Name: Étudier les effets normaux du rayonnement tissulaire à laide dhydrogels de matrice extracellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Apprenez une méthode de décellularisation douce pour étudier les effets du rayonnement sur la matrice extracellulaire du tissu adipeux mammaire murin. Cette technique permet d'évaluer les mécanismes de récidive tumorale.

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Les auteurs remercient la Dre Laura L. Bronsart d'avoir fourni les cellules GFP- et luciferase-4T1, le Dr Edward L. LaGory pour ses conseils sur 1-([Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol, le Dr Craig L. Duvall pour l'utilisation de l'IVIS et du lyophiliseur, et le Dr Scott A. Guelcher pour le rhéomètre utiliser. Cette recherche a été financée par les subventions des NIH #R00CA201304.

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<li>Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+5+1+facilitates+cancer+cell+invasion+through+enhanced+contractile+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces.</a> Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).</li>
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</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Cette méthode de formation d'hydrogel dépend en grande partie de la quantité de tissu de départ. Les MPF murines sont petits, et le processus de décellularisation entraîne une réduction significative du matériel (tableau 1). Le processus peut être répété avec plus de MFP pour augmenter le rendement final. Le fraisage est une autre étape importante qui peut entraîner la perte de matériel. D'autres ont montré le succès avec un moulin cryogénique, mais ce protocole est basé sur le fraisage par l'intermédiai...

Le cancer se caractérise par une prolifération excessive de cellules qui peuvent échapper à l'apoptose et métastasent également des sites éloignés1. Le cancer du sein est l'une des formes les plus courantes chez les femmes aux États-Unis, avec environ 266 000 nouveaux cas et 40 000 décès en 20182. Un sous-type particulièrement agressif et difficile à traiter est le cancer du sein triple négatif (TNBC), qui manque de récepteur d'oestrogène (ER), de récepteur de progestérone (PR), et de facteur de croissance épidermique humain (HER2). La radiothérapie est couramment utilisée dans le cancer du sein pour éliminer les cellules tumorales résiduelles après la tumorectomie, mais plus de 13% des patients de TNBC éprouvent toujours la répétition au site primaire de tumeur3.
On sait que la radiothérapie est efficace pour atténuer les métastes et les récidives parce que la combinaison de la tumorectomie et de la radiothérapie entraîne la même survie à long terme que la mastectomie4. Cependant, il a été récemment démontré que le traitement de rayonnement est associé à la répétition locale au site primaire de tumeur dans les arrangements immunocompromis5,6. En outre, il est bien connu que le rayonnement modifie la matrice extracellulaire (ECM) du tissu normal en induisant la fibrose7. Par conséquent, il est important de comprendre le rôle des changements induits par rayonnement DMC dans la dictée du comportement des cellules tumorales.
Les tissus décellularisés ont été utilisés comme modèles in vitro pour étudier la maladie8,9. Ces tissus décellularisés préservent la composition d'ECM et récapitulent le complexe in vivo ECM. Ce tissu décellularisé ECM peut être traité et digéré pour former des hydrogels ECM reconstitués qui peuvent être utilisés pour étudier la croissance cellulaire et la fonction10,11. Par exemple, les hydrogels injectables dérivés du lipoaspirate humain décellularisé et du tissu myocardique ont servi de méthodes non invasives d'ingénierie tissulaire, et un hydrogel dérivé du tissu pulmonaire porcin a été utilisé comme méthode in vitro de test l'attachement et la viabilité des cellules souches mésenchymales12,13,14. L'effet des dommages normaux de rayonnement de tissu sur des propriétés d'ECM, cependant, n'a pas été étudié.
Les hydrogels dérivés de l'ECM ont le plus grand potentiel d'étude in vitro des phénomènes in vivo. Plusieurs autres matériaux ont été étudiés, y compris le collagène, la fibrine et le matrigel, mais il est difficile de récapituler synthétiquement la composition de l'ECM13. Un avantage de l'utilisation d'hydrogels dérivés de l'ECM est que l'ECM contient les protéines et les facteurs de croissance nécessaires pour un tissu particulier14,15. L'irradiation du tissu normal pendant la tumorectomie provoque des changements significatifs à l'ECM, et les hydrogels ECM-dérivés peuvent être employés pour étudier cet effet in vitro. Cette méthode pourrait conduire à des modèles in vitro plus complexes et plus précis de la maladie.
Dans cette étude, nous avons soumis les coussinets de graisse mammaire murine (MFP) au rayonnement ex vivo. Les MFP ont été décellularisés et transformés en solution prégel. Les hydrogels ont été formés avec les cellules 4T1 incorporées, une ligne de cellules murine de TNBC. Les propriétés rhéologiques du matériel d'hydrogel ont été examinées, et la dynamique de cellules de tumeur ont été évaluées dans les hydrogels. Les hydrogels fabriqués à partir des MFPs irradiés ont amélioré la prolifération de cellules de tumeur. De futures études incorporeront d'autres types de cellules pour étudier les interactions cellules-cellules dans le contexte de la récidive du cancer après la thérapie.

