Name: Étudier le Stress oxydatif causé par les streptocoques de groupe Mitis chez Caenorhabditis elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Découvrez comment étudier le stress oxydatif induit par les streptocoques de groupe Mitis chez Caenorhabditis elegans. Cette méthode permet d'analyser la pathogénicité et l'activation des réponses au stress.

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Nous remercions m. Bing-Yan Wang, Dr Gena Tribble (The University of Texas, école de médecine dentaire), Dr. Richard Lamont (Université de Louisville, école de médecine dentaire) et le Dr Samuel Shelburne (MD Anderson Cancer Center) pour la fourniture de laboratoire et des souches cliniques de Les streptocoques de groupe mitis. Nous remercions également m. Keith Blackwell (département de génétique, Harvard Medical School) pour les souches de c. elegans . Enfin, nous remercions le Dr Danielle Garsin et son laboratoire (The University of Texas, faculté de médecine de McGovern) pour la fourniture de réactifs et souches de ver pour mener l’étude. Certaines souches de ver ont été fournis par la CCG, qui est financée par le NIH bureau des programmes d’Infrastructure de recherche (P40 OD010440).

1. préparation de tes plaques de gélose (extrait de levure de Todd-Hewitt)
<ol><li>Pour 1 L de médias, ajouter 30 g de poudre de Todd-Hewitt, 2 g d’extrait de levure et 20 g d’agar dans un Erlenmeyer de 2 L. Ajoute le contenu de la fiole de 970 mL d’eau désionisée et comprend un bar de remuer. Autoclave les médias à une température de 121 ° C et une pression de 15 lb/po2 pendant 30 min. Par la suite, mettre les médias sur une plaque de remuer et le laisser pour refroidir en agitant doucement.</li>
	<li>Versez les médias dans des plats de pétri stérile fluxsol (plats de 100 x 15 mm pour la croissance et le maintien des bactéries, mets 35 x 10 mm pour le meurtre de dosages) sous une hotte à flux laminaire. Autoriser les médias à sécher pendant 2 h sous la hotte laminaire. Par la suite, les plaques peuvent être stockés à 4 ° C pendant 1 mois.</li>
</ol>2. préparation du milieu de croissance nématode (NGM) et Arni alimentation plaques (Arni NGM)
<ol><li>À l’aide d’une barre de remuer, dissoudre 2,5 g de peptone et 3 g de NaCl dans 970 mL d’eau désionisée dans une fiole d’Erlenmeyer de 2 L. Ajouter 20 g de gélose aux médias. Autoclave les médias à une température de 121 ° C et une pression de 15 lb/po2 pour 30 min. mettre les médias sur une plaque de remuer et laisser pour le refroidissement en remuant doucement.</li>
	<li>Ajouter les solutions suivantes aux médias pour la préparation des plaques NGM : 25 mL de tampon de phosphate de potassium 1 M (pH = 6,0), 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de cholestérol (5 mg/mL dans l’éthanol à 95 %) , 1 mL de nystatine (10 % v/w dans l’éthanol) et 1 mL de 25 mg/mL de streptomycine.</li>
	<li>Ajouter les solutions suivantes aux médias pour la préparation de l’ARNi NGM alimentation des plaques : 25 mL de tampon de phosphate de potassium 1 M (pH = 6,0), 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de cholestérol (5 mg/mL dans l’éthanol à 95 %) , 1 mL de nystatine (10 % v/w dans l’éthanol), 1 mL de carbénicilline 50 mg/mL et 1 mL de IM IPTG.</li>
	<li>Versez les médias dans 60 x 15 mm plats de pétri stérile sous hotte à flux laminaire. Autoriser les médias à sécher pendant 2 h sous la hotte laminaire. Par la suite, les plaques peuvent être stockés à 4 ° C pendant 1 mois.</li>
</ol>3. entretien de c. elegans
<ol><li>Semences les plaques NGM de détachage 50 µL de nuit cultivées OP50 d’e. coli dans le centre des plaques. La culture d’e. coli est préparée auparavant en milieu Luria-Bertani (LB) et stockée à 4 ° C pendant plusieurs mois. Recouvrir les plaques et les laisser sécher pendant 24 heures sous une hotte laminaire et ensuite stocker les plaques en polystyrène contenant.</li>
	<li>Sous un microscope à dissection, relever 10 à 12 adultes gravides à l’aide d’une pique de ver stérile et transférer les vers à un e. coli OP50 ensemencées plaque NGM. Incuber les plaques à 20 ° C jusqu’au lendemain.</li>
	<li>Le lendemain, retirer les adultes à l’aide d’une pique de ver stérile et laisser les embryons à développer pour les larves de L4 à 20 ° C (~2.5 jours).</li>
</ol>4. préparation de Population synchrone en âge de Worms
<ol><li>
Laver les adultes gravides de deux à quatre plaques NGM utilisant M9W et à leur rassemblement dans un tube conique de 15 mL.
