Étude sur le métabolisme de six insecticides systémiques dans une culture de suspension cellulaire nouvellement établie dérivée du thé (Camellia Sinensis L.) feuilles

Le thé est l’une des boissons les plus populaires dans le monde entier. Les pesticides sont parfois utilisés pour protéger les plantes de thé contre les parasites. Certains pesticides systémiques peuvent être fabriqués pour cela par des enzymes dans l’arbre à thé.

Et ensuite intégré par oxydation, hydrolyse, ou réactions de réduction. Les cultures de suspension cellulaire végétale peuvent être utilisées comme un, facilement pour étudier le comportement du métabolisme des plantes des pesticides. Cette méthode présente plusieurs avantages.

Tout d’abord, il peut être exploité dans des conditions de micro-organismes libres, évitant ainsi l’interférence de la dégradation des pesticides causée par les microbes. Deuxièmement, il peut fournir du matériel constant pour nous à tout moment. Enfin, il peut également être utilisé facilement pour comparer les théories du comportement des pesticides lors d’une seule expérience.

Dans cette étude, nous établissons des cultures de suspension de cellules de thé à partir de couleurs variables de feuilles de thé. L’état optimal des cultures des suspensions cellulaires a ensuite été utilisé pour comparer le comportement de dissipation de six pesticides. Cette expérience sera menée par Jiao Weiting et Ge Guoqin.

C’est nos plantules stériles de thé qui fonctionne comme source d’explant. Couper le long de l’aile centrale d’une feuille stérile à l’aide de ciseaux. Et puis, subdiviser chaque moitié en petits morceaux d’environ 0,3 fois 0,3 centimètres dans une boîte de Pétri.

Placez les explantations stériles sur le milieu visuel ms contenant 2, 4-D et KT. Six explants peuvent être placés dans un flacon de 300 millilitres. Culture des explantations de feuilles à une température constante de 25 degrés Celsius dans l’obscurité. Après 28 jours, sélectionnez la première génération de callus induit, puis transférez-le en flacon frais.

Acquérir le callus lâche et variable après trois à quatre sous-cultures. Couper les gros, les callosités variables et lâches du milieu solide en petits morceaux à l’aide d’une lame chirurgicale stérile dans des conditions stériles. On est à environ trois grammes des petits morceaux d’un callus.

Placez le callus en B5 contenant 2, 4-D et l’AC. Culture de la suspension cellulaire liquide à une température constante dans l’incubateur secouant dans l’obscurité. Après sept à dix jours de culture, retirez le flacon de culture et laissez-les reposer quelques minutes. Prenez le surnatant car les sédiments ici forceront la culture à un milieu frais.

Retirer les gros callosités précipités. Obtenez la culture finale de suspension cellulaire bien entretenue après quatre à trois cycles de sous-culture de 28 jours chacun. Gardez un échantillon de cellules vivantes à cent degrés Celsius pendant dix minutes comme cellule de contrôle avant la coloration de viabilité.

Centrifugeuse toute la culture de suspension cellulaire pendant huit minutes à 6000 G.Retirez le supernatant avant de suspendre les cellules en 5 millilitres de tampon PBS et secouez-le pendant une minute à la main. Ajouter 2,5 millilitres de la solution TTC et serrer à nouveau la main. Incuber le mélange pendant une heure dans un incubateur debout à 13 degrés Celsius.

Ajoutez un aliquot de quatre cents microlitres en vue de stériliser la solution de stock de tous les néonicotinoïdes Thiamethoxam, Acetimoprid, Imidacloprid, et Imideproxase. Tout cela à la première phase organique. Dimethoate et omethoate dans les cultures de suspension cellulaire respectivement.

Échantillons de culture de suspensions cellulaires avec des insecticides à température constante, et secouant la vitesse de l’incubateur. Prélevez les échantillons à différents jours. Pour tester l’échantillon contenant un néonicotinoïde, retirez un aliquot de 1 millilitre de la culture cellulaire homogène.

Placez-le dans un tube de centrifugeuse en plastique de 1,5 millilitre, et centrifugez-le à 4000 G pendant deux minutes. Passez le supernatant à travers une membrane de filtre de 0,22 micromètre avant analyse par HPLC-UV et UPLC QTOF. Pour tester l’échantillon, continuer dans la première phase organique.

