Post-différenciation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Ce protocole facilite l’utilisation de neurones pluripotents humains dérivés de cellules souches pour des applications de dépistage à haute teneur. Il est particulièrement bien adapté pour les synapses d’analyse, qui dans les neurones humains nécessitent de longues périodes de culture. Nous démontrons le replacage des neurones des plats grand format en puits multi compatibles HCS d’une manière qui préserve leur viabilité.

Contre-intuitivement, nous montrons que l’extension de l’incubation de la protéase avant la réépendance et le replacage donne une meilleure survie neuronale. Les neurones pluripotents humains dérivés des cellules souches sont de plus en plus pertinents dans les domaines de la recherche fondamentale, du développement de médicaments et de la médecine dégénérative. Cette méthode de titration douce peut être utilisée pour résuspendre toute grande monocposition de cellules ayant un réseau épais de processus.

En plus des iPSCs humains, il peut être utilisé pour replater la culture des neurones primaires ou pour les résuspendre pour le tri des faits ou le séquençage à cellule unique. Il est important de suivre attentivement les étapes des protocoles et de surveiller fréquemment le détachement médiatisé de la protéase des neurones de la plaque. Le temps d’incubation optimal peut varier selon la culture.

La démonstration visuelle permet même aux enquêteurs inexpérimentés de reproduire cette procédure. Commencez par rincer doucement la plaque des neurones différenciés avec PBS. Dispersez le PBS sur le mur de la plaque et non directement sur les cellules pour éviter de les perturber.

Aspirez le PBS du bord du plat tout en le faisant basculer, en prenant soin de ne pas toucher les cellules. Appliquer au moins un millilitre d’enzyme protéolytique par plaque de 10 centimètres. Et retourner les cellules à l’incubateur pendant 40 à 45 minutes.

Pendant l’incubation, vérifiez les neurones sur un microscope à contraste progressive et continuez le traitement par protéase jusqu’à ce que le réseau neuronal se détache complètement de la plaque et commence à se briser. Lorsque les neurones se sont détachés, arrêter la digestion en ajoutant cinq millilitres de médias DEMEM frais pour chaque millilitre de protéase. Utilisez une pipette sérologique pour titiller doucement les cellules contre la plaque cinq à huit fois, en vous assurant de ne pas appliquer trop de pression.

Filtrer les cellules à travers un maillage de 100 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres, goutte par goutte. Et rincez la passoire avec cinq millilitres supplémentaires de médias DMEM frais. Utilisez une centrifugeuse banc-dessus pour faire tourner les cellules vers le bas à 1000 fois G pendant cinq minutes.

Après centrifugation, retourner le tube conique à l’armoire de biosécurité et aspirer la plupart des médias, laissant 250 microlitres pour garder les cellules humides. Resuspendez doucement les cellules en deux millilitres de médias DMEM frais, puis passez-les à travers l’extrémité d’une pipette sérologique de cinq millilitres. Enfin, inverser le tube deux à trois fois.

Utilisez un hémocytomètre et un bleu tripan pour compter les cellules viables. Et puis DMEM à la concentration désirée. Ajoutez des suppléments appropriés au tube, selon les exigences de la lignée cellulaire spécifique et mélangez doucement les cellules en inclinant le tube conique deux à trois fois.

Aspirer le revêtement de laminine à partir d’une plaque de 24 puits et rincer une fois avec PBS. Aspirez le PBS. Et appliquer la solution cellulaire à chaque puits dans un mouvement figure huit pour éviter de s’agglutiner.

Une fois le placage fini des cellules, retourner la plaque à l’incubateur fixé à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Vortex brièvement la solution de stock du journaliste de mort de cellule tôt et l’ajoutez aux puits selon les directions manuscrites. Attends 20 minutes.

Et puis l’image des cellules vivantes et mortes sur le fond de verre multi puits. Prolonger l’incubation de la protéase permet de desserrer le réseau neuronal dans la feuille de cellules soulevée. Il en résulte une réduction de la mort cellulaire au moment de la dissociation ainsi que des résultats dans une récupération plus efficace au cours des jours suivants.

À l’aide de la procédure d’incubation prolongée des enzymes, les cultures présentent un doublement approximatif de la viabilité cellulaire au cours des jours qui ont après le replaqué et une densité plus faible de cellules mortes ou mourantes. La phase de transition de la différenciation neuronale se déroule sur plusieurs jours, au cours de laquelle les cellules expriment progressivement des marqueurs neuronaux à un stade avancé. Ces marqueurs sont immédiatement détectés dans les cultures qui ont été replacées après quatre semaines de pré-différenciation.

Le protocole étendu de protéase améliore également modérément la excroissance de neuride. La longueur totale de neuride et la croissance de dendrite sont améliorées. Le replating est également utile pour étudier les synapses.

Juste une semaine après le replacage, des marqueurs pour les protéines pré et post-synaptiques ont été observés. De plus, l’activité électrique provenant de la dépolarisation spontanée et des courants entraînés par synaptique est détectable à l’aide d’images calciques ou de tableaux multiélecrodés. Cette procédure de replaquement peut être adaptée à de nombreux types d’applications.

En plus du criblage à contenu élevé pour identifier les composés thérapeutiques potentiels, il pourrait être utilisé pour l’imagerie des cônes de croissance ou des enregistrements de réseaux multiélecrodes. La dissociation mécanique des neurones qui ont déjà formé de longs processus est stressante. L’incubation enzymatique allongée et la titration douce des cellules sont des étapes essentielles pour le succès de cette procédure.