Name: Conversion de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSCs) en neurones moteurs spinaux et crânien fonctionnels utilisant des vecteurs PiggyBac (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Découvrez la conversion rapide de cellules iPSCs en neurones moteurs spinaux et crânien fonctionnels utilisant des vecteurs PiggyBac. Cette méthode simplifie le criblage de médicaments pour les maladies des neurones moteurs.

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Les auteurs souhaitent remercier le centre d’imagerie de Center for Life nano science, Istituto Italiano di Tecnologia, pour son soutien et ses conseils techniques. Nous sommes reconnaissants aux membres du Center for Life nano science pour la discussion utile. Ce travail a été partiellement appuyé par une subvention d’AriSLA (subvention pilote 2016 «StressFUS») à l’AR.

1. maintenance des IPSC humains
<ol><li>
Préparation de plaques enrobées de matrices
	<ol>
<li>Décongeler un flacon de 5 mL de matrice (voir tableau des matériaux) à 4 ° c pendant la nuit. Les stocks matriciels originaux proviennent de différentes concentrations de stocks et les aliquotes sont effectués selon le facteur de dilution indiqué sur la fiche technique, spécifique au lot individuel. Il est important de garder le flacon et les tubes froids pour éviter une gélification prématurée de la matrice. Distribuez la matrice en aliquotes dans des cryotubes préréfrigérés sur glace. Congeler les aliquotes inutilisés à-20 ° c.</li>
		<li>Placer une aliquote sur la glace pendant environ 2 h pour décongeler.</li>
		<li>Diluer l’aliquote de matrice avec 20 mL de DMEM/F12 froid dans un tube conique de 50 mL.</li>
		<li>Bien mélanger et distribuer 1 mL de matrice diluée dans des plats de 35 mm (quantités équivalentes par surface d’autres plats).</li>
		<li>Conserver les plats contenant une matrice diluée pendant 1 h à température ambiante pour permettre le revêtement. Remarque: Les plats, scellés avec du Parafilm, peuvent être stockés à 4 ° c pendant 2 semaines.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation de la solution d’action (20 ml) et 1x aliquotes de travail du réactif de dissociation cellulaire doux (voir tableau des matériaux).<ol>
<li>Dissoudre la poudre à 10 mg/mL dans du PBS (ca2 +/mg2 + gratuit).</li>
		<li>Filtrer stériliser à travers une membrane filtrante de 0,22 μM.</li>
		<li>Préparer 20 aliquotes (1 mL chacun) et les conserver à-20 ° c.</li>
		<li>Avant utilisation, diluer une aliquote dans du PBS (ca2 +/mg2 + Free) à 1 mg/ml (1x aliquots de travail). Remarque: 1x les aliquotes de travail peuvent être stockés à 4 ° c pendant 2 semaines maximum.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passaging iPSCs humains.
	<ol>
<li>Avant de commencer: s’il est stocké à 4 ° c, les plaques pré-chaudes enduites de matrice dans l’incubateur à 37 ° c pendant 20-30 min. Préchauffer à température ambiante la quantité de milieu humain iPSC (voir tableau des matériaux) nécessaire. Préchauffer le DMEM/F12.</li>
		<li>Milieu de culture aspirate.</li>
		<li>Rincez les IPSC avec du PBS (ca2 +/mg2 + gratuit).</li>
		<li>Ajouter 1x solution de dissociation douce (0,5 mL pour un plat de 35 mm). Incuber à 37 ° c jusqu’à ce que les bords des colonies commencent à se détacher de la plaque, généralement 3-5 min.</li>
		<li>Aspirer la solution de dissociation douce, en veillant à ne pas détacher les colonies iPSC.</li>
		<li>Laver les cellules avec du DMEM/F12 (2 mL pour un plat de 35 mm) et aspirer en veillant à ne pas détacher les cellules. Répétez cette étape une fois de plus.</li>
		<li>Ajouter le milieu iPSC humain (1 mL pour un plat de 35 mm).</li>
		<li>Détachez délicatement les colonies avec un lève-cellules et transférez-les dans un tube de 15 mL.</li>
		<li>Casser doucement les amas de cellules en pipetant de haut en bas avec un multipipette P1000 3-4 fois.</li>
		<li>Aspirer le surnageant de la (des) plaque (s) enrobées de matrice.</li>
		<li>Ensemencer les cellules dans le volume de culture approprié du milieu iPSC humain. Le ratio de fractionnement peut varier d’une ligne à l’autres et est d’environ 1:4-1:8. Changez le médium quotidiennement.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. génération de lignes iPSC inducibles de NIL et de NIP
<ol><li>
Transfection cellulaire.