<table><tbody><tr><td>Formol tamponné neutre à 10 %, cube avec embout</td><td>VWR</td><td>16004-128-2-méthylbutane</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Alfa Aesar</td><td>19387-AR</td><td></td></tr> <tr><td>2000ex Rhéomètre</td><td>TA Instruments</td><td>10D4335</td><td>rhéomètre</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine Sigma-Aldrich</td><td></td><td>A1933-25G-acécéine</td><td></td></tr> <tr><td>acétoxyméthyle (calcéine AM)</td><td>Molecular Probes, Inc.</td><td>C1430-D-Luciferin</td><td></td></tr> <tr><td>Lucifly, sel de potassium</td><td>Biosynth Chimie & Biologie</td><td>L-8820</td><td>(S)-4,5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylique sel de potassium</td></tr><tr><td>DPX Mountant for Histology</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>06522-500ML-Solution</td><td></td></tr> <tr><td>saline tamponnée au phosphate de Dulbecco</td><td>Gibco</td> <td>14040133-Eosin-Y</td><td></td></tr> <tr><td>avec phloxine</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>71304</td><td>eosine</td></tr><tr><td>ethidium homodimère</td><td>Sondes moléculaires, Inc.</td><td>E1169</td><td>ethidium homodimère-1 (EthD-1)</td></tr><tr><td>Sérum de bovin fœtal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926-500ML-Fisher</td><td></td></tr> <tr><td>Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td>Milieu d’enrobage cryostat</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>milieu d’enrobage aqueux</td></tr><tr><td>FreeZone 4.5</td><td>Labconco</td><td>7751020</td><td>lyophilisateur</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 Solution (20 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>colorant fluorescent bleu</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-500ML-IVIS</td><td></td></tr> <tr><td>Lumina III</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136334</td><td>système d’imagerie par bioluminescence</td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td></td><td>lingettes</td></tr> <tr><td>délicatesn-Propanol (sans peroxyde/séquençage), Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1130-500-Oil</td><td></td></tr> <tr><td>Red O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625-25G</td><td>1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphtol</td></tr><tr><td>OPS Diagnostics CryoGrinder</td><td>OPS Diagnostics, LLC</td><td>CG-08-02-PBS</td><td></td></tr> <tr><td>(10X), pH 7.4</td><td>Quality Biological, Inc.</td><td>119-069-151</td><td>Solution saline tamponnée au phosphate</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122-Pepsine</td><td></td></tr> <tr><td>de muqueuse gastrique porcine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887-5G</td><td>Pepsine</td></tr><tr><td>Acide peracétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77240-100ML-Réactif</td><td></td></tr> <tr><td>Phalloidin-iFluor 594 (ab176757)</td><td>abcam</td><td>ab176757</td><td>Conjugué</td></tr> <tr><td>de la phalloïdinePropylène glycol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W294004-1KG-K-Richard-Allan</td><td></td></tr> <tr><td>Scientific Signature Series Réactif de bleuissement</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>7301L</td><td>Agent bleuissant</td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific Signature Series Hématoxyline 7211</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>7211-RPMI</td><td></td></tr> <tr><td>Medium 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093-Désoxycholate</td><td></td></tr> <tr><td>de sodium, 98 %</td><td>Frontier Scientific</td><td>JK559522</td><td>acide désoxycholique</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016-Triton</td><td></td></tr> <tr><td>x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><<td>em>t-Octylphénoxypolyéthoxyéthanol</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol</td><td>Gibco</td><td>25200-056-Whatman</td><td></td></tr> <tr><td>papier filtre qualitatif, Grade 4</td><td>Whatman</td><td>1004-110</td><td>Papier filtre qualitatif de grade 4</td></tr><tr><td>Xylènes (certifié ACS), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>X5-4</td><td>-</td></tr></tbody></table>

