Name: Visualisation de la structure des ganglions lymphatiques et de la localisation cellulaire à laide de la microscopie confocale ex-Vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Découvrez l'imagerie ex-vivo des ganglions lymphatiques par microscopie confocale pour visualiser les populations de cellules T et B chez la souris. Cette méthode préserve l'intégrité tissulaire et améliore l'étude des réponses immunitaires.

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Ce travail a été soutenu par les NIH (R01 AI43458 à H.L.W.).

Le protocole a été approuvé par le Comité permanent des animaux de la Harvard Medical School et du Brigham and Women's Hospital, protocole 2016N000230.
1. Souris utilisées pour l'expérience
<ol><li>Utilisez des souris mâles et femelles de 8 semaines sur le fond B6 pour administrer le mélange d'anticorps.</li>
	<li>Utilisez des souris CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT pour déterminer si l'imagerie LN entière ex vivo peut également être appliquée à des souris reporters sans administrer de mélange d'anticorps ainsi que pour étudier la présence de cellules mononucléaires, y compris la présentation d'antigènes cellules et phagocytes, et leur distribution dans le LN. REMARQUE : Les sourisjournaliste CX3CR1GFP/WTCCR2 ont des protéines fluorescentes vertes (GFP) et des protéines fluorescentes rouges (DP) insérées sous le contrôle des promoteurs CX3CR1 et CCR2, respectivement. Les souris reporter peuvent être utilisées avec ou sans l'injection du mélange d'anticorps. S'il vous plaît voir la référence4 pour l'injection de mélange d'anticorps dans une souris journaliste. Passez à la chirurgie si aucun anticorps ne sera injecté.</li>
</ol>2. Préparation et injection de mélange d'anticorps
REMARQUE : Effectuez ces étapes sur des souris décrites à l'étape 1.1.
<ol><li>Diluer 1:10 de violette brillante (BV) 421 anti-CD4 (GK1.5; 0,2 mg/mL), 1:10 de bleu brillant (BB) 515 anti-CD19 (1D3; 0,2 mg/mL) et 1:20 de phycoérythrine (PE) anti-F4/80 (T45-2342; 0,2 mg/mL) en PBS avec le volume final approprié à injecter dans la cuisse intérieure (à l'image inguinal) ou dans la patte pad (à l'image popliteal) lymphe. REMARQUE: Utiliser comme isotypes: BV421 Mouse IgG2b, k Isotype Control (R35-38; 0.2 mg/mL); PE Rat IgG2a, contrôle de l'isotype (R35-95; 0,2 mg/mL); BB515 Rat IgG2a, contrôle isotype (R35-95; 0,2 mg/mL). Si vous modifiez l'anticorps de coloration, utilisez un isotype correct.</li>
	<li>Pour l'image inguinal LN, injecter 100 L du mélange d'anticorps sous-cutané dans la cuisse intérieure (Figure 1A). Alternativement, injectez 50 L sous-cutané de mélange d'anticorps dans le tampon de patte pour image popliteal LN (Figure 2A). Utilisez des seringues délicates d'insuline de 1 ml (insuline U-100) avec l'aiguille de taille 0,30 mm et 13 mm (30 jauge et 1/2 pouce). REMARQUE : Assurez-vous que l'injection pour la coloration inguinale de LN est sous-cutanée et non intramusculaire (i.m.), car le mélange d'anticorps ne sera pas correctement drainé si i.m. administration est exécutée.</li>
	<li>Ne pas anesthésier les animaux avant l'injection de mélange d'anticorps.</li>
	<li>Attendez un minimum de 3 h (inguinal dLN) et 12 h (popliteal dLN) après injection pour enlever les organes.</li>
	<li>Si l'étiquetage des cellules LN n'est pas complètement observé à l'aide de grands colorants fluorescents polymères tels que le violet brillant ou le bleu brillant, utilisez de plus petits fluorophores, y compris l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), PE et allophycocyanin (APC) comme alternative.</li>
</ol>3. Procédure chirurgicale pour enlever le ganglion lymphatique drainant inguinal
<ol><li>Euthanasier les souris à l'aide de l'asphyxie au CO2 suivie d'une luxation cervicale.</li>
	<li>Immobiliser les souris sur le stade acrylique avec du ruban adhésif et appliquer de l'huile minérale avec un coton-tige sur la peau abdominale pour empêcher le dépôt de fourrure autour de l'incision (Figure 1B). L'enlèvement de la fourrure n'est pas nécessaire.</li>
	<li>Effectuer une incision de la ligne médiane à l'aide de ciseaux courbés par microchirurgie (11,5 cm) et de forceps courbés microchirurgie (12,5 cm) dans l'abdomen, du pubis au processus de xiphoïde (figure 1C).</li>