	<ol>
<li>Rincer les cellules avec du PBS (ca2 +/mg2 + gratuit).</li>
		<li>Ajouter le réactif de dissociation cellulaire (voir tableau des matériaux) (0,35 ml pour un plat de 35 mm) et incuber à 37 ° c jusqu’à ce que les cellules individuelles soient séparées (5-10 min).</li>
		<li>Terminez doucement la séparation cellulaire en pipetant de haut en bas avec un multipipette P1000 3-4 fois.</li>
		<li>Prélever dans un tube de 15 mL et ajouter du PBS (ca2 +/mg2 + gratuit) à 10 ml. Comptez les cellules.</li>
		<li>Granulés 106 cellules et resuspendre dans 100 μl de tampon R (inclus dans le kit d’électroporation cellulaire, voir tableau des matériaux).</li>
		<li>Ajouter l’ADN plasmidique pour la transfection: 4,5 μg de vecteur transposable (epB-BSD-TT-NIL ou epB-BSD-TT-NIP12) et 0,5 μg du plasmide de transposase piggyBac13.</li>
		<li>Transfect avec le système d’électroporation cellulaire (voir tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant et comme décrit précédemment3 avec les paramètres suivants: 1 200 tension V, 30 ms de largeur, 1 impulsion. Ensemencer les cellules dans un milieu iPSC humain additionné de 10 μM Y-27632 (inhibiteur de roche, voir tableau des matériaux) dans un plat à matrice de 6 mm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sélection avec des antibiotiques.
	<ol>
<li>Deux jours après la transfection, ajouter 5 μg/mL de blasticidine au milieu de culture.</li>
		<li>La plupart des cellules non transfection mourront dans les 48 h de sélection de blasticidine. Conserver les cellules dans la blasticidine pendant au moins 7-10 jours pour contrer-sélectionner les cellules qui n’ont pas intégré les transgènes dans le génome.</li>
		<li>Maintenir des cellules transfectées de manière stable en tant que population mixte, composée de cellules avec un nombre différent de transgènes et de différents sites d’intégration, ou isoler des clones isolés.</li>
		<li>Préparer un plat supplémentaire pour vérifier l’expression efficace des transgenes, sur 1 μg/mL d’induction de doxycycline, par RT-PCR avec des amorces spécifiques au transgène pour Ngn2 (Forward: TATGCACCTCACCTCCCCATAG; Inverse: GAAGGGAGGAGGGCTCGACT), comme décrit précédemment12.</li>
		<li>À ce stade, geler les stocks des nouvelles lignées NIL-et NIP-iPSC dans le milieu de congélation pour les IPCS humains (voir le tableau des matériaux).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. différenciation du Neuron moteur
<ol><li>Dissociez les cellules avec le réactif de dissociation de cellules comme décrit (étapes 2.1.1.-2.1.3.). Prélever des cellules dissociées dans un tube de 15 mL et diluer avec 5 volumes de DMEM/F12. Pellet les cellules et resuspendre dans le milieu humain iPSC complété avec 10 μM inhibiteur de roche. Comptez les cellules et les semences sur des plats enrobés de matrice à une densité de 62 500 cellules/cm2.</li>
	<li>Le lendemain, remplacez le milieu par le DMEM/F12, complété par 1x analogue de L-glutamine stable, 1x supplément de culture cellulaire de l’acide aminé non essentiel (NEAA) et 0,5 x pénicilline/streptomycine, et contenant 1 μg/mL de doxycycline. Ceci est considéré comme le jour 0 de la différenciation. Le jour 1, rafraîchissez le milieu et la doxycycline.</li>
	<li>Le deuxième jour, changez le milieu en milieu Neurobasal/2/17 (milieu Neurobasal additionné de 1x 2, 1x, analogue de L-glutamine stable, 1x NEAA et 0,5 x pénicilline/streptomycine), contenant 5 μM DAPT, 4 μM SU5402 et 1 μg/mL de doxycycline (voir tableau des matériaux ). Rafraîchissez le milieu et la doxycycline tous les jours jusqu’au jour 5.</li>
	<li>
Jour 5: dissociation des cellules avec le réactif de dissociation cellulaire (voir tableau des matériaux).<ol>
<li>Rincer les cellules avec du PBS (ca2 +/mg2 + gratuit).</li>
		<li>Ajouter le réactif de dissociation cellulaire (0,35 mL pour un plat de 35 mm) et incuber à 37 ° c jusqu’à ce que toute la monocouche de la cellule se sépare du plat. Notez que les cellules individuelles ne seront pas séparées pendant l’incubation.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de DMEM/F12 et collecter les cellules dans un tube de 15 mL.</li>
		<li>Terminez doucement la séparation cellulaire en pipetant de haut en bas avec un multipipette P1000 10-15 fois.</li>
		<li>Ajoutez 4 mL de DMEM/F12 et comptez les cellules.</li>
		<li>À ce stade, geler les progéniteurs du neurone du moteur dans le milieu de congélation cellulaire (voir tableau des matériaux), selon les instructions du fabricant.</li>
