Une méthode automatisée pour effectuer l'essai micronutrique in vitro à l'aide de la cytométrie du flux d'imagerie multispectrale

L’analyse micronucléus basée sur le flux d’images peut surmonter plusieurs limitations de méthodes telles que la microscopie automatisée et la cytométrie conventionnelle du débit, y compris le faible débit et le manque de confirmation visuelle des événements. Le principal avantage de cette technique est que tous les événements nécessaires pour déterminer la génotoxicité et la cytotoxicité peuvent être automatiquement image, identifiés et marqués sans avoir besoin de créer des diapositives au microscope. Pour l’exposition cellulaire aux clastogènes et/ou aux aneugénogènes, ajouter un millimètre du produit chimique d’intérêt à sept à huit fois 10 à la cinquième des cellules expérimentales en neuf millilitres du milieu de culture cellulaire approprié dans un flacon T25 et un millilitre d’eau aux cultures de contrôle.

Incuber les flacons à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant trois heures avant de transférer les cellules à un tube de polypropylène de 15 millilitres par flacon. Recueillir les cellules par centrifugation et réutiliser les granulés dans 10 millilitres de milieu de culture frais par tube pour l’ensemencement dans de nouveaux flacons de culture T25. Ajouter ensuite 150 microlitres de la concentration en stock de cytochalasine B à chaque flacon pour atteindre une concentration finale de trois microgrammes par millilitre.

Retournez les flacons à l’incubateur pour un temps de récupération égal à 1,5 à deux fois, comme le recommandent les lignes directrices de l’Organisation de coopération et de développement économiques. À la fin de la période de récupération, transférer les cultures dans des tubes individuels de polypropylène de 15 millilitres pour centrifugation et réutiliser les granulés en cinq millilitres de chlorure de potassium de 75 millimlaires. Mélanger délicatement par inversion trois fois et incuber les échantillons à quatre degrés Celsius pendant sept minutes.

À la fin de l’incubation, ajouter deux millilitres de formaline de quatre pour cent à chaque échantillon et mélanger délicatement avec trois inversions. Retourner les échantillons à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes avant de recueillir les cellules par centrifugation. resuspendez les granulés dans 100 microlitres de formaline fraîche de quatre pour cent pendant 20 minutes.

À la fin de l’incubation, laver les cellules fixes en cinq millilitres de tampon de lavage par tube par centrifugation et resuspendre les granulés dans 100 microlitres de tampon de lavage par tube. Ensuite, transférez les échantillons dans des tubes de microcentrifugeuse individuels de 1,5 millilitre pour compter sur un hémocytomètre. Ajouter cinq microlitres de 100 microgrammes par millilitre Hoechst 33342 par 1,0 x 10 aux six cellules par millilitre et 10 microlitres de 500 microgrammes par millilitre RNase par 100 microlitres d’échantillon par tube.

Après une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone, centrifugez les échantillons dans une microcentrifugeuse et retirez tous les microlitres de supernatant sauf 30 de chaque tube. Puis resuspendez soigneusement les échantillons, en prenant soin de ne pas induire la formation de bulles. Si des bulles apparaissent lors de la resuspension, faites glisser doucement le tube pour les enlever.

Pour exécuter les échantillons par cytométrie de flux d’imagerie multispectrale, allumez d’abord le laser de 405 nanomètres et réglez la puissance laser à 10 milliwatts. Désactivez tous les autres lasers, y compris le laser de dispersion latérale, et réglez le champ lumineux aux canaux un et neuf. Confirmez que le curseur de grossissement est réglé à 60x, que le mode haute sensibilité est sélectionné et que seuls les canaux un, sept et neuf sont montrés dans la galerie d’images.

Cliquez sur scatter plot et sélectionnez toute la population et la zone M01 sur l’axe X. Sélectionnez le rapport d’aspect M01 sur l’axe Y et cliquez sur la région carrée pour dessiner une région autour des cellules individuelles. Nommez cette région cellules simples et cliquez à droite sur l’intrigue pour sélectionner les régions.

Mettez en surbrillance la région des cellules individuelles et modifiez les coordonnées X à 100 et 900 et les coordonnées Y à 0,75 et une. Définissez les paramètres d’acquisition et spécifiez le nom du fichier et le dossier destination. Ensuite, changez le nombre d’événements à 20 000, sélectionnez la population positive à l’ADN et exécutez le premier échantillon.

Pour ouvrir un fichier de données dans IDEAS, cliquez sur Démarrer l’analyse pour démarrer l’assistant de fichier ouvert, et parcourir pour sélectionner le fichier d’image brute désiré. Cliquez ensuite sur Suivant et recherchez une cellule binucléée dans la galerie d’images. Pour créer un masque, cliquez pour sélectionner l’image d’intérêt et ouvrez l’onglet analyse.

Cliquez sur Masques, Nouveau et Fonction pour sélectionner LevelSet. Sous masque, sélectionnez masque M07 et niveau moyen et réglez l’échelle des détails de contour à trois. Ensuite, cliquez sur OK deux fois.

Pour repérer le nombre de fonctionnalités de cellules binucléées, ouvrez l’onglet Analyse et sélectionnez Fonctionnalités et Nouvelles. Pour le type de fonctionnalité, sélectionnez Spot Count. Pour Masque, sélectionnez le masque binucleated final, et réglez la conjonctive à quatre, puis changez le nom en compte de tache BNC et cliquez SUR OK et près de calculer les valeurs de fonctionnalité.