	<li>Dissocier la musculature abdominale de la peau (Figure 1D).</li>
	<li>Faire des incisions horizontales de la peau en haut et en bas de la ligne d'incision verticale pour créer des rabats de la peau sur le côté de l'intérêt (selon le côté de l'injection de mélange d'anticorps) et battre la peau pour visualiser le ganglion lymphatique (Figure 1E).</li>
	<li>Tapez le rabat cutané sur la plaque acrylique (Figure 1F).</li>
	<li>Enlever le ganglion lymphatique drainant inguinal à l'aide de forceps incurvés en microchirurgie (figure 1F). Le ganglion lymphatique apparaîtra comme une sphère translucide, habituellement bilobulaire, sous la peau.</li>
</ol>4. Procédure de chirurgie pour enlever le ganglion lymphatique drainant popliteal
<ol><li>Euthanasier les souris à l'aide de l'asphyxie au CO2 suivie d'une luxation cervicale.</li>
	<li>Immobiliser les souris en position couchée sur un stade acrylique avec du ruban adhésif et appliquer de l'huile minérale avec un coton-tige dans le mollet et le genou (Figure 2A-D).</li>
	<li>Effectuer une incision de la ligne médiane dans le mollet du talon au genou (Figure 2E,F).</li>
	<li>Dissocier la musculature du veau de la peau (Figure 2F,G).</li>
	<li>Exposer la fossa popliteal (Figure 2G). Le ganglion lymphatique popliteal apparaîtra comme une sphère translucide dans la fossa popliteal.</li>
	<li>Enlever le ganglion lymphatique popliteal à l'aide de forceps incurvés en microchirurgie (Figure 2G).</li>
	<li>Alternativement, retournez la souris sur la position de supine, et approchez la fossa popliteal entre le femoris de biceps et le semitendinosus pour l'enlèvement popliteal de LN en effectuant une incision de midline dans le veau du talon au genou suivie de la dissociation du veau musculature de la peau. REMARQUE: Popliteal fossa est une dépression superficielle située à l'arrière de l'articulation du genou. Ouvrez soigneusement pour voir le ganglion lymphatique popliteal.</li>
</ol>5. Préparation des ganglions lymphatiques
<ol><li>Placer l'organe entier dans un plat de culture avec fond de verre (35 mm x 10 mm) et enlever la graisse qui entoure l'organe à l'aide de forceps incurvés microchirurgie (Figure1G-I et Figure 2H).</li>
	<li>Centraliser l'orgue au milieu du plat (figure1J et figure 2H).</li>
	<li>Couvrir l'organe d'un fragment d'essuie-glaces délicats et le garder imbibé de température ambiante saline de 0,9 % ou de phosphate buffer Solution (figure1K-M et figure 2H). REMARQUE : Il n'est pas nécessaire de laver les ganglions lymphatiques après l'ablation ou d'effectuer l'extraction des ganglions lymphatiques dans le capot.</li>
</ol>6. Microscopie confocale ex-vivo (imagerie)
<ol><li>Placez le plat Petri dans la fente de microscope confocaline inversée (figure1N et figure 2H).</li>
	<li>Image LNs sous un microscope confocal (Figure1O et Figure 2H).</li>
	<li>Tout d'abord, obtenir la mise au point correcte en utilisant la lumière conventionnelle du microscope confocal avec objectif 4x ou 10x. Ensuite, passer de la fonction de lumière au mode laser. REMARQUE : Si le microscope confocal ne contient pas d'objectif 4x, la mise au point peut être parfaitement obtenue en utilisant l'objectif 10x.</li>
	<li>Ajuster la puissance laser, compenser et gagner à l'aide d'un échantillon isotype, non taché ou non fluorescent (tableau 1) pour éliminer l'autofluorescence et la coloration non spécifique des anticorps fluorescents tels que ceux utilisés dans les images montrées dans ce manuscrit (BV-421 anti-CD4, BB515 anti-CD19 et PE anti-F4/80).</li>
	<li>Ajustez les positions Z et XY, en utilisant respectivement le micrométrique et le char sur la zone d'intérêt dans le ganglion lymphatique.</li>
	<li>Acquérir des images dans le cadre d'objectifs 4x, 10x et 20x axés sur la structure LN et la distribution cellulaire. Utilisez la définition 1024 x 1024 pixels. REMARQUE : Acquérez un minimum de cinq images dans différents champs par objectif et par animal.</li>
	<li>Analysez les images à l'aide d'un logiciel d'image pour séparer les canaux, ajouter de l'échelle et des couleurs d'intérêt, et reconstruire la vue 3D.</li>
</ol>

<ol><li>Willard-Mack, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+structure%2C+function%2C+and+histology+of+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal structure, function, and histology of lymph nodes.</a> Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).</li>
