Name: Photothérapie quotidienne avec lumière rouge pour réglementer Candida albicans biofilms croissance (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Découvrez comment la photothérapie rouge à 635 nm régule la croissance des biofilms de Candida albicans sur 48 heures. Cette méthode réduit le temps de traitement et améliore l'efficacité clinique.

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Nous remercions le Dr Paula da Silveira, Dr Cecília Atem Gonçalves de Araújo Costa, Shawn M. Maule, Shane M. Maule, Dr N. Martin José et Dr Iriana Zanin pour l’élaboration de cette étude. Nous remercions également m. Alexander D. Johnson (UCSF) pour le don de la souche analysée dans cette étude.

1. préparation des milieux de culture
<ol><li>Préparer la sabouraud dextrose agar (SDA). Suspendre 65 g de SDA additionné de chloramphénicol (50 mg/L) dans 1 000 mL d’eau distillée. Ébullition pour dissoudre le milieu complètement. Stériliser à l’autoclave à 15 PSI (121° C) pendant 30 min. laisser refroidir à 45-50 ° C. Bien mélanger et verser 20 mL de SDA dans les plats de pétri stériles (taille : 100 x 15 mm).</li>
	<li>Préparer la levure azote (YNB) milieu de base additionné de 100 mM de glucose en mélangeant 6,7 g de YNB et 18 g de dextrose à 1 000 mL d’eau ultrapure. Mélanger à l’aide d’un agitateur et stériliser le milieu à l’aide d’un système de filtration sous vide de 0,22 µm.</li>
	<li>Préparer le RPMI en mélangeant 10,4 g de RPMI 1640 et 34,32 g de 3-(N-morpholino) sulfonique (MOPS) à 1 000 mL d’eau ultrapure. Mélanger dans un agitateur sans chaleur et ajuster le pH à 7 en ajoutant 1 N NaOH (ajouter 2 g de NaOH à 50 mL d’eau ultrapure). Stériliser le milieu à l’aide d’un système de filtration sous vide de 0,22 µm.</li>
</ol>2. pré inoculum et inoculum
<ol><li>Enlever le micro-organisme SN425 de c. albicans du congélateur −80 ° C et laisser décongeler à température ambiante. Graines de 10 µL de la culture de réserve sur les boîtes de pétri contenant SDA additionné de chloramphénicol (50 mg/L). Incuber les boîtes de pétri en aérobie à 37 ° C pendant 48 h.</li>
	<li>Après 48 h d’incubation, ajouter 10 colonies de c. albicans à 10 mL de levure d’azote milieu de base (YNB) additionné de 100 mM de glucose et incuber en aérobie à 37 ° C pendant 16 h pour l’inoculum avant.</li>
	<li>Après incubation pour 16 h, préparer les inocule en diluant les ferments dans un milieu frais YNB additionné de 100 mM de glucose dans un 01:10 proportion (1 mL de la culture starter dilué dans 9 mL de YNB). Mesurer la densité optique initiale (Do) à 540 nm.</li>
	<li>Incuber les inocule par voie aérobie à 37 ° C pendant 8 h, jusqu'à ce que les souches atteignent la phase de croissance logarithmique et mesurent la division d’opposition définitive à 540 nm. Soustraire l’OD final de la division d’opposition initiale afin de vérifier si la division d’opposition de l’innoculum sur la phase de croissance logarithmique (8 h, basé sur les courbes de croissance dans la Figure 1).</li>
	<li>Pour rejoindre un inoculum avec 107 cellules mL-1, centrifuger l’inoculum pendant 5 min à 5 500 x g, éliminer le surnageant et concentrer l’inoculum de la moitié du volume des tubes.</li>
</ol>3. photothérapie et la formation de Biofilm
<ol><li>Ajouter 1 mL de l’inoculum dans les puits d’une plaque de polystyrène 24 puits. Incuber en aérobie à 37 ° C pendant 90 min permettre l’adhésion cellulaire jusqu’au fond des puits.</li>
	<li>Utiliser un non-cohérente rouge clair (voir Table des matières) comme source de lumière avec une longueur d’onde de 635 ± 10 nm et une puissance de sortie fixe de 1 460 mW cm−2.</li>