		<li>Pellet les cellules et resuspendre dans neuronal Medium (Neurobasal/2, 5milieu complété avec 20 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF et 200 ng/mL acide L-ascorbique, voir tableau des matériauxs) complété par 10 μM inhibiteur de roche.</li>
		<li>Ensemencer les cellules sur poly-ornithine/laminine-ou alternativement sur des supports revêtus de matrices à la densité de 100 000 cellules/cm2. Utilisez des supports en plastique μ-Slide avec des lamelles en polymère (voir tableau des matériaux) pour l’analyse Immunostatique.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Le jour 6, changez le milieu avec le milieu neuronal frais dépourvu d’inhibiteur de roche. Les prochains jours, rafraîchissez la moitié du médium tous les 3 jours. Le milieu de culture doit être changé très soigneusement afin d’éviter le détachement de la surface.</li>
</ol>4. analyse immunostaining
<ol><li>Fixation des cellules. Rincer les cellules avec du PBS (avec ca2+/mg2 +) et incuber pendant 15 min dans du paraformaldéhyde à 4% dans du PBS (avec ca2 +/mg2 +) à température ambiante. Attention: Paraformaldéhyde est toxique et soupçonné de causer le cancer. Évitez tout contact avec la peau et les yeux et manipulez-les sous une hotte chimique.</li>
	<li>Perméabilize avec PBS (avec ca2 +/mg2 +) contenant 0,1% de Triton X-100 pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Incuber pendant 30 min à température ambiante dans la solution de blocage d’anticorps (ABS: 3% BSA dans PBS avec ca2 +/mg2 +).</li>
	<li>Incuber pendant 1 h à température ambiante avec des anticorps primaires en ABS: anti-TUJ1 (1:1000; lapin) et anti-Oct4 (1:200; souris) ou anti-CHAT (acétyltransférase anti-choline; 1:150; chèvre). Voir le tableau des matériaux.</li>
	<li>Incuber pendant 45 min à température ambiante avec une paire d’anticorps secondaire d’âne appropriée en ABS: anti-souris Alexa Fluor 647 (1:250), anti-lapin Alexa Fluor 594 (1:250) et anti-chèvre Alexa Fluor 488 (1:250). Voir le tableau des matériaux.</li>
	<li>Incuber en 0,4 μg/mL de DAPI pendant 5 min à température ambiante pour étiqueter les noyaux.</li>
	<li>Montez les cellules avec un support de montage (voir tableau des matériaux) pour l’imagerie à un microscope à fluorescence.</li>
</ol>5. caractérisation fonctionnelle via des enregistrements patch-clamp
<ol><li>Préparer la solution externe Equilibrée (NES) HEPES comme suit: 140 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 2 mM CaCl2mm MgCl2, 10 mm HEPES et 10 mm de glucose. Réglez l’osmolarité entre 290-300 mΩ. Réglez le pH sur 7,3 à l’aide du NaOH 1N et stockez la solution à 4 ° c.</li>
	<li>Préparer la solution interne: 140 mM K-gluconate, 2 mM NaCl, 5 mM BAPTA, 2 mM MgCl2, 10 mm HEPES, 2 mm mg-ATP, 0,3 mm na-GTP. Réglez le pH sur 7,3 avec 1M KOH et vérifiez que l’osmolarité est fixée à environ 290 mΩ. Congeler la solution à-20 ° c dans les petits aliquots.</li>
	<li>Avant d’exécuter les expériences, préchauffer la solution NES dans un bain d’eau à environ 28-30 ° c.</li>
	<li>Tirer quelques micropipettes borosilicate (ID 0,86 mm; OD 1,5 mm) portant une résistance à la pointe: 5-6 MΩ et remplir avec la solution intracellulaire avant de le monter dans le porte-pipette. Remarque: N’oubliez pas de chlorure d’argent fils de l’électrode d’enregistrement et l’électrode de référence dans l’eau de Javel pendant au moins 30 min afin de former une couche uniforme d’AgCl sur la surface du fil.</li>
	<li>Transférer la boîte de Petri dans la chambre d’enregistrement et laisser la chambre avec la solution NES à 1-2 mL/min. Laisser le flux passer par un chauffe-eau en ligne réglé à une température de 30 ° c afin de maintenir la solution au chaud.</li>
	<li>Placer la chambre d’enregistrement électrophysiologique sous un microscope vertical. Enregistrez les courants membranaires avec l’amplificateur patch-clamp et acquérez des données avec un logiciel approprié.</li>
	<li>Ouvrez le logiciel de commande de l’amplificateur et réglez le gain de signal à la valeur 1 et le filtre Bessel à 10 kHz. Assurez-vous que le filtre Bessel est 2,5 fois plus bas que la fréquence d’échantillonnage.</li>
	<li>Définissez les protocoles expérimentaux pour les expériences de Clamp de tension et de serrage de courant dans le logiciel d’enregistrement.</li>