	<ol>
<li>Pour préparer le M9W : mélanger 3 g de NaCl, 6 g de Na2HPO4et 3 g de KH2PO4 et à dissoudre dans un volume final de 1 litre d’eau désionisée. Autoclave la solution et ajouter 1 mL de 1 M MgSO4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Faites tourner le tube à 450 x g pendant 1 min, puis décanter le liquide surnageant tout en veillant à ce que le culot de ver reste intact.</li>
	<li>Ajouter 400 µL de 8,25 % d’hypochlorite de sodium (eau de Javel domestique) et 100 µL de 5 N NaOH pour préparer la solution de lyse ver. Ajouter la solution de lyse au culot ver et mélanger le contenu en effleurant le tube jusqu'à ce que 70 % vers adultes sont lysées. Périodiquement, observer le contenu du tube sous un microscope à dissection pour assurer il n’y a aucun surlessivage des oeufs.</li>
	<li>Diluer le mélange d’eau de Javel en ajoutant 10 mL de M9W au contenu du tube conique.</li>
	<li>Faites tourner le tube à 450 x g pendant 1 min. décanter surnageant, puis ajouter 10 mL de M9W.</li>
	<li>Répétez l’étape 4.5 deux fois plus.</li>
	<li>Resuspendre le culot de œuf qui en résulte dans 3 à 5 mL de M9W. Placer le tube sur un rotateur de tube. Laisser les tubes à tourner à une vitesse de 18 t/mn à température ambiante (RT) du jour au lendemain.</li>
	<li>Le lendemain, faites tourner le tube à 450 x g pendant 1 min granuler les larves L1. Supprimer la plupart des M9W par aspiration, laissant derrière eux de ~ 250 µL de liquide dans le tube. Remettre en suspension les larves L1 et gouttes de lieu trois 5 µL de la suspension de ver sur un couvercle de boîte de pétri, puis l’estimation du nombre de vers par µL à l’aide d’un microscope à dissection.</li>
</ol>5. l’induction de l’ARNi dans Worms
<ol><li>En utilisant une solution stérile de boucle ou pick, strie sur les souches désirés d’Arni contenant e. coli provenant des stocks congelés (bibliothèques Ahringer et Vidal) sur des plaques d’agar 100 x 15 mm LB contenant 50 µg/mL carbénicilline et 15 µg/mL de tétracycline. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 24 h.</li>
	<li>Choisissez et ensemencer une colonie isolée de la souche de RNAi désirée tubes coniques stérile de 15 mL, 2 ml de LB additionné de 50 carbénicilline µg/mL. Incuber les tubes à 37 ° C pendant 16 h dans un agitateur orbital à 150 tr/min.</li>
	<li>Le lendemain, étaler 150 µL de nuit cultivée culture sur plaques alimentation de 65 mm x 15 mm NGM Arni à l’aide d’un épandeur stérile. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 24 h.</li>
	<li>Laisser les plaques refroidir jusqu'à RT après incubation à 37 ° C. Ajouter un volume approprié de M9W contenant des larves L1 ~ 200 (obtenus auprès de la population en âge de synchrone des étapes vers) pour les e. coli graines NGM Arni plaques d’alimentation. Incuber les plaques à 20 ° C jusqu'à ce que les larves atteignent le stade de L4 (~2.5 jours).</li>
</ol>6. préparation des streptocoques du groupe Mitis pour Infection
<ol><li>-Ensemencer sur désiré souches de streptocoques sur le 100 mm x 15 mm ton agar (si les plaques étaient stockés à 4 ° C, préchauffer les plaques à 37 ° C avant les souches respectives des stries), puis incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit (~ 18 h) dans un pot de bougie fournissant un microaérophiles fr vironment pour la croissance des streptocoques (les géloses ensemencées peuvent être stockés pendant une semaine à 4 ° C).</li>
	<li>Pour repropager les isolats cliniques de streptocoques, utilisez gélose trypticase soja au sang. Incuber les plaques à 37 ° C dans un pot de bougie toute la nuit (~ 18 h).</li>
	<li>Le lendemain, enlever les plaques à partir du pot de bougie et prélever des colonies isolées à l’aide d’une anse stérile. Ensemencer le stériles tubes coniques 15 mL 2 mL de ton bouillon. Pour propager des isolats cliniques des streptocoques, compléter le THY bouillon avec 5 % v/v de sang de mouton. Fermer les bouchons étanches et incuber les tubes à 37 ° C dans des conditions statiques.</li>
</ol>7. des analyses de survie
Remarque : Les étapes de ce test sont représentés dans la Figure 1. Pour démontrer que l’H2O2 dérivé de la mitis groupe est responsable du meurtre du ver, de compléter les médias avec la catalase ou la souche mutante ΔspxB et de complément souche ΔspxB ; spxB + de S. gordonii peut être utilisé. SpxB code pour une oxydase de pyruvate, qui est responsable de la production de H2O2 dans le groupe de la mitis.