	<li>Utilisez un wattmètre pour mesurer la densité de puissance de la lumière. L’exposition énergétique appliquée est de 87,6 J cm-2, équivalent à environ 1 min d’exposition. Utiliser la formule de densité d’énergie (J/cm2) = densité de puissance (W/cm2) x durée d’irradiation (s). S’applique à une distance de 5 mm entre la source lumineuse et le biofilm pour éviter le réchauffement de l’échantillon.</li>
	<li>Traiter les biofilms de contrôle positif à la chlorhexidine 0,12 % pendant 1 min et biofilms contrôle négatif avec 0,89 % NaCl pendant 1 min.</li>
	<li>Après les traitements, laver toutes les biofilms deux fois avec une solution de NaCl de 0,89 %.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de milieu RPMI 1640 tamponnée avec 3-(N-morpholino) sulfonique (MOPS) à pH 7 sur les biofilms et incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit.</li>
	<li>Le matin, appliquer les mêmes traitements qu’étapes 3.2 à 3.6, lavez les biofilms deux fois avec 0,89 % NaCl, ajouter nouveau RPMI tamponnée avec MOPS (1 mL, pH 7) dans les puits et incuber en aérobie à 37 ° C.</li>
	<li>Le même jour, après 6 h, exposer les biofilms à la lumière rouge. Traiter les biofilms de contrôle positif à la chlorhexidine 0,12 % pendant 1 min et biofilms contrôle négatif avec 0,89 % NaCl pendant 1 min. Après traitement, laver les biofilms deux fois avec une solution de NaCl de 0,89 %.</li>
	<li>Répétez les étapes de 3,2 à 3,8 jusqu'à réaliser le développement du biofilm de 48 h. NOTE : Fondamentalement, un traitement arrivera dans la matinée et l’autre se passera dans l’après-midi le même jour (6 h d’intervalle).</li>
</ol>4. le traitement
<ol><li>Ajouter 1 mL de stérile 0,89 % NaCl dans la cupule pour éliminer le biofilm par rayer le bien en faisant un embout de la pipette. Ajouter le biofilm enlevé dans un tube stérile.</li>
	<li>Ajouter un autre 1 mL stérile 0,89 % NaCl dans le puits. Encore une fois le rayer et ajouter la suspension dans le même tube pour un volume total de 2 mL.</li>
	<li>Unités formant colonie (UFC)<ol>
<li>Vortex vigoureusement la suspension de biofilm pendant 1 min. De la suspension de biofilm, utilisez une partie aliquote de 0,1 mL de la dilution en série.</li>
		<li>Diluer la suspension de biofilm de 10-1 à 10-4 dans une solution de NaCl de 0,89 %.</li>
		<li>Graine de 50 μl de chaque dilution aux plaques de SDA et incuber les plaques à 37 ° C pendant 48 h.</li>
		<li>Compter les colonies et d’appliquer la formule CFU/mL = nombre de colonies x 10n / q (n = dilution ; q = volume ensemencé).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Poids sec<ol>
<li>Peser et étiqueter des microtubes à centrifuger.</li>
		<li>À partir de la suspension de biofilm, utilisez 0,1 mL pour la détermination de la masse sèche (biomasse).</li>
		<li>Ajouter 1 mL d’éthanol absolu dans une partie aliquote de 0,1 mL de biofilms et conserver à-20 ° C pendant 18 heures. Après 18 h, centrifuger à 10 000 g pendant 10 min.</li>
		<li>Jeter le surnageant, placer les tubes sur un dessiccateur à sécher les échantillons pendant une semaine et peser les microtubes à centrifuger à nouveau.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Polysaccharides hydrosolubles (FSSF) et alcali-soluble polysaccharides (ASP)
	<ol>
<li>De la suspension du biofilm, vigoureusement vortex le reste du volume (1,8 mL) durant 1 min et centrifuger à 5 500 × g pendant 10 min à 4 ° C. Stocker le surnageant dans un nouveau tube et laver le précipité deux fois avec les cellules, qui contiennent les constituants insolubles de la matrice extracellulaire avec de l’eau ultrapure stérile (5 500 × g, 10 min à 4 ° C).</li>
		<li>Remettre en suspension le contenu insoluble à 1,8 mL d’eau ultrapure stérile.</li>
		<li>Polysaccharides hydrosolubles (FSSF) Remarque : Effectuez cette expérience à une hotte aspirante.<ol>
<li>Partir du surnageant stocké, réserver 1 mL pour la quantification des polysaccharides hydrosolubles (FSSF).</li>