	<li>Dans le paramètre de protocole, cochez le mode de stimulation épisodique et réglez la fréquence d’échantillonnage à 25 kHz. Ensuite, passez à l’onglet de forme d’onde et tapez l’amplitude et la longueur de l’étape de tension ou de courant comme suit.</li>
	<li>Pour les courants de sodium à tension, utiliser 15 paliers de tension (durée de 50 ms chacun) de-100 mV à + 40 mV (incrément de 10 mV). Exécutez le protocole après avoir imposé à la cellule patchée un potentiel de maintien de-60 mV à travers l’amplificateur. De même, les courants de potassium à tension fermée sont évoqués par des paliers de tension (durée de 250 ms chacune) de-30 mV à + 50 mV (incrément de 10 mV) qui maintiennent la cellule enregistrée à-40 mV.</li>
	<li>Pour étudier les propriétés de tir des MNs crânienne et spinales dérivées de l’iPSC, les cellules de serrage, en mode de serrage actuel, à un potentiel membranaire de-70 mV et utilisent 4 impulsions de courant (1 s de durée chacune) d’amplitude croissante (de + 20 pA à + 80 pA; 20 pA d’incrément).</li>
	<li>Acquérir pour chaque courant de tension cellulaire activé, activité de tir évoquée et trois propriétés passives comme capacité de cellules entières (cm), résistance membranaire cellulaire (RM) et potentiel membranaire au repos (PGR).</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Ce protocole permet de convertir efficacement les IPSC humains en neurones moteurs spinaux et crânien grâce à l’expression ectopique de facteurs de transcription spécifiques à la lignée. Ces transgènes sont inductibles par la doxycycline et sont intégrés de manière stable dans le génome grâce à un vecteur basé sur le transposon piggyBac. Dans une population mixte, une ou plusieurs copies du vecteur piggyBac seront intégrées au hasard dans le génome de cellules individuelles, augmentant ainsi le risque d’altération de l’i...

La dégénérescence du neurone du moteur (MN) joue un rôle causal dans les maladies humaines telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et l’atrophie musculaire spinale (SMA). L’établissement de systèmes de modèles cellulaires in vitro adaptés qui récapitulent la complexité du MN humain est une étape importante vers le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Les cellules souches pluripotentes induites (ipscs), qui sont dotées de propriétés de différenciation plurilinéale remarquables, ont maintenant été dérivées d’un certain nombre de patients touchés par les maladies du neurone moteur1,2. D’autres lignées iPSC porteuses de mutations pathogènes associées à des maladies du MN ont été générées par l’édition génique, à partir de cellules souches pluripotentes de contrôle «saines»3. Ces lignes représentent des outils utiles pour la modélisation des maladies in vitro et le dépistage des médicaments, à condition que des méthodes appropriées pour la différenciation des iPSC dans les MNs soient disponibles. Le raisonnement qui sous-tend le développement de cette méthode est de fournir à la communauté scientifique intéressée par les maladies MN un protocole de différenciation rapide et efficace donnant naissance à des MNs fonctionnelles matures. Le premier avantage de cette méthode est son délai d’exécution. Un autre point de force pertinent vient de l’élimination de toute étape de purification. Enfin, le protocole peut être utilisé pour générer deux populations distinctes de neurones moteurs.
La possibilité de générer différents sous-types de MNs est particulièrement pertinente pour la modélisation des maladies MN. Tous les sous-types de MN ne sont pas tout aussi vulnérables dans le SLA et le SMA et l’apparition des symptômes dans différentes unités motrices influe grandement sur le pronostic. Dans l’ALS, l’apparition spinale avec des symptômes commençant dans les membres supérieurs et inférieurs conduit à la mort dans environ 3-5 ans4. Inversement, l’apparition de bulbardes, commençant par la dégénérescence des MNs crânienne, a un pronostic pire. En outre, le pourcentage d’apparition de bulbardes est significativement plus élevé chez les patients avec des mutations dans les protéines de liaison de l’ARN FUS et TDP-43 que chez les individus avec des mutations SOD15. Presque la totalité des protocoles alternatifs de différenciation du mn repose sur l’activité de l’acide rétinoïque (RA), qui confère un caractère spinal à la différenciation des ipscs6,7,8. Cela limite la possibilité d’étudier des facteurs intrinsèques, qui pourraient être protecteurs dans des sous-types de mn spécifiques9,10.