Retirez un aliquot de 500 microlitres de la culture cellulaire et placez-le dans un tube de centrifugeuse de 35 millilitres ou un tube de centrifugeuse en plastique de 1,5 millilitre. Ajouter 0,1 gramme de chlorure de sodium et cinq millilitres extraire le solvant dans le tube de centrifugeuse de 35 millilitres des 500 échantillons de microlitres. Vortex le mélange pendant une minute.

Et puis laissez-les se reposer pendant 10 minutes. Prenez 2,5 millilitres de supernatant dans un tube de verre de 10 millilitres et évaporez-vous à la quasi-sécheresse à l’aide d’un évaporateur d’azote à 14 degrés Celsius. Dissoudre les résidus avec un millilitre d’acétone.

Vortex pendant une minute, passez-le à travers une membrane de filtre de 0,22 micromètre avant l’analyse par GC-FPD. Mettez cinq plantes dans des pots en plastique de quatre litres pendant quinze jours. Ajouter zéro microgramme par millilitre ou 100 microgrammes par millilitre de Thiamethoxam ou de diméthoaxe dans des pots en plastique, respectivement.

Préparer l’échantillon de plante intact selon la méthode précédente, à l’exception du pré-trempage, puis analyser par spectrométrie de masse Orbitrap. Utilisez un HPLCUV pour détecter le contenu et les produits métaboliques du Thiaméthoxam et de l’Acetimopride à des longueurs d’onde de 254 nanomètres, et de l’imidaclopride et de l’imideproxase à 270 nanomètres. Détectez le contenu du dimethoate et de l’omethoate par GC-FPD à l’aide d’une colonne tubulaire.

Détecter les métabolites des insecticides dans la culture cellulaire à l’aide de l’UPRC QTOF avec une colonne Carbone-18. Détecter les métabolites d’insecticides dans l’extrait des plantes d’essai à l’aide de la spectrométrie de masse UPLC Orbitrap. Le callosité d’une plante stérile a une contamination plus faible brunissement, mais une inductivité plus élevée que celle du callosité à partir de feuilles de thé cueillies.

Le callus dérivé des feuilles stériles était toujours jaunâtre vif, tandis que le callus dérivé des feuilles cueillies était blanc avec des taches brunes. Quand la concentration d’AC était 0.1 milligramme par litre, le callus était jaunâtre dans la couleur et lâche dans la texture. Le taux de croissance du callus était le plus élevé, jusqu’à 61,5%, lorsque la concentration de 2, 4-D était d’un milligramme par litre avec la concentration d’AC était de 0,5 milligramme par litre.

Les données de croissance du callus était le meilleur et le taux de croissance du callus a été le plus élevé atteint 46,9%Par conséquent, la meilleure combinaison de homent plante était un milligramme par litre de 2, 4-D et 0,1 milligramme par litre d’AC pour la croissance du callus thé. Le callus couvrait complètement les feuilles par la quatrième sous-culture, et quand le cycle de sous-culture était de 28 jours. Le callus avait grandi vigoureusement avec la couleur jaunâtre et la texture lâche et aucun brunissement.

Après avoir comparé les données brutes du callus et la couleur de la suspension cellulaire, le milieu liquide B5 était plus approprié pour la culture de suspension cellulaire. La valeur od de la culture de suspension cellulaire a été utilisée pour représenter la quantité de croissance cellulaire. Pendant les 75 jours de culture, le rapport de 15 grammes par 40 millilitres avait une valeur d’OD significativement plus élevée que celle des deux autres rapports.

La viabilité cellulaire dans la culture de suspension de cellules de thé a été examinée par la coloration de TTC. Le composé incolore TTC peut être converti en formadin rouge par déshydrogénase dans les mitochondries des cellules vivantes, mais la couleur ne peut pas être changée dans les cellules mortes. Et c’est tout le processus d’établissement d’une culture de suspension de cellules de thé.

Il s’agit de la première étude comparative du métabolisme des différents pesticides dans le thé en utilisant une technique de culture de suspension cellulaire. Plusieurs métabolites de pesticides ont été identifiés, et certains d’entre eux ont été étudiés plus avant dans les usines de thé gardées. Cette nouvelle méthode pourrait servir de modèle pour les études métaboliques sur les pesticides dans le thé ou d’autres plantes.