<ol><li>35 x 10 mm pour les préchauffer tes plaques à 37 ° C. Ajouter 80 µL de nuit cultures cultivées des souches de streptocoques désirés et transmettre la bactérie complètement à travers la surface de la gélose à l’aide d’un épandeur stérile. Incuber les plaques à 37 ° C dans un pot de bougie toute la nuit (~ 18 h). Comme contrôle, graine deux 35 mm x 10 mm NGM plaques 80 µl de nuit cultures cultivées d’e. coli OP50. Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit.</li>
	<li>Pour confirmer que la H2O2 produites par le groupe de la mitis est responsable de la mise à mort vers, ajouter 50 µL contenant 1 000 unités de catalase c sur la ta plaque. Répandre la solution de catalase, à l’aide d’un épandeur stérile et laisser les plaques sécher dans l’écoulement laminaire pour 30 min. semences les plaques par la suite avec les souches de streptococcus respectifs comme indiqué au point 7.1.</li>
	<li>Le lendemain, retirer les plaques du pot bougie et permettent de choisir les plaques refroidir à RT pendant 10-15 min. à l’aide d’un ver stérile, transfert 30 larves de L4 de la NGM ou RNAi NGM alimentation des plaques le streptocoque graines tes plaques. Utilisez les deux graines tes plaques avec un total de 60 vers par la souche de streptocoques. Incuber les boîtes à 25 ° C.</li>
	<li>À l’aide d’un microscope à dissection, compter le nombre de morts et vivants larves de L4 sur chaque plaque à plusieurs points. Au départ, marquer les vers comme morte ou vivre chaque 30 min. Par la suite, lorsque les vers commencent rapidement à mourir, leur score à intervalles de 15 min. Utiliser le prélèvement stérile ver doucement prod les vers et déterminer s’ils sont morts ou vivants. Un ver est considérée comme morte s’il n’y a aucun mouvement en réponse à l’insistance.</li>
	<li>L’analyse prendra 5-6 h pour terminer. Répétez l’expérience deux fois plus. À l’issue du test, mettre en commun les données provenant des deux plaques. Entrez les données de chaque groupe, comparer les courbes de survie et effectuer l’analyse de survie de Kaplan-Meier à l’aide d’un logiciel de statistique.</li>
</ol>8. préparation des coussinets de gel d’Agarose pour la microscopie
<ol><li>Dissoudre 2 % p/v d’agarose dans l’eau désionisée en chauffant la solution dans un four à micro-ondes. Un volume de 5 mL de solution est suffisant pour préparer 20 diapositives.</li>
	<li>Bande de laboratoire tenir sur la longueur le long de deux lames de verre. Ceci déterminera l’épaisseur des plaquettes d’agarose. Placez une lame de verre propre entre les deux diapositives collées.</li>
	<li>Place 100 µL d’agarose fondu sur le centre de la lame propre. Placer immédiatement un autre verre propre sur le dessus de l’agarose fondu et appuyer doucement pour faire un coussin. Permettre l’agarose à solidifier et à retirer par la suite la glissière supérieure. Le coussin de gel d’agarose est prêt à l’emploi.</li>
</ol>9. l’observation de la localisation de SKN-1 en réponse à l’Infection à streptocoque
Remarque : Les étapes de ce test sont représentés dans la Figure 2. Localisation de SKN-1 a été déterminée à l’aide de la souche de ver transgéniques SKN-1 b/C::GFP. Pour démontrer la localisation de SKN-1 en raison de la production de H2O2 par le groupe de la mitis, sauvage (WT), ΔspxB et le complément souche ΔspxB ; spxB + de S. gordonii ont été utilisés. Par ailleurs, le journaliste transgéniques souche SKN-1 b/C::GFP et la technique d’interférence d’Arni ont servi à démontrer que les composantes de la voie MAPK p38 réglementent la localisation de SKN-1.