Étudier les effets normaux du rayonnement tissulaire à l'aide d'hydrogels de matrice extracellulaire

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

La radiothérapie est une thérapie pour les patients atteints d'un cancer du sein triple négatif. L'effet du rayonnement sur la matrice extracellulaire (ECM) du tissu sain de sein et son rôle dans la répétition locale au site primaire de tumeur sont inconnus. Ici nous présentons une méthode pour la décellularisation, la lyophilisation, et la fabrication des hydrogels d'ECM dérivés des garnitures de graisse mammaire murine. Les résultats sont présentés sur l'efficacité du processus de décellularisation, et des paramètres rhéologiques ont été évalués. Les cellules de cancer du sein GFP- et luciferase-étiquetées encapsulées dans les hydrogels ont démontré une augmentation de la prolifération des hydrogels irradiés. Enfin, la coloration conjuguée de phalloidin a été employée pour visualiser l'organisation de cytosquelette des cellules encapsulées de tumeur. Notre objectif est de présenter une méthode de fabrication d'hydrogels pour l'étude in vitro qui imitent l'environnement in vivo des tissus mammaires et sa réponse au rayonnement afin d'étudier le comportement des cellules tumorales.

Les MFP ont été décellularisés à la suite de l'irradiation à l'aide de la procédure indiquée à la figure 1A. Les MPF pré-décellularisation (figure 1B) et post-décellularisation (figure 1C) sont montrés. La décellularisation a été confirmée à l'aide de l'hématoxylin et de l'éosine (H et E) tainingent, et 1-[4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol coloration a été utilisé pour évaluer la teneur en lipides (Figure 2). Les propriét...

Ce protocole présente une méthode pour la décellularisation et la formation suivante d'hydrogel des garnitures de graisse mammaire murine suivant l'irradiation ex vivo.

