td>Casser un petit morceau de lame de scapel et le fixer dans le porte-lame.</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire : 488-conjugué à l’âne anti-rat IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-545-153</td><td>Pour l’immunofluorescence. Utilisé à 1:200</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire : chèvre conjuguée cy3 anti-lapin IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-165-144</td><td>Pour l’immunofluorescence. Utilisé à 1:100</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire : IgG (H+L) de chèvre anti-rat conjugué à HRPtechnologie</td> <td>de signalisation cellulaire</td><td>7077</td><td>Pour le western blot. Utilisé à 1:3000</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire : IgG (H+L) anti-chèvre de lapin conjugué à HRPjackJackson</td> <td>ImmunoResearch</td><td>305-035-003</td><td>Pour le western blot. Utilisé à 1:3000</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Fluorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215309</td><td></td></tr><tr><td>Vanadate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50860</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre (NanoDrop)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2000c&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Microscope stéréo de dissection (M60 ou M80)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>ou microscope similaire</td></tr><tr><td>Sylgard (noir)</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG170</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard (transparent)</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG184</td><td>Couleur noir avec poudre de charcol finement broyée</td></tr><tr><td>Tissu : Kimwipes</td><td>KIMTECH</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>TritonX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de trizma pH 7,5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille en tungstène, fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-10</td><td>Insérer dans le porte-goupille</td></tr><tr><td>Aiguille en tungstène, robuste Fine</td><td>Science Tools</td><td>10130-20</td><td>Insérer dans le porte-goupille</td></tr><tr><td>WTLB (tampon de lyse des tissus occidentaux)</td><td></td><td></td><td>150 mM de NaCl, 1,5 % de Triton X-100, 1 mM d’EDTA, 20 % de glycérol, 10 mM de NaF, 1 mM de bêta-glycérol phosphate et 1 mM de Na3VO4 dans 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5). Compléter avec une table de cocktail à protéase complète par solution de 10 ml.</td></tr><tr><td>Pâte de levure</td> <td>(supermarché local)</td><td></td><td>Environ 2 cuillères à soupe de levure Fleischmann’s ActiveDry (ou similaire) dissoute dans ~20 mL distillé H2O</td></tr></tbody></table>

dissection de la rétine de pupes de drosophile pour immunohistochimie, analyse occidentale et isolement d’arn

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

La rétine de pupes de Drosophila fournit un système excellent modèle pour l’étude des processus morphogénétiques pendant le développement. Dans cet article, nous présentons un protocole fiable pour la dissection de la rétine de pupes de Drosophila délicate. Notre approche chirurgicale utilise des outils de microdissection facilement disponibles pour ouvrir des pupes et extraire précisément complexes de l’oeil-cerveau. Ces peuvent être fixe, soumis à l’immunohistochimie et rétines puis montés sur lames de microscope et imagés si l’objectif est de détecter les structures cellulaires ou infracellulaires. Alternativement, interprétations rétines peuvent être isolées du tissu cérébral, lysées dans les tampons appropriés et utilisés pour gel électrophorèse ou ARNm extraction de protéine (évaluer l’expression de protéines ou de gènes, respectivement). Patience et pratique importante est requise pour maîtriser le protocole de microdissection décrit, mais une fois maîtrisé, le protocole permet d’isolement relativement rapide des rétines essentiellement intacts.

Le œil nymphal est un tissu facile d’accès qui sert un excellent modèle pour étudier les processus de développement de la morphogenèse de ce lecteur. Ici, nous avons disséqué les rétines et immunofluorescence permettant de détecter les jonctions adherens apicale (Figure 3 a, C) ou la caspase Dcp-1 (Figure 3D) qui est activé au cours de l’apoptose (Figure 3)25. Ces approches permettent d’obser...

Cet article présente une méthode chirurgicale dissection Drosophila pupes rétines ainsi que de protocoles pour le traitement du tissu pour l’immunohistochimie, l’Ouest analyse et extraction de l’ARN.