<ol><li>35 x 10 mm pour les préchauffer tes plaques à 37 ° C. Ajouter 80 µL de nuit cultures cultivées des souches de streptocoques désirés et transmettre la bactérie complètement à travers la surface de la gélose à l’aide d’un épandeur stérile. Incuber les plaques à 37 ° C dans un pot de bougie toute la nuit (~ 18 h). Comme contrôle, graines trois 35 x 10 mm NGM plaques 80 µl de nuit cultures cultivées d’e. coli OP50. Ces incuber à 37 ° C pendant environ 18 h.</li>
	<li>Le lendemain, enlever les plaques à partir du pot de bougie et laisser les plaques refroidir à RT pendant 10-15 min. L4 lavage larves à l’aide de M9W de NGM et Arni NGM alimentation. Recueillir les vers dans les tubes coniques 15 mL.</li>
	<li>Faites tourner les tubes à 450 x g pendant 1 min. décanter le liquide surnageant et ajouter 10 mL de M9W.</li>
	<li>Répétez l’étape 9.3 trois fois plus.</li>
	<li>Remettre en suspension les vers en ~ 250 µL de M9W et place gouttes trois 5 µL de la suspension de ver sur un couvercle de boîte de pétri propre et estimer le nombre de vers par µL à l’aide d’un microscope à dissection.</li>
	<li>Ajouter 100 ~ L4 larves à chacun ton streptococcus épépiné et plaques NGM e. coli graines. Utiliser trois plaques par la souche de la bactérie. Incuber les boîtes pendant 2 à 3 h à 25 ° C.</li>
	<li>Par la suite, enlever les plaques de l’incubateur, lavez-les avec M9W et recueillir les vers dans les tubes coniques 15 mL.</li>
	<li>Laver les vers 3 x tel que décrit dans les étapes 9.3.</li>
	<li>Enlever la plupart de la M9W par aspiration et ajouter 500 µL de M9W contenant 2 mM sodium azide ou 2 mM tétramisole chlorhydrate au culot ver. Cela va anesthésier les vers, en veillant à ce qu’aucun mouvement ne lorsqu’imagée sous le microscope. Mise en garde : Utiliser l’équipement de protection individuelle (EPI) lors de la manipulation de l’azide de sodium. Préparer la solution d’azoture sous une hotte chimique.</li>
	<li>Incuber les pellets ver à ta pendant 15 min. Ensuite, repérez les 15 µL de la suspension de ver sur un bloc de prêts d’agarose. Placez délicatement un lamelle couvre-objet no 1.5 sur le pad d’agarose contenant les vers anesthésiés.</li>
	<li>À l’aide d’un microscope à fluorescence, visualiser la localisation de l’utilisation de SKN-1 filtre FITC et DAPI. Image vers à 10 x et 20 x grossissements.</li>
	<li>Marquer les vers selon le niveau de la localisation de SKN-1. Aucune localisation nucléaire, localisation de SKN-1 b/C::GFP dans l’antérieur ou postérieur du ver et localisation nucléaire de SKN-1 b/C::GFP dans toutes les cellules intestinales ne sont classés comme faible, moyen et des niveaux élevés de localisation, respectivement.</li>
	<li>Après avoir marqué la microscopie fluorescente, déterminer les différences statistiques par chi-squared et tests exacts de Fisher, à l’aide d’un logiciel de statistique.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Les méthodes décrites peuvent être utilisés pour d’autres bactéries pathogènes telles que Enterococcus faecium, qui produit aussi H2O2 cultivés en anaérobie ou26des conditions microaérophiles. En général, pour les plus pathogènes, il faut plusieurs jours à semaines pour réaliser les essais de survie. Toutefois, en raison de la production robuste de H2O2 par les membres du groupe mitis, ces épreuves pourraient être complétées dans les 5-6 h, dans...

