Post-différenciation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation
28 août 2019
Ce protocole décrit une procédure détaillée pour resuspendre et cultiver les neurones dérivés de cellules souches humaines qui étaient précédemment différenciés des progéniteurs neuronaux in vitro pendant plusieurs semaines. La procédure facilite les essais basés sur l'imagerie des neurites, des synapses et des marqueurs neuronaux à expression tardive dans un format compatible avec la microscopie légère et le dépistage à haute teneur.
Ce protocole facilite l’utilisation de neurones pluripotents humains dérivés de cellules souches pour des applications de dépistage à haute teneur. Il est particulièrement bien adapté pour les synapses d’analyse, qui dans les neurones humains nécessitent de longues périodes de culture. Nous démontrons le replacage des neurones des plats grand format en puits multi compatibles HCS d’une manière qui préserve leur viabilité.
Contre-intuitivement, nous montrons que l’extension de l’incubation de la protéase avant la réépendance et le replacage donne une meilleure survie neuronale. Les neurones pluripotents humains dérivés des cellules souches sont de plus en plus pertinents dans les domaines de la recherche fondamentale, du développement de médicaments et de la médecine dégénérative. Cette méthode de titration douce peut être utilisée pour résuspendre toute grande monocposition de cellules ayant un réseau épais de processus.
En plus des iPSCs humains, il peut être utilisé pour replater la culture des neurones primaires ou pour les résuspendre pour le tri des faits ou le séquençage à cellule unique. Il est important de suivre attentivement les étapes des protocoles et de surveiller fréquemment le détachement médiatisé de la protéase des neurones de la plaque. Le temps d’incubation optimal peut varier selon la culture.
La démonstration visuelle permet même aux enquêteurs inexpérimentés de reproduire cette procédure. Commencez par rincer doucement la plaque des neurones différenciés avec PBS. Dispersez le PBS sur le mur de la plaque et non directement sur les cellules pour éviter de les perturber.
Aspirez le PBS du bord du plat tout en le faisant basculer, en prenant soin de ne pas toucher les cellules. Appliquer au moins un millilitre d’enzyme protéolytique par plaque de 10 centimètres. Et retourner les cellules à l’incubateur pendant 40 à 45 minutes.
Pendant l’incubation, vérifiez les neurones sur un microscope à contraste progressive et continuez le traitement par protéase jusqu’à ce que le réseau neuronal se détache complètement de la plaque et commence à se briser. Lorsque les neurones se sont détachés, arrêter la digestion en ajoutant cinq millilitres de médias DEMEM frais pour chaque millilitre de protéase. Utilisez une pipette sérologique pour titiller doucement les cellules contre la plaque cinq à huit fois, en vous assurant de ne pas appliquer trop de pression.
Filtrer les cellules à travers un maillage de 100 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres, goutte par goutte. Et rincez la passoire avec cinq millilitres supplémentaires de médias DMEM frais. Utilisez une centrifugeuse banc-dessus pour faire tourner les cellules vers le bas à 1000 fois G pendant cinq minutes.
Après centrifugation, retourner le tube conique à l’armoire de biosécurité et aspirer la plupart des médias, laissant 250 microlitres pour garder les cellules humides. Resuspendez doucement les cellules en deux millilitres de médias DMEM frais, puis passez-les à travers l’extrémité d’une pipette sérologique de cinq millilitres. Enfin, inverser le tube deux à trois fois.
Utilisez un hémocytomètre et un bleu tripan pour compter les cellules viables. Et puis DMEM à la concentration désirée. Ajoutez des suppléments appropriés au tube, selon les exigences de la lignée cellulaire spécifique et mélangez doucement les cellules en inclinant le tube conique deux à trois fois.
Aspirer le revêtement de laminine à partir d’une plaque de 24 puits et rincer une fois avec PBS. Aspirez le PBS. Et appliquer la solution cellulaire à chaque puits dans un mouvement figure huit pour éviter de s’agglutiner.
Une fois le placage fini des cellules, retourner la plaque à l’incubateur fixé à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Vortex brièvement la solution de stock du journaliste de mort de cellule tôt et l’ajoutez aux puits selon les directions manuscrites. Attends 20 minutes.