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Ce protocole montre que le rayonnement influence les propriétés de matrice extracellulaire du tissu adipeux dans la graisse mammaire murine. L’ajout de rayonnement dans un modèle de décellularisation n’a jamais été fait auparavant. Cette technique utilise plusieurs étapes de lavage qui servent chacune un but chimique unique dans le processus de décellularisation.La spécificité de cette technique permet des lavages chimiques plus doux, afin de mieux préserver les propriétés tissulaires. La rechute du cancer du sein survient après la thérapie, en particulier dans les cas triplement négatifs. L’évaluation de la façon dont la matrice extracellulaire irradié modifie le comportement des cellules tumorales mènera à des découvertes importantes sur les mécanismes de répétition.Après avoir irradié des échantillons, à l’aide d’une source de césium, transférez les MFP irradiés et les supports RPMI complets dans une armoire de biosécurité. Remplissez les plats de six centimètres ou de 10 centimètres avec suffisamment de supports pour submerger les MFP. Incuber à 37 degrés Celsius, avec 5% de dioxyde de carbone, pendant deux jours.Tout d’abord, placez les MFP dans des plats de six centimètres avec cinq millilitres de solution Trypsin-EDTA. Vaporiser et essuyer la vaisselle avec 70% d’éthanol et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. Utilisez des passoires de 0,7 millilitre pour laver les MFP avec de l’eau déionisée, en versant de l’eau sur le tissu trois fois.Utilisez des forceps pour masser manuellement les tissus entre les lavages. Ensuite, séchez brièvement le tissu sur une tâche délicate essuyez et pesez-le. Placer les tissus séchés dans un bécher pré-autoclavé, contenant une barre de remue-remuer de taille appropriée et couvrir les tissus de 60 millilitres de 3% t-octylphénoxypolyethoxyéthanol par gramme de tissu.Remuer pendant une heure à température ambiante. Puis jetez le contenu du bécher dans une passoire. Rincer le bécher à l’eau déionisée et verser sur les tissus.Répétez ce processus de rinçage deux fois de plus, en vous assurant d’utiliser des forceps pour masser manuellement les tissus entre les rinçages. Après cela, séchez brièvement le tissu sur une tâche délicate essuyer et peser. Remettre les tissus et les barres émottes dans les mêmes bechers et les couvrir de 60 millilitres d’acide désoxycholique à 4 % par gramme de tissu.Remuer à température ambiante pendant une heure. Ensuite, jetez le contenu du bécher dans une passoire en maille, rincez le bécher avec de l’eau déionisée et versez-le sur les tissus. Répétez ce processus de rinçage deux fois de plus, en vous assurant d’utiliser des forceps pour masser manuellement les tissus entre les rinçages.Séchez brièvement le tissu rincé sur un chiffon de tâche délicat et pesez-le. Placez les tissus séchés dans le même bécher, avec de l’eau déionisée fraîche, complétée par 1% de pénicilline-streptomycine. Couvrir le bécher hermétiquement de film de paraffine et laisser à 4 degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain, égoutter le contenu du bécher dans une passoire, sécher brièvement le tissu sur un chiffon tâche délicate et le peser. Ensuite, placez les MFP dans le même bécher avec une barre d’agitation de taille appropriée. Couvrir le tissu de 60 millilitres d’une solution contenant 4 % d’éthanol et 0,1 % d’acide périacétique par gramme de tissu.Remuer à température ambiante pendant deux heures. Jetez le contenu du bécher dans une passoire de 0,7 millimètre. Utilisez des forceps pour masser manuellement le tissu et remettre le contenu dans le bécher.Lavez le tissu en le couvrant de 60 millilitres de 1X PBS par gramme de tissu. Remuer à température ambiante pendant 15 minutes. Répétez tout ce processus de lavage une fois de plus.Ensuite, videz le contenu du bécher dans une passoire de 0,7 millimètre. À l’aide de forceps, masser manuellement le tissu et remettre le contenu dans le bécher. Lavez le tissu en le couvrant de 60 millilitres d’eau déionisée par gramme de tissu.Remuer à température ambiante pendant 15 minutes. Répétez tout ce processus de lavage une fois de plus. Séchez brièvement le tissu lavé sur un chiffon de tâche délicat et pesez-le.Jetez le tissu et le contenu dans une passoire et utilisez des forceps pour masser manuellement le tissu. Remettre le contenu dans le bécher et couvrir les tissus de 60 millilitres de 100% n-propanol par gramme de tissu. Remuer à température ambiante pendant une heure.Ensuite, séchez brièvement le tissu sur une tâche délicate essuyez et pesez-le. Jetez le tissu et le contenu dans une passoire de 0,7 millimètre et utilisez des forceps pour masser manuellement le tissu. Remettre le contenu dans le bécher et laver les tissus en le couvrant de 60 millilitres