Purification et la Transplantation de cellules progéniteurs myogéniques dérivé Exosomes afin d’améliorer la fonction cardiaque chez les souris dystrophiques musculaires de Duchenne

Ce protocole présente la méthode pour améliorer de façon transitionnaire la fonction cardiaque chez les souris dystrophie musculaire de Duchenne en transplantant l’exon dérivé des cellules progénitrices myogéniques normales. La transplantation exosomale peut améliorer la fonction cardiaque chez les souris DMD en association avec l’expression accrue de la dystrophie dans les coeurs destinataires. La méthode appropriée pour l’isolement d’exon, la purification, et la transplantation intramyocardique contribuent au succès de la transplantation d’exon pour améliorer la fonction cardiaque pour des souris avec Duchenne' dystrophie musculaire de s.

La thérapie exosome MPC-dérivée pourrait améliorer la fonction squelettique de muscle par le transfert normal exosome-médié de dystrophine d’ARNm. Cette vidéo démontre les techniques critiques pour la purification exosome, la livraison exosome intramyocardique, et l’échocardiographie post-transplantation. La démonstration de l’échocardiographie sera faite par Yan Shen, technicien de notre laboratoire.

Pour commencer cette procédure, les semences cinq millions de cellules C2C12 dans un plat de culture de 15 centimètres avec 20 millilitres de DMEM complet contenant 10%FBS et antibiotiques. Incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Ensuite, utilisez un rotor balançant seau à l’ultracentrifugeuse FBS à 100 000 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 18 heures pour préparer un milieu appauvri en exosome.

Jeter la pastille et recueillir le supernatant. Lorsque les cellules monocouches atteignent 80% de confluence dans le plat de culture, remplacez le DMEM complet par un milieu exosome-épuisé. Utilisez une pipette de transfert pour recueillir le supernatant dans le plat de culture cellulaire toutes les 48 heures.

Centrifuger les tubes à 150 fois G pendant dix minutes pour enlever les cellules restantes. Filtrez le supernatant à travers un filtre de 0,22 micromètre pour éliminer les débris cellulaires et transférer les tubes filtrés moyens à ultra-clairs. Ensuite, utilisez un rotor de seau pivotant pour ultracentrifuger les tubes à 100 00 fois G et à 4 degrés Celsius pendant 120 minutes pour précipiter les exosomes.

Resuspendez la pastille contenant de l’exosome dans PBS, puis remplissez l’ensemble du tube ultra-clair avec PBS. Ultracentrifugeuse cette suspension à 100,00 fois G et à 4 degrés Celsius pendant 120 minutes pour éliminer les protéines contaminantes. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille exosome dans 100 microlitres de PBS.

Conserver à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation future. Tout d’abord, fixer chaque souris anesthésiée dans la position supine sur une plate-forme chirurgicale en sécurisant chaque membre avec du ruban adhésif. Placez une suture 3-0 horizontalement sous les dents supérieures pour maintenir la mâchoire supérieure en place.

Ensuite, appliquez de la crème depilatory sur le côté gauche de la poitrine de la souris pour enlever le sapin de la peau. À l’aide d’un cathéter de calibre 24, effectuez une intubation endotracheal par la cavité buccale. Et utilisez un ventilateur de rongeurs pour ventiler la souris avec de l’air de pièce à une vitesse de 195 respirations par minute.

Désinfecter la peau avec 70% d’alcool et 10% d’iode povidone. Ensuite, faire une incision oblique de 10 à 15 millimètres du bord sternal gauche à l’aisselle gauche. Utilisez des ciseaux pour couper le pectoralis majeur et pectoralis mineur.

Et faire une thoracotamy gauche à travers le quatrième espace intercoastal. Insérez doucement des bandes rétractables pour étendre la cavité thoracique à une largeur de 10 millimètres en prenant soin de ne pas endommager le poumon gauche. Après cela, utilisez deux pinces droites pour enlever le péricarde.

Séparez-les et placez-les derrière les pointes de rétracteur pour exposer le cœur. Utilisez une aiguille d’insuline de calibre 31 pour injecter mpc-exo ou PBS intramyocardially dans la paroi antérieure du ventricule gauche à un endroit. Ensuite, utilisez des sutures en nylon 6-0 pour fermer la cavité thoracique, les muscles pectoralis, et la peau, dans l’ordre.

Deux jours après la transplantation exosome PBS, anesthésier les souris comme décrit dans le protocole de texte. Utilisez du ruban adhésif pour fixer une souris en position supine et appliquez du gel acoustique préchauffé sur la poitrine gauche. Ensuite, utilisez l’échocardiographie pour évaluer la fonction ventriculaire gauche.

Obtenez la vue parasternale à long axe du ventricule gauche en deux dimensions, puis faites pivoter la sonde à ultrasons à 90 degrés pour obtenir une vue de l’axe court ventricule gauche au niveau du muscle papillaire. Après cela, enregistrez des images échocardiographiques de M-mode et mesurez le diamètre ventriculaire gauche end-diastolique, le volume ventriculaire gauche d’extrémité-systolique, le volume ventriculaire gauche d’extrémité-diastolique, et le volume ventriculaire gauche d’extrémité-systolique. La fréquence cardiaque des souris doit être contrôlée au moins 400 bpm pour la fonction de mesure cardiaque.

Après que les exosomes soient isolés et purifiés des cellules C2C12, leur présence est confirmée utilisant l’analyse électronique de microscopie de transmission. L’image de microscopie électronique de transmission montre la morphologie des vésicules lumineuses et rondes des exosomes dérivés de C2C12. L’analyse des taches occidentales confirme la présence de marqueurs exosomes, y compris le CD63 et le Tsg101.

Une zone translucide d’oedème est observée après l’injection intramyocardique dans la paroi antérieure du ventricule gauche des souris de mdx qui indique que l’injection dans le myocarde est réussie. La coloration immunofluorescente pour la dystrophine est alors exécutée pour déterminer si l’accouchement cardiaque de MPC-Exo restaure l’expression dystrophine-protéine dans les coeurs de mdx. La restauration partielle de l’expression de dystrophine est observée avec la localisation de membrane dans certains cardiomyocytes.

La fonction cardiaque est mesurée par échocardiographie deux jours après la livraison intramyocardique pour déterminer si la transplation de MPC-Exo améliore la fonction cardiaque chez les souris mdx. Le traitement de MPC-Exo est vu pour améliorer le mouvement intérieur de mur comparé à PBS, suggérant que la transplantation de MPC-Exo a amélioré la fonction cardiaque chez les souris de mdx. L’utilisation d’une aiguille d’insuline de calibre 31 avec la pointe à environ 20 degrés est essentielle pour le succès pour la livraison de la plupart des exosomes dans le myocarde et maximise l’exposition des exosomes injectés pour accueillir des cardiomyocytes.

Après la procédure, l’expression de dystrophine peut être détectée après injection exosome MPC-dérivée par la coloration immunofluorescente indiquant que la livraison exosome MPC-dérivée cardiaque restaure l’expression dystrophine-protéine. Cette technique ouvrira la voie à un traitement par cardiomyopathie avec du matériel génétique thérapeutique porteur d’exosomes, y compris l’ADN, l’ARNm, lncRNA ou les microARN.