Et puis l’image des cellules vivantes et mortes sur le fond de verre multi puits. Prolonger l’incubation de la protéase permet de desserrer le réseau neuronal dans la feuille de cellules soulevée. Il en résulte une réduction de la mort cellulaire au moment de la dissociation ainsi que des résultats dans une récupération plus efficace au cours des jours suivants.
À l’aide de la procédure d’incubation prolongée des enzymes, les cultures présentent un doublement approximatif de la viabilité cellulaire au cours des jours qui ont après le replaqué et une densité plus faible de cellules mortes ou mourantes. La phase de transition de la différenciation neuronale se déroule sur plusieurs jours, au cours de laquelle les cellules expriment progressivement des marqueurs neuronaux à un stade avancé. Ces marqueurs sont immédiatement détectés dans les cultures qui ont été replacées après quatre semaines de pré-différenciation.
Le protocole étendu de protéase améliore également modérément la excroissance de neuride. La longueur totale de neuride et la croissance de dendrite sont améliorées. Le replating est également utile pour étudier les synapses.
Juste une semaine après le replacage, des marqueurs pour les protéines pré et post-synaptiques ont été observés. De plus, l’activité électrique provenant de la dépolarisation spontanée et des courants entraînés par synaptique est détectable à l’aide d’images calciques ou de tableaux multiélecrodés. Cette procédure de replaquement peut être adaptée à de nombreux types d’applications.
En plus du criblage à contenu élevé pour identifier les composés thérapeutiques potentiels, il pourrait être utilisé pour l’imagerie des cônes de croissance ou des enregistrements de réseaux multiélecrodes. La dissociation mécanique des neurones qui ont déjà formé de longs processus est stressante. L’incubation enzymatique allongée et la titration douce des cellules sont des étapes essentielles pour le succès de cette procédure.
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Aperçu
Ce protocole décrit une procédure de resuspension et de culture de neurones dérivés de cellules souches humaines différenciés in vitro. La méthode permet des tests d'imagerie des neurites, des synapses et des marqueurs neuronaux, adaptés aux applications de criblage à haut contenu.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie des cellules souches
- Techniques de culture cellulaire
Contexte
- Les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes humaines sont essentiels à l'étude des synapses.
- Ces neurones nécessitent des périodes de culture prolongées pour leur maturation.
- Améliorer la viabilité neuronale pendant la culture est essentiel pour des tests précis.
- La procédure améliore la récupération cellulaire et la viabilité après le repiquage.
Objectif de l'étude
- Mettre au point une méthode fiable pour la culture de neurones dérivés de cellules souches humaines.
- Démontrer un réensemencement efficace pour le criblage à haut contenu.
- Optimiser le temps d'incubation de la protéase pour améliorer la santé cellulaire.
Méthodes utilisées
- Méthode de culture cellulaire impliquant des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes humaines.
- Utilisation d'un traitement protéasique détaillé pour un détachement doux des cellules.
- Incorporation de contrôles visuels pour surveiller le détachement des neurones pendant les protocoles.
- Suivi d'un calendrier strict pour les processus d'incubation et de repiquage.
- La méthode est adaptable à d'autres types neuronaux et à diverses applications.
Résultats principaux
- Une incubation prolongée avec la protéase a amélioré la survie neuronale et réduit la mort cellulaire.
- Une augmentation de l'élaboration des neurites et de la viabilité a été observée pendant plusieurs jours après le repiquage.
- Des marqueurs pour les protéines synaptiques ont été observés dans la semaine suivant le repiquage.
- L'activité électrique était détectable, indiquant la formation de réseaux neuronaux fonctionnels.
Conclusions
- L'étude fournit un protocole reproductible pour la culture neuronale et les applications de tests.
- La survie améliorée et la croissance des neurites facilitent des recherches supplémentaires sur la fonction neuronale.