Pour un compte poncté d’histogramme cellulaire binucléifié, cliquez sur l’histogramme et sélectionnez non apoptopique comme population parente. Pour la fonction axe X, sélectionnez Spot Count BNC et cliquez sur OK et la région linéaire, puis dessinez une région à travers Bim Two et nommez cette région 2N. Pour créer un masque micronucléus, sélectionnez une cellule binucléée qui contient un micronucléus de la galerie d’images et ouvrez des masques dans l’onglet Analyse.

Pour créer un masque d’identification ponctuelle, cliquez sur Nouveau et Fonction, et sélectionnez Spot. Confirmez que le bouton Radio Bright est sélectionné et sélectionnez M07 sous masque. Réglez le rapport d’arrière-plan spot to cell et le rayon minimum à deux et réglez le rayon maximum à six.

Cliquez sur OK et OK pour ajouter le masque à la liste sur la gauche, puis cliquez sur Nouveau pour créer un autre masque. Cliquez sur le spot M07 Channel sept Bright deux six deux masque et cliquez sur la flèche vers le bas pour l’ajouter à la définition du masque et cliquez sur les opérateurs And and Not. Cliquez sur la flèche vers le bas pour ajouter un masque de plage dilaté à la définition du masque.

Pour créer un masque de population polynucléé, cliquez sur Analyse, Masques, Nouveau et Fonction. Sous fonction, sélectionnez Plage. Sous masque, sélectionnez Watershed Dilate Set M07 Channel07, Middle, three, two, et réglez l’image à afficher sur Channel 07.

Fixez les valeurs minimales et maximales de la zone à 135 et 5 000, respectivement, et fixez les valeurs minimales et maximales du ratio d’aspect à 0,4 et une, respectivement. Cliquez sur OK et dans le champ de nom, changer le texte pour lire le masque POLY, puis cliquez sur OK et Fermer. Pour créer une vue personnalisée, cliquez sur le bouton Propriétés de la Galerie d’images, ouvrez l’onglet Composites et cliquez sur Nouveau.

Sous nom, entrez channel 01 à Channel 07. Cliquez sur Ajouter l’image, et sous image, sélectionnez Channel 01 et définissez le pourcentage à 100. Cliquez à nouveau ajouter l’image, et sous l’image, sélectionnez Channel 07 et définissez le pourcentage à 100.

Cliquez sur l’onglet Afficher, cliquez sur Nouveau, et sous Nom, entrez les masques BNC et MN. Cliquez ensuite ajouter la colonne, et sous le type d’image, sélectionnez Canal 01 et sous Masque, sélectionnez Aucun. Cliquez sur Ajouter la colonne, et sous type d’image, sélectionnez Canal 07, et sous Masque, sélectionnez Aucun.

Cliquez sur Ajouter la colonne, cliquez sur le bouton radio composite, puis cliquez sur Ok pour compléter la vue personnalisée. Cliquez sur le menu pulldown View et cliquez sur la vue masques BNC et MN. Cliquez sur le bouton Masques Masques Afficher.

Pour énumérer les événements clés, ouvrez l’onglet Rapports et cliquez sur Définir le rapport de statistiques, puis dans la nouvelle fenêtre, cliquez sur Ajouter des colonnes. Pour ajouter la statistique du nombre de cellules binucléées, sous Statistiques, sélectionnez Compte et sous Population sélectionnée, sélectionnez la population BNC, puis cliquez sur Ajouter des statistiques pour ajouter la statistique à la liste et enregistrer le modèle. Une fois que toutes les statistiques ont été ajoutées à la liste, cliquez sur Fermer, puis cliquez sur OK, puis enregistrer le modèle d’analyse de données.

Pour traiter les fichiers expérimentaux par lots, sous le menu Outils, cliquez sur Fichiers de données par lots et cliquez sur Ajouter lot dans la nouvelle fenêtre. Cliquez sur Ajouter des fichiers pour sélectionner les fichiers d’expérience à ajouter au lot et cliquez sur le bouton Dossier ouvert sous l’option Sélectionnez un modèle ou un fichier d’analyse de données. Parcourez le modèle qui vient d’être enregistré et ouvrez-le.

Cliquez sur OK pour fermer la fenêtre actuelle. Cliquez ensuite sur Soumettre des lots pour commencer le traitement par lots de tous les fichiers. Ici, quatre panneaux sélectionnés pour identifier les cellules binucléées sont montrés.

Ces parcelles bivariées et histogrammes permettent la sélection de cellules binucléées ainsi que l’identification des cellules qui ont deux noyaux avec une circularité, des zones et des intensités similaires et qui sont bien séparées les unes des autres. Ces images de Brightfield et hoechst, ainsi que les masques binucléés de cellules et de micronucléus, facilitent l’identification et l’énumération des cellules binucléées et des micronucléaires. L’application de la fonction de comptage ponite utilise le masque polynucléé pour identifier les cellules mononucléaires, trinucléaires et quadranucléaires.

Le nombre de cellules tri et quadranucléaires peut ensuite être résumé pour obtenir le nombre final de cellules polynucléées nécessaires au calcul de la cytotoxicité. Ici, des valeurs représentatives de génotoxicité et de cytotoxicité sont montrées pour la colchicine d’endogène, la mitomycine de clastogène C, et un contrôle négatif, mannitol, pour démontrer la validité du protocole. L’étiquetage des cellules avec une concentration appropriée de taches d’ADN est essentiel pour assurer une capture d’image de haute qualité, permettant à tous les événements clés d’être facilement identifiés et notés.

Ces techniques s’appliquent également à l’essai de micronucléus pour la biodosimétrie de rayonnement, qui permet l’estimation de dose dans les individus qui peuvent avoir été exposés au rayonnement.