Streptocoques du groupe Mitis sont commensaux humaine de la cavité oropharyngée1. Toutefois, ces organismes peuvent échapper à ce créneau et causer une variété de maladies invasives2. Les infections provoquées par ces micro-organismes incluent une bactériémie, endocardite et orbitaire2,3,4,5,6. En outre, ils font leur apparition des agents comme responsables de bactériémies à neutropéniques immunodéprimés et cancéreux qui ont subi une chimiothérapie5,7,8,9 .
Les mécanismes sous-jacents pathogenèse de groupe mitis est obscur, parce que quelques-uns des facteurs de virulence ont été identifiés. Le groupe de la mitis est connu pour produire H2O2, qui a montré à jouer un rôle important dans les communautés microbiennes orale10. Plus récemment, plusieurs études ont mis en évidence un rôle pour H2O2 comme une cytotoxine qui induit des cellules épithéliales mort11,12. Pneumonie de S., qui appartient à ce groupe, a été démontré pour produire des niveaux élevés de H2O2 qui induit des lésions de l’ADN et l’apoptose dans les cellules alvéolaires13. À l’aide d’un modèle animal de pneumonie aiguë, les mêmes chercheurs ont démontré que la production de H2O2 par les bactéries confère un avantage de virulence. Études sur la méningite à pneumocoques ont également montré que dérivé de pathogène H2O2 agit en synergie avec pneumolysin pour déclencher des cellules neuronales mort14. Ces observations établissent clairement que l’H2O2 produites par ce groupe de bactéries est important pour leur pouvoir pathogène.
Fait intéressant, il a également été démontré que les membres de la mitis du groupe S. mitis et s. oralis entraînent la mort de la nématode c. elegans , via la production de H2O215,16. Ce nématode libre a été utilisé comme un modèle simple, génétiquement tractable pour étudier de nombreux processus biologiques. Plus récemment, le ver est devenue un modèle pour l’étude de17,des interactions hôte-pathogène18. En outre, plusieurs études ont souligné l’importance d’étudier le stress oxydatif, à l’aide de cet organisme19,20,21. Son cycle de vie court, la capacité de knockdown gènes présentant un intérêt par Arni et l’utilisation de la protéine fluorescente verte (GFP)-fusible reporters pour contrôler l’expression des gènes sont quelques-uns des attributs qui en font un système modèle attrayant. Plus important encore, les voies qui régulent le stress oxydatif et l’immunité innée dans la vis sans fin sont hautement conservées avec mammifères20,22.
Dans le présent protocole, on démontre comment utiliser le c. elegans pour élucider le pouvoir pathogène causé par le streptocoque dérivés H2O2. Un test de survie mis à jour l’apparaît, tandis que les membres du groupe mitis sont capables de tuer les vers rapidement via la production de H2O2. À l’aide des membres du groupe mitis, une source biologique durable des espèces réactives de l’oxygène (ROS) est fourni, par opposition aux sources chimiques qui provoquent le stress oxydatif dans les vers. En outre, les bactéries sont capables de coloniser les vers rapidement, ce qui permet pour H2O2 à cibler directement les cellules intestinales (par rapport à d’autres sources qui ont à franchir plusieurs obstacles). L’essai est validé soit 1) par détermination de la survie de la souche mutante skn-1 ou 2) en abattant de skn-1 à l’aide d’Arni en vers par rapport à la N2 sauvage et vector control traité vers. SKN-1 est un facteur de transcription importante qui régule la réponse de stress oxydatif chez c. elegans23,24,25. En plus des essais de survie, une souche ver exprimant un journaliste transgénique SKN-1 b/C::GFP est utilisée pour contrôler l’activation de la stress oxydatif réponse via la production de H2O2 par le groupe de la mitis.