			<li>Homogénéiser le surnageant stocké pendant 1 min. Ensuite, transférer dans des tubes stériles et ajouter 2,5 volumes d’éthanol à 95 %. Stocker les tubes pendant 18 heures à-20 ° C pour la précipitation des FSSF.</li>
			<li>Après 18 h, centrifuger les tubes à 9 500 x g pendant 20 min à 4 ° C. Après centrifugation, jeter le surnageant.</li>
			<li>Laver les échantillons trois fois avec 75 % d’éthanol et sécher à l’air des granulés. Resuspendre le culot avec 1 mL d’eau ultrapure stérile et de quantifier le FSSF, à l’aide de la méthode à l’acide sulfurique-phénol.</li>
			<li>Utiliser le glucose de 0,1 % (0,01 g de glucose à 10 mL d’eau ultrapure) pour la courbe d’étalonnage (0, 2.5, 5, 10, 15, 20 et 25 µL de glucose par tube).</li>
			<li>Ajouter 200 µL de 5 % de phénol (2,7 mL de phénol de 90 % à 47,3 mL d’eau ultrapure) dans un tube de verre comprenant 200 µL de l’échantillon ou la courbe d’étalonnage point (en triple exemplaire par échantillon) et mélanger avec précaution.</li>
			<li>Ajouter 1 mL d’acide sulfurique dans le tube et mélanger. Attendre 20 min pour la réaction et de mesurer les échantillons à l’aide d’un spectrophotomètre (490 nm).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Alcali-soluble polysaccharides (ASP) Remarque : Effectuez cette expérience sous une hotte.<ol>
<li>De la quantité de remises en suspension insoluble, séparer 1 mL pour le dosage de l’aspic. Centrifuger les aliquotes de chaque suspension de biofilm (13 000 x gpendant 10 min à 4 ° C).</li>
			<li>Avec précaution, retirez le surnageant de chaque tube. Puis placer les échantillons sur une pompe à vide pour sécher les pellets.</li>
			<li>Peser les boulettes, puis ajouter 300 µL de NaOH N 1 (2 g de NaOH à 50 mL d’eau ultrapure) par 1 mg de poids sec. Les incuber pendant 2 h à 37 ° C et puis centrifuger à 13 000 × g pendant 10 min.</li>
			<li>Prudemment, recueillir les surnageants avec une pipette et le transfert aux tubes de microcentrifuge, maintenir le culot.</li>
			<li>Une fois de plus, ajouter un volume égal de NaOH N 1 pour les tubes contenant des granulés et répétez les mêmes étapes que ci-dessus pour l’extraction d’ASP.</li>
			<li>Après incubation pendant 2 h, centrifuger les échantillons (13 000 x g pendant 10 min), collecter les surnageants soigneusement et ajouter aux surnageants recueillies précédemment.</li>
			<li>Pour la troisième extraction, répétez les mêmes étapes que ci-dessus, mais cette fois, ne pas incuber les échantillons pendant 2 h avant la centrifugation.</li>
			<li>Ensuite, ajouter trois volumes d’éthanol à 95 % dans chaque échantillon. Ensuite, les échantillons à −20 ° C pendant 18 h pour la précipitation de l’ASP en stock.</li>
			<li>Centrifuger les tubes (9 500 × g pendant 20 min à 4 ° C) et jeter le surnageant.</li>
			<li>Lavez chaque granule trois fois avec 75 % d’éthanol et sécher à l’air (mêmes procédures fait pour WSP). Remettre en suspension les pellets égal volume total de la première extraction avec NaOH N 1.</li>
			<li>Lire les échantillons pour la quantification de l’ASP à l’aide de la phénol-acide sulfurique (même en ce qui concerne l’analyse des FSSF).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les étapes plus critiques pour la culture réussie de c. albicans biofilms sont : 1) pour faire l’inoculum pré et l’inoculum dans un milieu YNB complété avec 100 mM de glucose ; 2) d’attendre 90 min pour la phase d’adhérence et de laver soigneusement deux fois les puits avec 0,89 % NaCl pour éliminer les cellules non-respecté ; et 3) pour ajouter le milieu RPMI pour les cellules adhérentes pour commencer la formation de biofilm, depuis RPMI stimulera la croissance d’hyphes. Aneuploïdies peuvent se produire lorsqu...