En accord avec un travail antérieur dans les cellules souches embryonnaires de souris11, nous avons récemment montré que dans l’expression ectopique d’ipscs humaine de Ngn2, Isl1 et LHX3 (Nil) induit une identité de mn spinale, tandis que Ngn2 et Isl1 plus PHOX2A (NIP) spécifient le MNS crânien12. Nous avons donc développé un protocole efficace, conduisant à la production de MNs humaines dotées de propriétés fonctionnelles dans un délai de 12 jours. Le but de cette méthode est d’obtenir, dans un court laps de temps et sans la nécessité de purification (par exemple, par FACS), les populations cellulaires hautement enrichi pour les MNs avec l’identité spinale ou crânienne.

<table><tbody><tr><td>5-Bapta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4926-1G</td><td>Produits chimiques pour solutions électrophysiologiques</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-100ML&nbsp ;</td><td>Réactif de dissociation cellulaire</td></tr><tr><td>anti-CHAT</td><td>EMD Millipore&nbsp ;</td><td>AB144P</td><td>Anti-choline acétyltransférase. Anticorps primaire utilisé dans les tests d’immunomarquage. RRID : AB_2079751 ; Numéro de lot : 2971003</td></tr><tr><td>anti-chèvre Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>A11055</td><td>Anticorps secondaire utilisé pour les dosages d’immonofluorescence. RRID : AB_2534102 ; Numéro de lot :</td></tr><tr><td>1915848 anti-souris Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>A31571</td><td>Anticorps secondaire utilisé pour les dosages d’immonofluorescence. RRID : AB_162542 ; Numéro de lot : 1757130</td></tr><tr><td>anti-Oct4</td><td>BD Biosciences</td><td>611202</td><td>Anticorps primaire utilisé dans les tests d’immunomarquage. RRID : AB_398736 ; Numéro de lot : 5233722</td></tr><tr><td>anti-Phox2b</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-376997</td><td>Anticorps primaire utilisé dans les tests d’immunomarquage. Numéro de lot : E0117</td></tr><tr><td>anti-lapin Alexa Fluor 594&nbsp ;</td><td>Sciences immunologiques</td><td>IS-20152-1</td><td>Anticorps secondaire utilisé pour les tests d’immonofluorescence</td></tr><tr><td>anti-TUJ1&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>T2200</td><td>Anticorps primaire utilisé dans les tests d’immunomarquage. RRID : AB_262133</td></tr><tr><td>B27</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-566</td><td>Supplément sans sérum pour l’entretien des cellules neuronales</td></tr><tr><td>Bambanker</td><td>Nippon Genetics</td><td>NGE-BB02</td><td>Milieu de congélation cellulaire, utilisé ici pour les progéniteurs des motoneurones</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>PreproTech</td><td>450-02</td><td>Facteur neurotrophique dérivé du cerveau</td></tr><tr><td>Blasticidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203350</td><td>Antibiotique nucléosidique qui inhibe la synthèse des protéines chez les procaryotes et les eucaryotes</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td>Albumine sérique bovine. Agent bloquant pour empêcher la liaison non spécifique des anticorps dans les tests d’immunocoloration</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td>Produits chimiques pour solutions électrophysiologiques</td></tr><tr><td>Logiciel Clampex 10</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>Clampex 10</td><td>Système d’enregistrement des courants membranaires</td></tr><tr><td>Corning Matrigel qualifié hESC Matrix</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Préparation de la membrane basale reconstituée à partir du sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Utilisé pour l’adhérence des iPSC sur des supports en plastique et en verre</td></tr><tr><td>CRYOSTEM ACF MILIEU DE CONGÉLATION</td><td>Biological Industries</td><td>05-710-1E</td><td>Milieu de congélation pour iPSC humaines</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5146</td><td>produits chimiques pour solutions électrophysiologiques</td></tr><tr><td>Poudre DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>4&prime ;,6-diamidino-2-phénylindole. Colorant fluorescent qui se lie à l’adénine&ndash ; régions riches en thymine dans l’ADN utilisées pour la coloration des noyaux dans les tests d’immonofluorescence</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>AdipoGen</td><td>AG-CR1-0016-M005</td><td>Inhibiteur de la gamma sécrétase</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>Réactif pour la dissociation douce des iPSC humaines</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6421-500ML</td><td>Milieu basal pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G& nbsp ;</td><td>Utilisé pour induire l’expression de transgènes à partir des vecteurs epB-BSD-TT-NIL et epB-Bsd-TT-NIP</td></tr><tr><td>DS2U&nbsp ;</td><td>WiCell</td><td>UWWC1-DS2U</td><td>Ligne commerciale d’iPSC humaine</td></tr><tr><td>E.Z.N.A Kit d’ARN total&nbsp ;</td><td>Omega bio-tek</td><td>R6834-02</td><td>Kit pour l’extraction totale d’ARN à partir de cellules eucaryotes cultivées</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PreproTech</td><td>450-10</td><td>Facteur neurotrophique dérivé des voies gliales</td></tr><tr><td>Gibco Episomal hiPSC</td><td>Line Thermo Fisher Scientific</td><td>A18945</td><td>Commercial human iPSC</td></tr><tr><td>Line Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>Une alternative à la L-glutamine avec une stabilité accrue. Améliore la santé cellulaire.