<table><tbody><tr><td><Milieux > forts et produits chimiques </Agarose ></td><td></td><td></td><td></td> forte</tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539-50G</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptone&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto Bouillon Todd Hewitt</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0492-17-6</td><td></td></tr><tr><td>BD BBL Sang de mouton, défibriné&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>B11947</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Agar&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco LB Bouillon</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-17-3</td><td></td></tr><tr><td>Gélose au sang (TSA avec sang de mouton)</td><td>Fisher Scientific</td><td>R01200</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilline</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26481</td><td></td></tr><tr><td>Catalase&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1345-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cholestérol</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10138201</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Fisher Scientific</td><td>MP21021012 Sulfate de</td><td></td></tr><tr><td>magnésium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Nystatine</td><td>Acros organics</td><td>AC455500050</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium Dibasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>8,25 % Hypochlorite</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de sodium Phosphate de sodium dibasique</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de streptomycine&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP910-50</td><td></td></tr><tr><td>Tétracycline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>87128-25G</td><td></td></tr> <tr><td>(&minus ;)-Chlorhydrate de tétramisole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-500&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td><Consommables >puissants" nbsp ; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubes à centrifuger coniques stériles en polypropylène&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-269</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques jetables en polystyrène 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-574</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques jetables en polystyrène 25 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-575</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri bactériologiques Falcon avec couvercle (35 mm x 10 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>n° 1,5 x 18 mm Couvercle Boîtes</td> de Pétri <td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td></td></tr><tr><td>avec couvercle transparent (60 mm x 15 mm)</td>Boîtes de Pétri <td>FB0875713A</td><td></td> <td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>avec couvercle transparent (100 mm x 15 mm)</td><td>Lames</td> de microscope <td>en verre ordinaire Fisher Scientific FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>(75 mm x 25 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td><Logiciel>strong&nbsp ; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacterial Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. oralis ATCC 35037</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. mitis ATCC 49456</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. gordonii DL1 Challis&nbsp ; &nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli OP50</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli HT115</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Worm Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strain</td><td>Genotype</td><td>Transgene</td><td>Source </td></tr><tr><td>N2</td> Isolat <td></td><td>sauvage de C. elegans</td><td>CGC</td></tr><tr><td>EU1</td><td>skn-1(zu67) IV/nT1 [unc- ?( n754) let- ?] (IV ; V)</td><td></td><td>CGC</td></tr><tr><td>LD002</td><td>IdIs1</td><td>SKN-1B/C ::GFP + rol-6(su1006)</td><td>Keith Blackwell</td></tr></tbody></table>

Étudier le stress oxydatif causé par les streptocoques de groupe mitis chez caenorhabditis elegans

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (c. elegans), un nématode libre, est devenue un modèle attrayant pour étudier les interactions hôte-pathogène. Le protocole présenté utilise ce modèle pour déterminer le caractère pathogène causé par le streptocoque du groupe mitis via la production de H2O2. Les streptocoques de groupe mitis sont une menace émergente qui provoquent de nombreuses maladies humaines telles que bactériémie, endocardite et orbitaire. Décrit ici est un protocole pour déterminer la survie de ces vers en réponse à H2O2 produit par ce groupe d’agents pathogènes. Utilisant le skn-1 gène codant pour un facteur de transcription de réponse de stress oxydatif, on montre que ce modèle est important pour l’identification des gènes hôtes essentiels contre une infection à streptocoque. En outre, il est démontré que l’activation de la réponse au stress oxydatif peut être surveillée en présence de ces agents pathogènes en utilisant une souche de ver journaliste transgéniques, dans lequel SKN-1 est fusionnée à la protéine fluorescente verte (GFP). Ces tests fournissent l’occasion d’étudier la réponse au stress oxydatif H2O2 résultant d’une source biologique par opposition à un exogène ajouté réactives de l’oxygène (dro) sources.

De la mitis, les membres du groupe S. mitis, S. oralis et S. gordonii rapidement tué les vers, par opposition à S. mutans, S. salivarius et non pathogène e. coli OP50 (Figure 3A). La médiane de survie pour S. mitis, S. oralis et S. gordonii était de 300 min 300 min et 345 min, respectivement. Pour déterminer si le meurtre a été véhiculé par H2O2</...

Le nématode Caenorhabditis elegans est un excellent modèle pour disséquer les interactions hôte-pathogène. Décrit ici est un protocole visant à infecter le ver avec des membres des mitis streptocoques et déterminer l’activation de la réponse au stress oxydatif contre H2O2 produites par ce groupe d’organismes.