d’eau déionisée par gramme de tissu.Remuer à température ambiante pendant 15 minutes. Répétez ce processus de lavage trois fois. Après cela, séchez brièvement le tissu sur une tâche délicate essuyez et pesez-le.Transférer le tissu dans un tube étiqueté de 15 millilitres et congeler à 80 degrés Celsius négatif pendant la nuit. Tout d’abord, remplissez un récipient peu profond d’azote liquide. Retirez les échantillons du congélateur et pesez chaque MFP lyophilisé.Placez un échantillon dans le mortier, utilisez un gant cryogénique pour maintenir le mortier dans l’azote liquide. Ensuite, utilisez un pilon, attaché à une perceuse à main, pour moudre l’échantillon. Moudre en intervalles d’une minute pour vérifier la progression et retirer la main gantée de l’azote liquide.Répétez ce processus de fraisage pour tous les échantillons, en vous assurant de pulvériser et d’essuyer le mortier et le pilon avec de l’éthanol entre chaque échantillon. Conserver les échantillons en poudre dans des tubes de 15 millilitres à 80 degrés Celsius négatifs jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi. Pour commencer, retirez les échantillons du congélateur et décongelez à température ambiante.Pendant que les échantillons sont décongelés, mélanger la pepsine en acide chlorhydrique pour former une solution Pepsin-HCL. Ensuite, ajoutez de la poudre d’échantillon et la solution Pepsin-HCL à un tube de 15 millilitres, ajoutez une petite barre de remue-remuer et remuez pendant 48 heures. Après cela, placez les tubes sur la glace pendant cinq minutes.Ajouter 10X PBS à chaque échantillon, de sorte que la solution finale a une concentration de 1X PBS. Ensuite, ajoutez 10% de volume/volume, 0,1 hydroxyde de sodium molaire à chaque solution, pour atteindre le pH 7.4, en utilisant du papier pH pour tester chaque solution individuellement. À l’aide d’une solution de gel pH 7.4, réutilisez les cellules granulées GFP et luciferase étiquetées 4T1 à une concentration de 500 000 ou 1 000 000 cellules par millilitre de solution gel.Ajouter 16 microlitres de solution de cellules de gel à chaque puits d’une glissade de chambre de 16 puits et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après cela, ajouter 100 microlitres de supports RPMI complets à chaque puits. Continuer à couver à 37 degrés Celsius pendant 48 heures.Ensuite, utilisez un microscope à fluorescence pour observer les cellules à une longueur d’onde excitation de 519 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 618 nanomètres. Dans cette étude, des effets normaux de rayonnement de tissu sont étudiés, utilisant des hydrogels extracellulaires de matrice. La coloration de l’hématoxyline et de l’éosine est utilisée pour confirmer la décellularisation, par la perte de noyaux et d’autres traces d’ADN.Tandis que la coloration d’O rouge d’huile est employée pour évaluer la teneur en lipides et confirmer la conservation d’une morphologie de dipasite. Les propriétés rhéologiques des hydrogels ECM sont évaluées à 37 degrés Celsius. Le module de stockage est plus élevé que le module de perte pour toutes les conditions, démontrant la formation stable d’hydrogel.Les cellules mammaires 4T1 de carcinome 4T1 sont ensuite encapsulées dans les hydrogels. La prolifération cellulaire est examinée par microscopie de fluorescence, par des mesures d’illuminescence et des taches de viabilité, 48 heures après l’encapsulation. Les hydrogels irradiés montrent une tendance croissante dans la prolifération de cellules de tumeur.Phalloidin conjugué est utilisé pour visualiser F-Actin dans les cellules encapsulées. N’oubliez pas de refroidir le mortier avant de placer le tissu à l’intérieur du moulin, un mortier chaud peut conduire à un fraisage incomplet. Faire preuve de prudence lors de la manipulation de n-propanal et pepsine, seulement ouvert n-propanal et d’autres agents décellularisation sous une hotte chimique.Si possible, peser la pepsine sous une hotte chimique, car il ya un danger d’inhalation. Les changements de composition de l’ECM après l’irradiation et la décellularisation peuvent être évalués à l’aide de la spectrométrie de masse et de la spectroscopie Raman. En outre, la structure fibreuse des hydrogels ECM peut être analysée par microscopie électronique à balayage.Cette méthode a le potentiel d’être élargie pour examiner les effets du rayonnement sur, non seulement les cellules tumorales, mais aussi les cellules immunitaires, ainsi que les tissus qui éprouvent des dommages causés par la radiation, à la suite de la thérapie. Cette technique de décellularisation permettra aux chercheurs d’évaluer les propriétés extracellulaires de la matrice du tissu après le rayonnement, qui est une option de traitement importante dans la plupart des cancers.

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