</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>produits chimiques pour solutions électrophysiologiques</td></tr><tr><td>iScript Reverse Transcription Supermix pour RT-qPCR&nbsp ;</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td>Kit pour l’analyse de l’expression génique à l’aide de la qPCR en temps réel</td></tr><tr><td>iTaqTM Universal SYBR Green Supermix&nbsp ;</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5121&nbsp ;</td><td>Mélange maître de réaction prêt à l’emploi, optimisé pour la PCR quantitative à base de colorants (qPCR) sur n’importe quel instrument de PCR en temps réel</td></tr><tr><td>K-Gluconate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td>Produits chimiques pour solutions électrophysiologiques</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>Produits chimiques pour solutions électrophysiologiques</td></tr><tr><td>Acide L-ascorbique LKT</td><td>Laboratories</td><td>A7210</td><td>Utilisé en culture cellulaire comme antioxydant</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11243217001</td><td>Favorise l’attachement et la croissance des cellules neurales in vitro</td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser&nbsp ;</td><td>Olympe</td><td>&nbsp ; iX83 FluoView1200</td><td>Microscope confocal pour l’acquisition d’images d’immunomarquage</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>Produits chimiques pour solutions électrophysiologiques</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Produits chimiques pour solutions électrophysiologiques</td></tr><tr><td>Milieu de montage&nbsp ;</td><td>Ibidi</td><td>50001</td><td>Solution de montage pour la microscopie confocale et les tests d’immunofluorescence</td></tr><tr><td>Amplificateur Multiclamp patch-clamp</td><td>Molecular Devices</td><td>700B</td><td>Système d’enregistrement des courants membranaires</td></tr><tr><td>Na-GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>produits chimiques pour solutions électrophysiologiques</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376</td><td>produits chimiques pour solutions électrophysiologiques</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td> acides <td>aminés non essentiels. Utilisé comme complément pour les milieux de culture cellulaire, pour augmenter la croissance et la viabilité cellulaires.</td></tr><tr><td>Néon 100 &mu ; L Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MPK10096</td><td>Kit d’électroporation de cellules</td></tr><tr><td>Système de transfection de néons</td> Système <td>d’électroporation de cellules</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> MPK5000 <td></td></tr><tr><td>Milieu neurobasal Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td>Milieu basal conçu pour le maintien et la maturation à long terme des populations de cellules neuronales sans avoir besoin d’une couche nourricière d’astrocytes</td></tr><tr><td>NutriStem-XF/FF&nbsp ;</td><td>Biological Industries</td><td>05-100-1A</td><td>Milieu de culture iPSC humain</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>157-8</td><td>Utilisé pour la fixation cellulaire dans les tests d’immunocoloration</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-500ML</td><td>Tampon phosphate de Dulbecco Saline, avec calcium, avec magnésium</td></tr><tr><td>PBS Ca2+/Mg2+ libre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>Tampon de phosphate salin Dulbecco’s, sans calcium, sans magnésium</td></tr>, <tr><td>pénicilline/streptomycine&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td>Solution de pénicilline/streptomicine utilisée pour prévenir la contamination des cultures cellulaires par des bactéries.</td></tr><tr><td>poly-ornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td>Favorise l’attachement et la croissance des cellules neurales in vitro</td></tr><tr><td>SU5402</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0443-5MG</td><td>Inhibiteur sélectif du récepteur 2 du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGFR-2)</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>4-(1,1,3,3-Tétraméthylbutyl)phényl-polyéthylène glycol,&nbsp ; t-Octylphénoxypolyéthoxyéthanol, Polyéthylène glycol&nbsp ; Éther tert-octylphénylique. Utilisé pour la perméabilisation cellulaire dans les tests d’immunocoloration</td></tr><tr><td>Microscope vertical</td><td>Olympus</td><td>BX51VI</td><td>Microscope pour l’enregistrement électrophysiologique équipé d’une caméra CoolSnap Myo.</td></tr><tr><td>Y-27632&nbsp ; (inhibiteur de ROCK)</td><td>Enzo Sciences de la Vie</td><td>ALX-270-333-M005&nbsp ;</td><td>Inhibiteur sélectif perméable aux cellules de la protéine kinase (ROCK) associée à Rho. Augmente la survie des CSPi</td></tr><tr><td>&mu ;-Slide 8 Well&nbsp ;</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>Prise en charge des Analyse microscopique finale des cellules fixes</td></tr></tbody></table>