Étudier le Stress oxydatif causé par les streptocoques de groupe Mitis chez Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Dans ce protocole, nous démontrons comment utiliser une méthode de vie libre c. elegans pour élucider la pathogénie causée par le peroxyde d’hydrogène produit par l’intermédiaire des streptocoques du Groupe Mitis. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons étudier la pathogénicité et l’activation des réponses au stress dans le ver en utilisant une source biologique durable d’espèces réactives d’oxygène par opposition aux sources chimiques Pour un litre de médias ajouter 30g de poudre Todd Hewitt, 2g d’extrait de levure et 20g d’ager à un flacon Erlin Myer de 2 litres.Ajouter 970 ml d’eau déionisée au contenu du flacon et mettre dans une barre d’agitation. Utilisez du papier d’aluminium pour couvrir l’ouverture. Autoclave le média dans le flacon à une température de 121 degrés Celsius et la pression de 15 livres par pouce carré pendant 30 minutes.Par la suite, mettre le flacon sur une plaque à remuer pour refroidir en remuant doucement. Sous une capuche laminaire, verser les médias dans des boîtes de Petri de taille appropriée et stériles. Laisser sécher les médias pendant 2 heures.Ensuite, conservez les assiettes à 4 degrés Celsius jusqu’à 1 mois. Avant la préparation des streptocoques du Groupe Mitis, réchauffer les plaques d’agar THY dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Après cela, utilisez une boucle stérile pour strier les souches désirées de streptocoques sur les lieux.Ensuite, mettez les assiettes dans un bocal à chandelles et couvez le bocal à 37 degrés Celsius pendant une nuit pendant environ 18 heures pour fournir un environnement microérophilique. Le lendemain, retirez les assiettes du bocal à chandelles et utilisez une boucle stérile pour ramasser les colonies isolées. Inoculer 15 ml de tubes coniques stériles contenant 2 ml de bouillon THY.Fermez les bouchons serrés et incubez les tubes à 37 degrés Celsius dans des conditions statiques. Les plaques THY préchauffées dans un incubateur à 37 degrés Celsius ajoutent 50 microlitres de solution contenant 1000 unités de catalase sur la plaque THY. Utilisez un épandeur stérile pour étendre la solution catalase et laisser sécher les plaques sur le capot d’écoulement laminaire pendant 30 minutes.Pour ensemencer les plaques avec les souches de streptocoque, utilisez une pipette pour ajouter 80 microlitres de cultures cultivées pendant la nuit à la plaque et utilisez un épandeur stérile pour propager complètement les bactéries à travers la surface de l’agar. Incuber les assiettes à 37 degrés Celsius dans un bocal à chandelles pendant la nuit. À titre de contrôle, sur deux plaques NGM, ajouter 80 microlitres de cultures cultivées pendant la nuit d’E.coli OP-50 pour l’ensemencement.Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, retirez les assiettes du bocal à chandelles et laissez refroidir les assiettes à température ambiante. À l’aide d’un pic de ver stérile, transférer 30 larves de L4 des plaques d’alimentation du MNM vers les plaques THY ensemencées par le streptocoque.Incuber les plaques à 25 degrés Celsius. Au microscope disséquant, compter le nombre de larves vivantes et mortes de L4 sur chaque plaque à plusieurs moments. Utilisez le pic de ver stérile pour propulser doucement les vers et déterminer s’ils sont morts ou vivants.Initialement, marquer les vers comme morts ou vivre toutes les 30 minutes. Lorsque les vers commencent rapidement à mourir, marquez-les à intervalles de 15 minutes. L’analyse prendra de 5 à 6 heures.Après cela, répétez l’expérience deux fois de plus. Pour préparer la garniture d’agarose, collez labtape dans le sens de la longueur le long de deux glissières en verre. Ceci déterminera l’épaisseur des garnitures d’agarose.Placez une glissière en verre propre entre les deux glissières enregistrées. Dissoudre l’agarose dans l’eau déionisée pour faire 2 pour cent de volume de poids et chauffer la solution dans un four à micro-ondes. Utilisez une pipette pour placer 100 microlitres d’agarose fondue au centre de la glissière propre.Placez immédiatement une autre glissière en verre propre sur le dessus de l’agarose fondue et appuyez doucement vers le bas pour faire un tampon. Laissez l’agarose se solidifier et retirez ensuite la glissière supérieure. Le tampon agarose est prêt à l’emploi.Plaques THY préchauffées à 37 degrés Celsius. Ensemencer les assiettes avec une souche de streptocoque