Visualisation de la structure des ganglions lymphatiques et de la localisation cellulaire à l'aide de la microscopie confocale ex-Vivo

Ce protocole reproductible et facile à exécuter utilise une stratégie d’imagerie des ganglions lymphatiques ex vivo pour suivre le drainage des anticorps fluorescents étiquetés in vivo administrés aux organes lymphoïdes secondaires locaux. La démonstration de cette technique permet une visualisation spécifique de la procédure, ce qui peut faciliter une exécution réussie du protocole. Il s’agit d’une technique très simple et simple qui peut être effectuée par n’importe qui.

Le seul aspect difficile est la manipulation de la souris, qui nécessite une certaine formation. Cette technique a l’avantage d’une conservation améliorée d’effort de tissu de vitesse et de viabilité cellulaire comparée aux méthodes fluorescentes conventionnelles de coloration. La formation de la procédure serait Bruna Tatematsu, un technicien du laboratoire.

Diluer les anticorps d’intérêt, conjugués aux fluorophores appropriés, dans 100 microlitres de PBS pour l’imagerie inguinale des ganglions lymphatiques, ou 50 microlitres de PBS pour l’imagerie des ganglions lymphatiques popliteal. Pour l’imagerie inguinale des ganglions lymphatiques, chargez 100 microlitres du cocktail d’anticorps dans une seringue d’insuline d’un millilitre, équipée d’une aiguille de 30 jauges par demi-pouce, et injectez subcutanément les anticorps dans la cuisse interne de la souris expérimentale. Pour l’imagerie des ganglions lymphatiques popliteal, injecter 50 microlitres du cocktail d’anticorps sous-cutanée dans un coussin de patte de l’animal expérimental.

Ensuite, retournez l’animal dans sa boîte d’origine. Pour la récolte inguinale de ganglion lymphatique drainant, après avoir attendu au moins trois heures de l’injection, immobiliser la souris sur le stade acrylique avec du ruban adhésif et appliquer de l’huile minérale sur la peau abdominale. Utilisez des ciseaux de microchirurgie standard et des forceps incurvés en microchirurgie pour faire une incision de la peau midline dans l’abdomen du pubis au processus xyphoïde, et dissocier la musculature abdominale de la peau.

Faire des incisions horizontales de la peau dans le haut et le bas de la ligne d’incision verticale, pour créer des volets de la peau sur le côté de l’injection, et rétracter la peau pour visualiser le ganglion lymphatique. Fixez le rabat de la peau à la plaque acrylique, et utilisez les forceps pour enlever le ganglion lymphatique translucide, habituellement bilobulaire sphérique drainant. Pour la récolte popliteal drainante de ganglion lymphatique, au moins 12 heures après l’injection, immobiliser la souris dans la position encline sur un stade acrylique.

Appliquer l’huile minérale sur le mollet et le genou sur le côté injecté de l’animal. Ensuite, faire une incision de midline dans le mollet du talon au genou, et dissocier la musculature de veau de la peau. Exposez la fossa popliteal.

Le ganglion lymphatique popliteal apparaîtra comme une sphère translucide dans le fossa. Ensuite, retirez le ganglion lymphatique avec les forceps incurvés de microchirurgie. Pour préparer le ganglion lymphatique à l’imagerie, placez les organes entiers dans un plat de culture de 35 par 10 millimètres avec un fond de verre, et utilisez des forceps pour enlever toute graisse entourant le tissu.

Centrez l’organe au milieu du plat et couvrez le tissu d’un morceau d’essuie-glace délicat imbibé de solution saline. Pour l’imagerie ex vivo, placez le plat dans la fente inversée du microscope confocal et utilisez la lumière conventionnelle du microscope confocal et l’objectif 4-10X pour obtenir la mise au point correcte. Passer de la fonction de lumière au mode laser et utiliser un échantillon isotopique taché, non taché ou non fluorescent pour ajuster la puissance laser, compenser et gagner pour éliminer la fluorescence automatique et toute coloration non spécifiée.

Acquérir des images dans le cadre des objectifs 4, 10 et 20X en mettant l’accent sur la structure des ganglions lymphatiques et la distribution cellulaire et en utilisant une définition de 1024 pixels d’ici 1024. Ensuite, utilisez un logiciel d’analyse d’imagerie approprié pour séparer les canaux, pour ajouter l’échelle et les couleurs d’intérêt, et pour reconstruire la vue 3D. La puissante combinaison de l’immunolabeling des cellules de ganglion lymphatique avec des anticorps anti-CD4 et anti-CD19 et de l’analyse confocale de formation image permet la localisation des cellules de T et de B dans les ganglions lymphatiques inguinaux.

Dans les ganglions lymphatiques popliteal, comme dans le tissu inguinal, les follicules de cellules B sont entourés par des populations de lymphes T, une caractéristique de la structure des ganglions lymphatiques. Comme on l’observe dans ces images, les phagocytes n’intériorisent pas les anticorps injectés, ce qui indique que la coloration des cellules B et T est spécifique. De plus, la reconstruction de l’étiquetage indique que la coloration des cellules T et B ne se chevauche pas, confirmant ainsi la spécificité de la coloration.

Des cellules monocellulaires sont observées dans tout le ganglion lymphatique inguinal, y compris le sinus subcapsulaire. Avec la majorité des cellules mononucléaires exprimant CX3XR1, suivie par CCR2 et CXCR31CCR2 cellules doublement positives. Le même modèle de distribution cellulaire et de phénotypes cellulaires est observé dans le ganglion lymphatique popliteal.

Les deux ganglions lymphatiques présentent également des régions sombres sans expression mononucléaire des récepteurs cellulaires qui sont occupées par les lymphocytes. En outre, les cellules mononucléaires sont rares dans la zone intérieure des ganglions lymphatiques, restant concentrées dans les zones extérieures du tissu, ce qui indique que ces cellules occupent principalement le sinus subcapsulaire des ganglions lymphatiques. Le mélange d’anticorps doit être injecté avec précision dans le tissu sous-cutané pour que le système lymphatique draine correctement les anticorps vers le ganglion lymphatique.

Cette méthode peut être appliquée à la biodistribution des médicaments fluorescents étiquetés et aux études de ciblage cellulaire des nanoparticules fluorescentes étiquetées.