- Les résultats contribuent à la compréhension des mécanismes neuronaux et des pistes thérapeutiques potentielles.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Le réensemencement de neurones dérivés de cellules souches pluripotentes humaines permet un criblage à haut contenu de la neuritogenèse et de la maturation des synapses dans un délai raccourci, répondant ainsi au goulot d'étranglement que représentent les cycles de différenciation longs dans la découverte de médicaments. Cette approche permet des tests évolutifs et reproductibles pour la validation de cibles et le criblage phénotypique dans les modèles de maladies neurodégénératives. En améliorant la viabilité cellulaire et en préservant les réseaux fonctionnels après le réensemencement, la méthode renforce la fiabilité prédictive de l'évaluation précoce des composés.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques grâce à une évaluation évolutive de la croissance des neurites et de l'expression des marqueurs synaptiques dans des neurones humains.
- Valeur opérationnelle : Fournit un système reproductible pour la validation fonctionnelle de cibles à l'aide de marqueurs neuronaux de stade tardif tels que NeuN et CTIP2.
- Valeur prédictive : Facilite le tri du portefeuille en permettant une détection rapide des composés affectant la régénération des neurites et l'assemblage des synapses dans les deux semaines suivant le repiquage.
Tests et développement de dosages
- Valeur scientifique : Permet la préparation de neurones viables uniformément répartis dans des formats de 384 puits pour l'imagerie à contenu élevé de la longueur des neurites et des points synaptiques.
- Valeur opérationnelle : Assure la standardisation des tests par dissociation enzymatique et titrage doux, réduisant au minimum la variabilité due au stress mécanique.
- Extensibilité : Permet la réutilisation de la plateforme dans différentes études sur des bibliothèques de composés ou des perturbations géniques, avec un rendement cellulaire et une viabilité constants.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Préserve les phénotypes neuronaux pertinents pour la maladie, du stade de découverte à la validation préclinique, en maintenant les trajectoires de maturation synaptique.
- Dérisquage mécanistique : Permet de surveiller l'expression des protéines pré- et post-synaptiques ainsi que l'activité électrique comme paramètres fonctionnels d'engagement de la cible.
- Avancement ajusté au risque : Facilite les décisions d'aller/arrêt basées sur des mesures quantitatives de la neuritogenèse et de la synaptogenèse avant les études in vivo.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode de replatage établit un lien entre la découverte précoce et les flux de travail précliniques en fournissant un modèle neuronal évolutif compatible avec les délais des criblages à haut contenu.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques grâce à l'imagerie quantitative de l'élargissement des neurites et de l'arborisation dendritique.
- Tri : Assure la préparation et la reproductibilité des tests par une dissociation et un réensemencement standardisés dans des formats multi-puits.
- Analytique : Permet la comparaison de conditions à l’aide de paramètres mesurables tels que la longueur totale des neurites, la croissance dendritique et l’intensité du signal des protéines synaptiques.
- Recherche translationnelle : Assure la continuité préclinique par la détection de l'activité électrique spontanée et des courants induits synaptiquement après réensemencement.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une capacité reproductible d’ensemencement neuronal, utilisable dans divers types de tests et campagnes de tri.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en réduisant l'ambiguïté mécanistique dans les tests de formation des neurites et des synapses.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et l'extensibilité grâce à une titration définie des protéases et des étapes de resuspension douces.
- Valeur stratégique : Optimise l'efficacité du capital en raccourcissant le délai d'exécution des tests pour des phénotypes neuronaux matures.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des composés en fonction de leur efficacité précoce en matière de néuritogenèse et de synaptogenèse.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture neuronale dérivée de cellules souches et en techniques de dissociation enzymatique.
- Dépend de l'accès à une microscopie en contraste de phase pour surveiller le détachement du réseau neuronal pendant l'incubation avec la protéase.
- Exige des protocoles standardisés concernant la concentration de la protéase, le temps d'incubation et le titrage afin d'assurer une cohérence entre lots.
- Requiert l'adaptation des densités d'ensemencement et de revêtement lors du passage entre différents formats de plaques multi-puits.
- Les limites pratiques incluent la variabilité du temps d'incubation optimal avec la protéase selon les lignées cellulaires et les stades de différenciation.