comme cela a été fait précédemment dans les analyses de survie. Graine 3 plaques NGM avec E-coli OP-50 comme contrôle et incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain, refroidir les assiettes à température ambiante. Utilisez le tampon M9W pour laver les larves L4 des plaques d’alimentation NGM ou NGM RNAi en tubes coniques de 15 ml. Faire tourner les tubes à 450 fois g, pendant une minute dans une centrifugeuse.Décanter le supernatant et ajouter 10 ml de M9W à chaque tube. Répétez l’étape centrifuge trois fois de plus. Suspendre à nouveau les vers dans 250 microlitres de M9W et placer trois gouttes de 5 microlitres de la suspension du ver sur un couvercle de boîte de Pétri propre.Sous un microscope disséquant, estimer le nombre de vers par microlitre. À l’aide d’une pipette, ajouter environ 100 larves de L4 à chaque streptocoque THY épépiné et plaques ensemencées NGM E.coli. Utilisez trois plaques par souche de bactéries.Incuber les plaques pendant 2 à 3 heures à 25 degrés Celsius. Par la suite, retirer les assiettes de l’incubateur. Lavez-les avec M9W et recueillez les vers dans des tubes coniques de 15ml.Lavez les vers trois fois comme cela a été fait précédemment dans l’étape centrifuge. Supprimez la majeure partie du M9W par aspiration. Et ajouter 500 microlitres de M9W contenant 2 millimilliards d’azide de sodium ou hydrochlorure tétramisole à la pastille de ver pour l’anesthésie.Incuber le tube avec des granulés de ver à température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, déposez 15 microlitres de la suspension de ver sur un tampon d’agorose préparé. Au microscope fluorescent, visualisez la localisation des filtres Skn-1 à l’aide de filtres Fitzy et Dappy.Vers d’image à 10 fois et 20 fois grossissements. Marquer les vers en fonction de trois niveaux de localisation;faible localisation, où aucune localisation nucléaire n’est observée, localisation moyenne, avec SKN 1 BCGFP dans l’antérieur ou postérieur du ver, et localisation élevée, où la localisation nucléaire de skn-1 BCGFP est observée dans toutes les cellules intestinales. Dans cette expérience, les membres du Groupe Mitis ont rapidement tué les vers, par opposition à S.mutans, S.salivarius et non pathogène E.coli OP-50.Lorsque la catalase a été complétée à THY ager, le meurtre des vers a été aboli. La mort des vers n’a pas été observée sur la souche mutante delta spxB par rapport aux souches de type sauvage et compliment. Ces données suggèrent que le peroxyde d’hydrogène produit par le Groupe Mitis médie l’abattage des vers.Une diminution significative de la survie des vers knockdown skn-1 a été observée par rapport aux vers traités à la lutte antivectorielle. Un phénotype mortifuge similaire a été observé avec la souche mutante skn-1 et les vers de type sauvage N2. Cela démontre que skn-1 influencer la survie des vers sur le groupe Mitis.La localisation du SKN-1 BCGFP a été observée chez les vers exposés aux souches de N-compliment de type sauvage et non en réponse à la souche mutante Delta spxB des cordonae S. Après que des composants de la voie de kinase de carte P38 aient été renversés, la localisation réduite du BCGFP skn-1 et des vers traités de knockdown, par rapport aux vers traités de lutte antivectorielle, a été observée. En utilisant le streptocoque c.système elegans, les effets du peroxyde d’hydrogène sur le stress verticulaire endoplasmique, les dommages mitochondriaux, la mitophogie et la tophogie peuvent être étudiés plus avant. En outre, les mécanismes par lesquels le peroxyde d’hydrogène agit comme un facteur de virilescence pour obtenir des réponses immunitaires en perturbant les processus de base de la cellule peuvent être identifiés.

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Biologie du développement

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Source : Naji, A., et al. Étude du stress oxydatif causé par les streptocoques du groupe Mitis chez Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo démontre l’utilisation de SKN-1 marqué par une protéine fluorescente verte chez C. elegans pour surveiller le stress oxydatif en suivant la fluorescence verte. Les vers exposés à S. gordonii présentent une forte fluorescence nucléaire, confirmant un stress induit par les agents pathogènes, tandis que ceux nourris avec E. coli présentent une...

Visualisation du stress oxydatif induit par un pathogène chez C. elegans à l’aide de SKN-1 marqué GFP

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