Utilisation de la coloration en immunofluorescence pour observer directement les cellules endothéliales vasculaires

Ce protocole aide les gens à analyser la morphologie des cellules endothéliales, et l’expression de molécules dans les régions, sous différents stress de cisaillement des fluides. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une évaluation directe des cellules endothéliales vasculaires sous différents stress de cisaillement liquide. Lors de l’exécution de cette procédure, les étapes clés sont d’utiliser du paraformaldéhyde fraîchement préparé et d’effectuer une bonne perfusion.

Commencez cette procédure par l’anesthésie d’une souris C57BL/6 vieille de 12 semaines, telle que décrite dans le protocole textuel. Confirmez l’anesthésie appropriée en pinçant doucement la queue. Tapez les pattes de la souris sur une pile de serviettes en papier, avec du ruban adhésif.

Tenez la peau de la souris avec des forceps, et coupez la peau avec une paire de ciseaux de l’abdomen au sommet du thorax. Ouvrez la cavité abdominale, sous la cage thoracique, avec une paire tranchante de ciseaux. Soulevez le sternum avec des forceps, et coupez le diaphragme.

Ensuite, coupez la cage thoracique pour exposer la cavité thoracique. Couper le cava vena juste au-dessus du foie avec des ciseaux. La pression imprèce l’arbre artélial pendant cinq minutes, avec une solution saline normale pré-refroidie contenant 40 unités par héparine millilitre, à travers le ventricule gauche, jusqu’à ce que les poumons et le foie deviennent pâles.

Puis perfuser avec pré-réfrigéré 4%paraformaldéhyde dans PBS pendant quatre minutes. Retirez tous les muscles, les organes et la graisse, jusqu’à ce que l’aorte soit exposée. Placez la souris sous un microscope disséquant.

Utilisez des forceps délicats et une paire de ciseaux délicats pour exposer l’aorte clairement sous un microscope disséquant, et enlever le tissu conjonctif le long de l’aorte, aussi proprement que possible. Disséquer l’aorte thoracique du cœur au tronc coeliaque avec une paire de ciseaux délicats. Placer l’aorte dans un plat de culture cellulaire de six centimètres, avec PBS.

Coupez l’aorte longitudienment, d’abord le long de la courbe inférieure, puis utilisez les microscisseurs pour ouvrir les trois branches de l’arc aortique, y compris la carotide commune innominate, et l’artère subclavian gauche le long de la plus grande courbe jusqu’à ce que le segment droit soit atteint. Perméabiliz l’aorte avec 1% d’éther octyl phénylique d’octyl polyoxyéthylène, dans PBS pendant 10 minutes. Bloquez ensuite l’aorte avec 10% de sérum de chèvre normal dans la solution saline tamponnée de tris contenant 2,5% de polysorbate 20 pendant une heure à température ambiante, dans une plaque de culture de cellules de 12 puits.

Ensuite, incuber l’aorte dans le tampon de blocage contenant cinq grammes par millilitre lapin anti-VCAM1, et cinq grammes par rat millilitre anti-VE-Cadherin, nuit à quatre degrés Celsius. Après avoir rinçé l’échantillon trois fois avec la solution de lavage, appliquez les anticorps secondaires conjugués de fluorescence pendant une heure à température ambiante, en gardant dans un endroit foncé. Rincez encore trois fois dans la solution de lavage.

Contrestain l’aorte avec DAPI pendant 10 minutes, en gardant dans un endroit sombre. Rincez ensuite l’aorte tachée trois fois dans la solution de lavage. Placez l’aorte sur un glissement de couverture avec la surface lumenale vers le bas, et déplacez-la lentement à la solution de montage d’antifade qui a été précédemment abandonnée sur le glissement de couverture.

Étirez doucement l’aorte pour garder le spécimen à plat. Inverser le slip de couverture et le mettre sur la glissière en verre. Prenez soin d’éviter toute bulle d’air entre le spécimen et le verre.

Examinez l’aorte à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. Analyser les intensités de couleur des différents canaux de la région désirée dans les images en face, avec le logiciel Image-Pro Plus. En face des images de coloration d’immunofluorescence des cellules endothéliales vasculaires de l’aorte de souris sont montrées.

En face immunofluorescence de la protéine d’adhérence des cellules vasculaires un, et l’expression avec VE-Cadherin comme un marqueur endothélial, sont montrés sous différents modèles de flux de différentes régions de l’aorte de souris. DAPI a également été contre-taché pour montrer les noyaux cellulaires pour une meilleure visualisation. Lorsque vous regardez à travers les piles Z sous le microscope, les cellules musculaires endothéliales et lisses peuvent être facilement distinguées par leur morphologie des noyaux cellulaires.

Les noyaux cellulaires endothéliales sont de forme ovale, et plus grands que les noyaux de cellules musculaires lisses en forme de fuseau. L’expression de VCAM-1 était plus abondante dans les régions sous écoulement perturbé, à la courbure moindre de l’arc d’aorte, comparée aux régions sous le flux régulier, à une plus grande courbure de l’arc d’aorte, et à l’aorte thoracique. Ici, les zones de courbure moindre d’une aorte de souris sont indiquées comme zones d-flow, et la plus grande courbure et thoracique.

Avec la bonne modification, cette technique peut également être appliquée à l’analyse de la perméabilité vasculaire, et la position des macromolécules dans l’intima de cellules endothéliales.