Conversion de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSCs) en neurones moteurs spinaux et crânien fonctionnels utilisant des vecteurs PiggyBac

La possibilité de générer différents sous-types de neurones moteurs est particulièrement pertinente pour la modélisation des maladies modernes des motoneurones telles que la sclérose latérale amyotrophique. Cette méthode permet l’acquisition de populations cellulaires très rigides pour les motoneurones ayant une identité spinale ou crânienne dans un court laps de temps et sans l’étape de purification. La génération de neurones moteurs humains à partir de cellules souches pluripotentes induites ou iPSC dans des conditions de culture simplifiées peut faciliter le dépistage des médicaments pour les maladies des motoneurones.

L’expression inductible du facteur de transcription de programmation peut être utilisée pour générer d’autres types de cellules telles que les cellules neuronales, squelettiques et gliales à partir d’un référentiel iPSC. Pour la génération de lignées NIL et NIP iPSC, rincez la culture humaine de l’iPSC avec du PBS sans calcium et magnésium avant de traiter les cellules avec un réapprovisionnement en dissociation cellulaire pendant cinq à dix minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules ont commencé à se détacher du récipient de culture, utilisez une pipette P1000 pour dissocier doucement manuellement les cellules trois à quatre fois.

Transférer les cellules dans un tube de 15 millilitres et porter le volume final jusqu’à 10 millilitres avec du PBS frais sans calcium et magnésium pour compter. Recueillir une fois 10 à la sixième cellule par centrifugation et résuspendre la pastille dans 100 microlitres de R tampon du kit d’électroporation. Ajouter 4,5 microgrammes d’ADN plasmatique vecteur transposable et 0,5 microgramme de l’ADN plasmatique transposase piggyBac pour la transfection.

Transfect avec le système d’électroporation cellulaire selon les instructions du fabricant avec les paramètres indiqués. Ensuite, ensemencer les cellules dans le milieu iPSC humain complété par 10 inhibiteurs micromolaires ROCK Y-27632 dans un plat enduit de matrice de six millimètres. Deux jours après la transfection, ajouter 5 microgrammes par millilitre de blasticidine au milieu de culture en gardant les cellules dans l’antibiotique pendant au moins sept à dix jours pour contre-seler les cellules qui n’ont pas intégré les transgènes.

À la fin de l’incubation, maintenir les cellules habilement transfectées comme une population mixte composée de cellules avec différents nombres de transgènes et de différents sites d’intégration ou isoler des clones simples. Préparer un plat supplémentaire pour permettre l’expression efficace des transgènes sur un microgramme par millilitre d’induction de doxycycline à évaluer par RT-PCR avec des amorces transgéniques spécifiques pour la neurogénine-2 comme décrit précédemment. À ce stade, les stocks des nouvelles lignées NIL et NIP iPSC devraient également être congelés dans un milieu de congélation pour les iPSC humains.

Pour la différenciation des neurones moteurs, dissocier les cultures cellulaires stably transfected avec le réagent de dissociation comme démontré pour permettre aux cellules d’être rassemblées dans un tube de 15 millilitres contenant cinq volumes de DMEM/F12 moyen. Après centrifugation, résuspendez les cellules dans le milieu humain d’iPSC complété avec l’inhibiteur micromolar de ROCHE pour compter. Ensemencer les cellules sur des plats enduits de matrice à 6,25 fois 10 les quatrièmes cellules par centimètre de densité carrée.

Pour les deux prochains jours, remplacer les supernatants par un milieu de différenciation frais complété par de la doxycycline. Le deuxième jour, changez le milieu au milieu b27 neurobasal complété avec l’inhibiteur gamma de sécréase, l’inhibiteur vasculaire de récepteur de facteur de croissance endothélial, et la doxycyline. Le cinquième jour, dissocier les cellules comme démontré et résuspendre les cellules détachées en quatre millilitres de DMEM/F12 moyen pour le comptage.

Le pipetage est important pour une dissociation complète des cellules. Congeler un aliquot des progéniteurs de neurones moteurs dans le milieu de congélation cellulaire selon les instructions du fabricant et de recueillir le reste des cellules par centrifugation. Resuspendez la pastille dans le milieu neuronal complété par 10 inhibiteurs micromolaires rock.

Ensemencer les cellules sur des supports en microslide recouverts de laminine polyornithine avec des glissements de couverture polymère à une fois 10 à la cinquième cellule par centimètre de densité carrée. Le sixième jour, remplacez soigneusement le milieu par un milieu neuronal frais sans inhibiteur de la culture jusqu’à l’analyse en aval sans détacher les cellules de la surface de soutien. Une expression uniforme du facteur de transcription octamer-liant de marqueur de pluripotence quatre ou OTC4 peut être observée dans les cultures cellulaires différeciantes le jour zéro en l’absence de la positivité tuJ1 de neurone de marqueur neuronal pan-spécifique trois.

Le troisième jour, une forte diminution du nombre de cellules OCT4 positives est évidente. Cela est reflété par l’expression de TUJ1 dans un sous-ensemble d’iPSCs différeciants. Au cinquième jour, aucune expression d’OCT4 n’est observée dans la population qui montre une expression cohérente de TUJ1 et une morphologie neuronale acquise.

L’analyse d’immunostaining sept jours après replacage des cellules progénitrices de neurone moteur indique une expression uniforme de TUJ1 et du marqueur mature de neurone moteur choline acétyltransferase. Les neurones dérivés de nil d’iPSC affichent avec succès des courants de sodium voltage-dependent et des courants de potassium voltage-dependent. 80% des neurones moteurs dérivés de nil iPSC serrés dans la modalité actuelle de pince sont capables de déclencher des trains de pointe lorsqu’ils sont injectés avec une impulsion actuelle de plus de 60 picoamps ou plus.

Le courant minimum requis pour obtenir des tirs répétitifs dans plus de 50% des cellules enregistrées est plus 40 picoamps avec un seuil de pointe d’environ moins 38 millivolts et une fréquence moyenne de tir à plus 40 picoamps d’environ huit hertz, ce qui suggère que les neurones moteurs rachidiens dérivés de l’iPSC NIL présentent des propriétés fonctionnelles typiques des neurones matures. Les neurones moteurs rachidiens et crâniens peuvent être dérivés d’iPSCs ou d’iPSC contrôlés porteurs de mutations pathologiques et que ces cellules peuvent être utilisées comme modèles de thèse ou pour le dépistage des médicaments. Notre méthode peut être utilisée pour aider à comprendre pourquoi différentes unités de neurones moteurs sont affectées différemment par la SLA.