L’augmentation de l’incidence du diabète, des applications de traitement immunosuppresseur, infection par le VIH, épidémie de sida, cliniques invasives et la consommation d’antibiotiques à large spectre au cours des années ont augmenté l’incidence de Candida albicans des maladies1,2. Les infections de c. albicans sont communément associées au développement du biofilm et peuvent provoquer des manifestations cliniques, telles que la candidose, ou des manifestations systémiques, par exemple une candidémie1,2. Un des facteurs de virulence plus remarquables de la croissance de biofilm est la création de matrice de polysaccharides extracellulaires. La formation de biofilm coopère pour augmenter la résistance aux médicaments antifongiques existants, stress environnemental et hôte mécanismes immunitaires3.
La croissance de biofilm de c. albicans commence avec l’adhésion précoce des cellules planctoniques à un substrat, suivie par la multiplication des cellules de levure par la surface du substrat et la croissance des hyphes. La dernière phase de la croissance de biofilm est la phase de maturation, dans lequel développement levuriformes est supprimée, le développement des hyphes se dilate et la matrice extracellulaire contient le biofilm4. C. albicans exopolysaccharides (EPS) dans la matrice interagissent pour former les mannan-glucane complexe5,6. L’interaction des exopolysaccharides est critique pour la défense des biofilms contre drogues7. Par conséquent, la réduction de l’EPS de la matrice extracellulaire de c. albicans pourrait soutenir le développement de nouveaux protocoles d’antibiofilm pour le contrôle de la candidose buccale.
Lumière régularise la croissance, le développement et le comportement de plusieurs organismes8 et il a été appliqué comme un antimicrobien en chimiothérapie antimicrobienne photodynamique (PACT). PACTE s’applique une lumière visible d’une longueur d’onde spécifique et un absorbant la lumière photosensibilisateur9. Toutefois, les substances photosensibilisantes ont des difficultés à pénétrer le biofilm, causant plus faible efficacité10. L’incapacité des agents thérapeutiques à pleinement s’infiltrer dans les biofilms est une raison que les biofilms résistent parfois thérapie antimicrobienne traditionnelle3,5. Pour désactiver les clos des cellules microbiennes, antimicrobiens ont besoin de pénétrer à travers la matrice extracellulaire ; Néanmoins, l’EPS caractérise un obstacle diffusion pour ces molécules en demandant leur niveau de transport dans le biofilm ou en influençant la réponse de l’antimicrobien avec la matrice elle-même11.
Considérant les inconvénients du Pacte, l’utilisation de la lumière en soi émerge comme une amélioration utile. Les données préliminaires ont révélé que le traitement avec la lumière bleue, deux fois par jour a sensiblement inhibe la production de EPS insoluble dans le biofilm de Streptococcus mutans . Par la diminution des EPS-insolubles, lumière bleue a diminué la croissance de biofilm. Néanmoins, les résultats de la photothérapie à l’aide de la lumière rouge de c. albicans biofilms sont rares. Par conséquent, l’objectif de cette étude était d’évaluer dans quelle photothérapie de manière à l’aide de la lumière rouge influence la croissance et l’arrangement de c. albicans biofilms. Pour le traitement deux fois par jour, nous avons adapté anciens protocoles9,12 pour fournir un modèle simple et reproductible de biofilm qui fournit des réponses au sujet de la viabilité, notre laboratoire les polysaccharides extracellulaires et de poids sec montants après traitement de la lumière rouge. Le même protocole peut être utilisé pour tester les autres thérapies.