conversion de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (ipscs) en neurones moteurs spinaux et crânien fonctionnels utilisant des vecteurs piggybac

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Nous décrivons ici une méthode pour obtenir des neurones moteurs spinaux et crânien fonctionnels à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSCs). La conversion directe en neurone moteur est obtenue par l’expression ectopique de modules alternatifs de facteurs de transcription, à savoir Ngn2, Isl1 et Lhx3 (NIL) ou Ngn2, Isl1 et Phox2a (NIP). NIL et NIP spécifient, respectivement, l’identité du neurone du moteur rachidien et crânien. Notre protocole commence par la génération de lignes iPSC modifiées dans lesquelles NIL ou NIP sont intégrés de manière stable dans le génome via un vecteur de transposon piggyBac. L’expression des transgènes est ensuite induite par la doxycycline et conduit, en 5 jours, à la conversion des IPSC en progéniteurs mn. La maturation subséquente, pendant 7 jours, conduit à des populations homogènes de MNs spinales ou crânienne. Notre méthode contient plusieurs avantages par rapport aux protocoles précédents: il est extrêmement rapide et simplifié; il ne nécessite pas d’infection virale ou d’isolement MN supplémentaire; Il permet de générer différentes sous-populations de MN (spinale et crânienne) avec un degré remarquable de maturation, comme en témoigne la capacité de tirer des trains de potentiels d’action. En outre, un grand nombre de neurones moteurs peuvent être obtenus sans purification de populations mixtes. les neurones moteurs spinaux et crânien dérivés de l’iPSC peuvent être utilisés pour la modélisation in vitro de la sclérose latérale amyotrophique et d’autres maladies neurodégénératives du Neuron du moteur. Les populations homogènes de neurons moteurs peuvent représenter une ressource importante pour les dépistages de médicaments spécifiques au type cellulaire.

Une description schématique de la méthode de différenciation est illustrée à la figure 1. Les iPSCs humains (WT I Line3) ont été transfrés avec EPB-BSD-TT-Nil ou EPB-BSD-TT-NIP, générant, sur sélection de blasticidine, des lignées cellulaires stables et inductibles12, ci-après appelées IPSC-Nil et IPSC-NIP, respectivement. Les cellules différenciantes ont été caractérisées pour l’expression du marqueur de pluripotence OCT4 et du marqueur Pan-ne...

Ce protocole permet une conversion rapide et efficace des cellules souches pluripotentes induites en neurones moteurs avec une identité spinale ou crânienne, par l’expression ectopique des facteurs de transcription des vecteurs inductibles de piggyBac.

Conversion de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSCs) en neurones moteurs spinaux et crânien fonctionnels utilisant des vecteurs PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

La possibilité de générer différents sous-types de neurones moteurs est particulièrement pertinente pour la modélisation des maladies modernes des motoneurones telles que la sclérose latérale amyotrophique. Cette méthode permet l’acquisition de populations cellulaires très rigides pour les motoneurones ayant une identité spinale ou crânienne dans un court laps de temps et sans l’étape de purification. La génération de neurones moteurs humains à partir de cellules souches pluripotentes induites ou iPSC dans des conditions de culture simplifiées peut faciliter le dépistage des médicaments pour les maladies des motoneurones.L’expression inductible du facteur de transcription de programmation peut être utilisée pour générer d’autres types de cellules telles que les cellules neuronales, squelettiques et gliales à partir d’un référentiel iPSC. Pour la génération de lignées NIL et NIP iPSC, rincez la culture humaine de l’iPSC avec du PBS sans calcium et magnésium avant de traiter les cellules avec un réapprovisionnement en dissociation cellulaire pendant cinq à dix minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules ont commencé à se détacher du récipient de culture, utilisez une pipette P1000 pour dissocier doucement manuellement les cellules trois à quatre fois.Transférer les cellules dans un tube de 15 millilitres et porter le volume final jusqu’à 10 millilitres avec du PBS frais sans calcium et magnésium pour compter. Recueillir une fois 10 à la sixième cellule par centrifugation et résuspendre la pastille dans 100 microlitres de R tampon du kit d’électroporation. Ajouter 4,5 microgrammes d’ADN plasmatique vecteur transposable et 0,5 microgramme de l’ADN plasmatique transposase piggyBac pour la transfection.Transfect avec le système d’électroporation cellulaire selon les instructions du fabricant avec les paramètres indiqués. Ensuite, ensemencer les cellules dans le milieu iPSC humain complété par 10 inhibiteurs micromolaires ROCK Y-27632 dans un plat enduit de matrice de six millimètres. Deux jours après la transfection, ajouter 5 microgrammes par millilitre de blasticidine au milieu de culture en gardant les cellules dans l’antibiotique pendant au moins sept à dix jours pour contre-seler les cellules qui n’ont pas intégré les transgènes.