Dissection de la rétine de pupes de drosophile pour immunohistochimie, analyse occidentale et isolement d’ARN

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Ce protocole est significatif parce qu’il s’agit d’une méthode efficace pour l’isolement du tissu oculaire pupal Drosophila pour de multiples applications en aval. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet la dissection rapide d’un grand nombre d’yeux pupals sans endommager le tissu. La dissection de la rétine pupale de Drosophila sera difficile pour les novices.Pratiquer la technique est la meilleure façon d’améliorer la vitesse des dissections et la qualité des résultats. Après avoir placé la pupe de Drosophile sur un plat de dissecting noir, mentez un morceau frais de ruban adhésif à double face sur le plat disséquant, loin des nymphes, et utilisez une paire de forceps pour placer soigneusement le côté dorsale des pupes vers le haut sur la bande. Placez le plat sous un microscope stéréo, et utilisez des forceps pour enlever l’operculum de chaque pupe.Utilisez des ciseaux de microdissection pour trancher chaque cas pupal, lui permettant d’être ouvert pour révéler la tête, le thorax et le segment abdominal antérieur, et fixer les bords du boîtier pupal à la bande à double face. Percer l’abdomen de chaque pupe avec des forceps pointus, et enlever la pupe de son ca

dissection-drosophila-pupal-retina-for-immunohistochemistry-western

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Préparation de développement et de l&#39;adulte Drosophile Cerveaux et la rétine d&#39;imagerie en temps réel

Le facteur limitant dans l'utilisation de...

Simple Drosophile Dissection ommatidie et imagerie

Une approche standard pour préparer les...

Préparation des adultes Drosophile Yeux pour la coupe mince et analyse microscopique

L&#39;immunohistochimie drosophile Abdomen Nymphe

Dissection et immunohistochimique de larve, de nymphe et adulte<em&gt; Drosophila</em&gt; Rétines

Cette vidéo décrit comment disséquer et isoler le complexe œil-cerveau des pupes de drosophile. Le protocole présenté démontre la procédure permettant d’obtenir des tissus de haute qualité, compatibles, par exemple, avec l’immunomarquage, ainsi qu’avec d’autres expériences d’expression génique.

Dissection du complexe œil-cerveau à partir de pupes de mouches : une méthode pour isoler le tissu rétinien

Les structures adultes de la drosophile sont dérivées de structures en forme de sac appelées disques imaginaux. L’analyse de ces disques donne un aperçu de nombreux processus de développement, notamment la détermination des tissus, l’établissement des limites des compartiments, la prolifération cellulaire, la spécification du destin cellulaire et la polarité cellulaire planaire. Ce protocole est utilisé pour préparer des disques imaginaux pour la microscopie optique/fluorescente.

Dissection et Immunocoloration Imaginal disques de Drosophila melanogaster

L’objectif de cette technique est de permettre aux chercheurs d’effectuer la dissection, l’immunocoloration et le montage de disques oculaires nymphaux de Drosophila melanogaster de tout âge.

Dissection et de montage de<em&gt; Drosophila</em&gt; pupes disques yeux

La capacité de détecter avec précision les relevés de notes ou de protéines dans les tissus de la drosophile est critique pour étudier leur abondance et leur localisation liées au processus de développement. Voici la description d’une procédure simple pour disséquer les ailes pupes. Ces ailes peuvent être utilisées comme échantillons dans plusieurs techniques (immunohistochimie, PCR assay, etc.).

Une méthode rapide et efficace de disséquer les ailes Pupal de Drosophila adapté aux Immunodetections ou des analyses par PCR

Ce protocole décrit la dissection et immunostaining des adultes Drosophila melanogaster tissus du cerveau. Plus précisément, ce protocole met en évidence l’utilisation de Drosophila champignon corps et photorécepteur neurones comme des sous-ensembles neuronale exemple qui peuvent être utilisés avec précision afin de découvrir les principes généraux de nombreux aspects du développement neuronal.

Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster

Nous présentons ici un protocole pour organiser et disséquer à développer le tissu olfactif des espèces de drosophile . Le tissu découpé peut ensuite être utilisé pour des analyses moléculaires, comme quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) ou l’ARN séquençage (RNAseq), ainsi que des analyses in vivo , comme immunohistochemistry ou in situ hybridation.

Préparer le développement de tissu olfactif périphérique pour moléculaire et analyse Immunohistochemical chez la drosophile

Apprenez la dissection de la rétine de pupes de Drosophila melanogaster pour l'immunohistochimie, l'analyse occidentale et l'isolement d'ARN. Cette méthode efficace préserve l'intégrité tissulaire et permet d'isoler rapidement de nombreux yeux de pupes.

Dissection de la rétine de pupes de drosophile pour immunohistochimie, analyse occidentale et isolement d’ARN

Explorer plus de vidéos