<table><tbody><tr><td>Clorhexidine 20 %&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9394</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose (D-Glucose) Anhydre</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol 200 proof</td><td>Decon Laboratories</td><td>DSP-MD.43</td><td></td></tr><tr><td>LumaCare LC-122 A&nbsp ;</td><td>LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, États-Unis.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp ;</td><td>Fisher Chemical</td><td>S641-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp ;</td><td>Fisher Bioreagents&nbsp ;</td><td>BP 359-500</td><td></td></tr><tr><td>Phénol 5 %</td> <td>Milipore Sigma</td><td>843984</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 tamponné avec 3-(N-morpholino)</td><td>Sigma</td><td>R7755</td><td></td></tr><tr><td>Gélose au dextrose Sabouraud complétée par du chloramphénicol</td><td>Acumedia</td><td>7306A</td><td></td></tr><tr><td>Acide sulfurique&nbsp ;</td><td>Fisher Chemical</td><td>SA200-1</td><td></td></tr><tr><td>Base d’azote de levure</td><td>Difco</td><td>DF0392-15-9</td><td></td></tr><tr><td>Acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Plaque de polystyrène à 24 puits&nbsp ;</td><td>Faucon</td><td>353935</td><td></td></tr></tbody></table>

photothérapie quotidienne avec lumière rouge pour réglementer candida albicans biofilms croissance

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Nous présentons ici un protocole pour évaluer les résultats du taux quotidien lumière rouge traitement sur la croissance de Candida albicans biofilms. Pour augmenter la croissance planctonique de SN425 de c. albicans , l’inocule a grandi sur des supports de Base d’azote de levure. Pour la formation de biofilm, RPMI 1640 media, qui ont des concentrations élevées d’acides aminés, ont été appliqués afin de contribuer à la croissance de biofilm. Biofilms de 48 h ont été traités deux fois par jour pendant une période de 1 min avec un dispositif de lumière non-cohérente (lumière rouge, longueur d’onde = 635 nm, la densité d’énergie = 87,6 J·cm-2). Tel qu’un contrôle positif (CP), chlorhexidine 0,12 % (CHX) a été appliqué et comme témoin négatif (NC), 0,89 % NaCl a été appliquée sur les biofilms. Unités (UFC), formant des colonies des exopolysaccharides poids sec, solubles et insolubles ont été quantifiés après traitements. En bref, le protocole présenté ici est simple, reproductible et apporte des réponses au sujet de la viabilité, des quantités de polysaccharides extracellulaires et de poids sec après le traitement de la lumière rouge.

Figure 2 affiche les résultats de Log10 UFC/mL de c. albicans après des traitements journaliers avec lumière rouge pour 1 min. rouge réduit significativement le Log10 UFC/mL par rapport à la NC (p = 0,004). La figure 3 présente les résultats de la biomasse (mg) de c. albicans biofilms après traitements quotidiens. Tous traités groupes ont montré de réduction de la biomasse par rapport à la ...

Nous présentons ici un protocole afin de mesurer le résultat de l’application de la lumière rouge sur la croissance de Candida albicans biofilms. Un dispositif rouge non cohérentes avec la longueur d’onde de 635 nm et densité d’énergie de 87,6 J·cm-2 a été appliqué tout au long de la croissance de Candida albicans biofilms pendant 48 h.

Photothérapie quotidienne avec lumière rouge pour réglementer Candida albicans biofilms croissance

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Candida est la cause la plus fréquente d’infection fongique disséminée chez les hôtes immunocompromisés. L’incapacité des agents thérapeutiques à infiltrer complètement le biofilm en raison de la matrice est l’une des raisons pour lesquelles les biofilms résistent aux thérapies traditionnelles. Notre protocole évalue comment la photothérapie, à l’aide de la lumière rouge, interfère avec la croissance et l’arrangement des biofilms Candida albicans.Les méthodes appliquées sont bien établies, puisque la souche utilisée dans cette étude a eu sa matrice extracellulaire caractérisée et le dispositif léger a été appliqué avec succès à d’autres suspensions planctoniques de micro-organisme et biofilms. Le plus grand avantage de cet appareil est la réduction du temps de traitement, ce qui le rend plus visible pour les applications cliniques. Lors de la culture Candida albicans être conscient que les anticorps peuvent être acquis.Par conséquent, il est important de ne pas utiliser des colonies qui ont plus de sept jours, de ne pas commencer les plaques à quatre degrés