À la fin de l’incubation, maintenir les cellules habilement transfectées comme une population mixte composée de cellules avec différents nombres de transgènes et de différents sites d’intégration ou isoler des clones simples. Préparer un plat supplémentaire pour permettre l’expression efficace des transgènes sur un microgramme par millilitre d’induction de doxycycline à évaluer par RT-PCR avec des amorces transgéniques spécifiques pour la neurogénine-2 comme décrit précédemment. À ce stade, les stocks des nouvelles lignées NIL et NIP iPSC devraient également être congelés dans un milieu de congélation pour les iPSC humains.Pour la différenciation des neurones moteurs, dissocier les cultures cellulaires stably transfected avec le réagent de dissociation comme démontré pour permettre aux cellules d’être rassemblées dans un tube de 15 millilitres contenant cinq volumes de DMEM/F12 moyen. Après centrifugation, résuspendez les cellules dans le milieu humain d’iPSC complété avec l’inhibiteur micromolar de ROCHE pour compter. Ensemencer les cellules sur des plats enduits de matrice à 6,25 fois 10 les quatrièmes cellules par centimètre de densité carrée.Pour les deux prochains jours, remplacer les supernatants par un milieu de différenciation frais complété par de la doxycycline. Le deuxième jour, changez le milieu au milieu b27 neurobasal complété avec l’inhibiteur gamma de sécréase, l’inhibiteur vasculaire de récepteur de facteur de croissance endothélial, et la doxycyline. Le cinquième jour, dissocier les cellules comme démontré et résuspendre les cellules détachées en quatre millilitres de DMEM/F12 moyen pour le comptage.Le pipetage est important pour une dissociation complète des cellules. Congeler un aliquot des progéniteurs de neurones moteurs dans le milieu de congélation cellulaire selon les instructions du fabricant et de recueillir le reste des cellules par centrifugation. Resuspendez la pastille dans le milieu neuronal complété par 10 inhibiteurs micromolaires rock.Ensemencer les cellules sur des supports en microslide recouverts de laminine polyornithine avec des glissements de couverture polymère à une fois 10 à la cinquième cellule par centimètre de densité carrée. Le sixième jour, remplacez soigneusement le milieu par un milieu neuronal frais sans inhibiteur de la culture jusqu’à l’analyse en aval sans détacher les cellules de la surface de soutien. Une expression uniforme du facteur de transcription octamer-liant de marqueur de pluripotence quatre ou OTC4 peut être observée dans les cultures cellulaires différeciantes le jour zéro en l’absence de la positivité tuJ1 de neurone de marqueur neuronal pan-spécifique trois.Le troisième jour, une forte diminution du nombre de cellules OCT4 positives est évidente. Cela est reflété par l’expression de TUJ1 dans un sous-ensemble d’iPSCs différeciants. Au cinquième jour, aucune expression d’OCT4 n’est observée dans la population qui montre une expression cohérente de TUJ1 et une morphologie neuronale acquise.L’analyse d’immunostaining sept jours après replacage des cellules progénitrices de neurone moteur indique une expression uniforme de TUJ1 et du marqueur mature de neurone moteur choline acétyltransferase. Les neurones dérivés de nil d’iPSC affichent avec succès des courants de sodium voltage-dependent et des courants de potassium voltage-dependent. 80% des neurones moteurs dérivés de nil iPSC serrés dans la modalité actuelle de pince sont capables de déclencher des trains de pointe lorsqu’ils sont injectés avec une impulsion actuelle de plus de 60 picoamps ou plus.Le courant minimum requis pour obtenir des tirs répétitifs dans plus de 50% des cellules enregistrées est plus 40 picoamps avec un seuil de pointe d’environ moins 38 millivolts et une fréquence moyenne de tir à plus 40 picoamps d’environ huit hertz, ce qui suggère que les neurones moteurs rachidiens dérivés de l’iPSC NIL présentent des propriétés fonctionnelles typiques des neurones matures. Les neurones moteurs rachidiens et crâniens peuvent être dérivés d’iPSCs ou d’iPSC contrôlés porteurs de mutations pathologiques et que ces cellules peuvent être utilisées comme modèles de thèse ou pour le dépistage des médicaments. Notre méthode peut être utilisée pour aider à comprendre pourquoi différentes unités de neurones moteurs sont affectées différemment par la SLA.

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Conversion de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSCs) en neurones moteurs spinaux et crânien fonctionnels utilisant des vecteurs PiggyBac

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