Celsius, et de ne pas re-stries cellules à partir de plaques existantes. De même, une souche doit être utilisée avant 18 heures de croissance pendant la nuit. Lors de l’utilisation d’un spectrophotomètre pour la première fois, il est important d’obtenir d’abord la ferme de la colonie dans le nombre d’unités, pour corréler aux valeurs de densité optique.Par conséquent, les expériences commenceront à utiliser le milieu de la phase de croissance dans la concentration cellulaire initiale de 10 à sept cellules par millilitre. Il a été démontré que cette concentration cellulaire fournit les biofilms de matière les plus dépendants et les plus stables. Pour commencer, suspendre 65 grammes de SDA, complétés par 50 milligrammes par litre de chloramphéniphénicol, dans 1000 millilitres d’eau distillée dans un bécher.Déposer le bécher sur un radiateur pour faire bouillir, afin de dissoudre complètement le milieu. Ensuite, transférez les supports dans une bouteille en verre. Placez le bouchon sur la bouteille, mais ne le vissez pas complètement pour vous assurer que la bouteille est capable de se défouler.Placez la bouteille dans un autoclave pour stériliser la solution à 15 PSI et 121 degrés Celsius pendant 30 minutes. Refroidir la solution à environ 45 degrés Celsius. Utilisez une pipette jetable et stérile, pour bien mélanger, et pipette 20 millilitres de SDA dans des plaques de Petri stériles.Pour préparer ynb moyen, complété avec 100 millimolar glucose, mélanger 6,7 grammes de YNB et 18 grammes de dextrose à 1000 millilitres d’eau ultra pure dans un bécher. Placer un émoi dans le bécher et mettre le bécher sur une plaque à remuer pour mélanger. Filtrer le milieu à travers un système de filtre à vide de 0,22 micromètre pour stériliser.Préparer rpmi moyen en mélangeant 10,4 grammes de RPMI-1640 et 34 grammes de MOPS, à 1000 millilitres d’eau ultra pure. Mélanger dans un agitateur sans chaleur et ajuster le PH à sept en ajoutant un hydroxyde de sodium normal. Stériliser le milieu à l’aide d’un système de filtre à vide de 0,22 micromètre.Tout d’abord, décongeler le micro-organisme Candida albicans SN 425 à température ambiante. Graine 10 microlitres de la culture stop sur les plats Petri précédemment préparés contenant du SDA, complétés par du chloramphéniphénol. Incuber les boîtes de Pétri aérobiement à 37 degrés Celsius pendant 48 heures.Pour le pré-inoculum utiliser un lubrifiant stérilisé pour ramasser 10 colonies d’albicans Candida dans les boîtes de Petri et les placer dans un tube de centrifugeuse contenant 10 millilitres de milieu YNB, complétée par du glucose. Incuber le tube aérobiement à 37 degrés Celsius pendant 16 heures. Ensuite, préparez les inoculums en ajoutant cette culture de démarrage dans le milieu frais de YNB, complété avec le glucose, dans une proportion à 10 pour la dilution.Utilisez le spectrophotomètre pour mesurer l’OD initial à 540 nanomètres. Incuber les inoculums aérobiement à 37 degrés Celsius pendant huit heures, et mesurer l’OD final à 540 nanomètres. Soustrayez l’OD final de l’OD initial pour vérifier si l’OD des inoculums est sur la phase de croissance de mi-journal.Pour obtenir un inoculum avec 10 à sept cellules par millilitre, centrifugez l’inoculum pendant cinq minutes à 5 500 fois G.Versez le supernatant dans un bécher contenant de l’hypochlorite de sodium et ajoutez du YNB frais pour concentrer l’inoculum à la moitié du volume précédent. Ajouter un millilitre de l’inoculum à chaque puits d’une plaque de polystyrène de 24 puits. Incuber aérobiement à 37 degrés Celsius pendant 90 minutes pour permettre l’adhérence cellulaire au fond des puits.Traitez les biofilms pendant une minute avec un millilitre de chlorhexidine de 0,12 % pour les biofilms de contrôle positif. Pour le contrôle négatif, traiter les biofilms pendant une minute avec un millilitre de chlorure stérile de sodium à 0,89 %. Par la suite, lavez les puits deux fois, une minute chacun, avec un millilitre de chlorure stérile de sodium de 0,89 % pour éliminer les cellules non adhérentes.Allumez ensuite une lumière rouge non cohérente et utilisez un compteur de puissance pour mesurer la densité de puissance de la lumière. Déterminer le temps d’exposition en fonction de l’exigence de densité énergétique de 87,6 joules par centimètre carré. Placez la plaque sous le feu rouge.Gardez la distance entre la source de lumière et le biofilm à cinq millilitres pour éviter de réchauffer l’échantillon. Après une exposition d’une minute, ajouter un millilitre du milieu rpmi stérilisé à chaque puits, et incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le matin, répétez le même lavage, traitement léger, traitements de contrôle positifs et négatifs, et incubation pendant six heures avec le milieu rpmi.Encore une fois, lavez les biofilms deux fois, exposez-les à la lumière rouge et effectuez des traitements de contrôle positifs et négatifs. Aspirer la solution dans les puits et ajouter rpmi moyen. Répétez l’incubation, le lavage, le traitement léger et les traitements de contrôle positifs et négatifs, jusqu’à ce qu’ils atteignent 48 heures de développement de biofilms.Pour commencer le traitement, jetez le milieu et ajoutez un millilitre de chlorure stérile et 0,89 % de sodium au puits, et utilisez une pointe de pipette pour rayer le biofilm du puits. Transférer le biofilm retiré dans un tube stérile. Ajouter un millilitre de chlorure stérile de 0,89 % de sodium au puits.Grattez-le à nouveau et ajoutez la suspension au même tube, pour un volume total de 2 millilitres. Vortex vigoureusement la suspension du biofilm pendant une minute. Pour l’analyse CFU, transférer un aliquot de 0,1 millilitres de la suspension du biofilm à un tube de micro centrifugeuse contenant 900 microlitres de solution de chlorure de sodium à 0,89 % pour chaque dilution.Diluer la solution biofilm de 10 à la solution négative, à 10 à quatre négative, dans la solution saline. Ensemencer 50 microlitres de chaque dilution aux plaques SDA, et incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. Comptez les colonies et appliquez la formule.Pour l’analyse du poids sec, pesez et étiquetez d’abord les tubes de micro centrifugeuse. Ajouter 0,1 millilitres de suspension biofilm et un millilitre d’éthanol absolu dans les tubes, et les stocker à 20 degrés Celsius négatifs pendant 18 heures. Ensuite, centrifugez-le 10 000 fois G pendant 10 minutes.Jeter le supernatant et placer les tubes dans un dessiccateur pour sécher les échantillons pendant une semaine. Pesez à nouveau les tubes de micro centrifugeuse et faites la soustraction pour obtenir le poids de la biomasse. Dans cette expérience, après des traitements par jour avec la lumière rouge pendant une minute aux biofilms candida albicans, le CFU a été réduit, comparé au contrôle négatif traité avec le chlorure de sodium.Les résultats de la biomasse des biofilms candida albicans après des traitements quotidiens, montrent que le groupe traité à la lumière rouge présentait une réduction similaire de la biomasse à celle observée dans le groupe témoin positif, traité avec de la chlorhexidine. Les deux groupes ont également montré une similitude statistique l’un avec l’autre. Bien qu’ils ont tous deux montré une réduction de la biomasse, par rapport au contrôle négatif traité avec du chlorure de sodium.Des quantités inférieures d’EPS soluble et insoluble de Candida albicans, ont été observées dans le contrôle positif, comparé au contrôle négatif. Même s’il n’est pas statistiquement significatif, l’application par jour de la lumière rouge a diminué numériquement les quantités d’EPS solubles et d’EPS insolubles. Le contrôle négatif et le groupe traité de lumière rouge, ont montré la similitude statistique.Mesure de la densité de puissance de la lumière, à l’aide d’un compteur de puissance avant de commencer le traitement pour déterminer les périodes exactes d’application. Les marches assurent que la densité énergétique sera toujours de 87,6 joules par centimètre au carré. Utilisez la formule précédemment citée.La mesure est faite en utilisant la même chose de la lumière à la bouteille des plaques, cinq millimètres. Une association entre la photothérapie et les médicaments antifongiques peut être étudiée pour vérifier si le prétraitement avec la lumière rouge, suivi de l’application de médicaments, améliore la pénétration des médicaments dans le biofilm. Pour le traitement deux fois par jour, nous avons adapté les protocoles de notre laboratoire, fournissant un modèle de biofilm facile et reproductible, qui fournit des réponses concernant la viabilité, le poids sec et les quantités extracellulaires de polysaccharide après traitement à la lumière rouge.Le protocole est générique et peut être utilisé pour tester d’autres thérapies, en plus de la lumière rouge, y compris les médicaments, d’autres lumières, ou la combinaison de la lumière et des médicaments. Travailler avec des micro-organismes nécessite un équipement spécial, comme des lunettes de sécurité, un manteau de laboratoire à boutons et des gants nitro.

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