<li>Tas, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antibody+affinity+maturation+in+germinal+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers.</a> Science. 351, 1048-1054 (2016).</li>
<li>David, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Mass+Cytometry+and+Imaging+Analysis+Reveals+Origin%2C+Location%2C+and+Functional+Repopulation+of+Liver+Myeloid+Cells+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice.</a> Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).</li>
<li>Rezende, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+T+cells+control+humoral+immune+response+by+inducing+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation.</a> Nature Communications. 9, 3151(2018).</li>
<li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+triple-fluorescent+mouse+strain+allows+a+dynamic+and+spatial+visualization+of+different+liver+phagocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Anais+da+Academia+Brasileira+de+Ciencias%22%5BJournal%5D)">Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo.</a> Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317(2019).</li>
<li>Ajami, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+reveals+distinct+populations+of+brain+myeloid+cells+in+mouse+neuroinflammation+and+neurodegeneration+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models.</a> Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).</li>
<li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li>
<li>McElroy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+LYVE-1+antibody+to+image+dynamically+lymphatic+trafficking+of+cancer+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo.</a> Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).</li>
<li>Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+and+antigen+dispersal+landscapes+regulate+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).</li>
<li>Hauser, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+germinal-center+B+cell+migration+in+vivo+reveals+predominant+intrazonal+circulation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns.</a> Immunity. 26, 655-667 (2007).</li>
<li>Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+germinal+center+selection+events+during+affinity+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging of germinal center selection events during affinity maturation.</a> Science. 315, 528-531 (2007).</li>
<li>Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+splenic+marginal+zone+B-cell+shuttling+and+follicular+B-cell+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress.</a> Nature. 493, 684-688 (2013).</li>
<li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435, 969-973 (2005).</li>
<li>Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W. Jr, Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+shuttling+of+marginal+zone+B+cells+facilitates+antigen+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport.</a> Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).</li>
<li>Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid+receptor+2+mediates+the+retention+of+immature+B+cells+in+bone+marrow+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids.</a> Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).</li>
<li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+metabolic+shifts+during+neonatal+development+reprogram+liver+identity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function.</a> Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).</li>
<li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+Genome+Editing+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li>
<li>Roozendaal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conduits+mediate+transport+of+low-molecular-weight+antigen+to+lymph+node+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles.</a> Immunity. 30, 264-276 (2009).</li>
<li>Sarder, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-near-infrared+multiphoton+microscopy+interrogates+intact+tissues+at+deeper+imaging+depths+than+conventional+single-+and+two-photon+near-infrared+excitation+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes.</a> Journal of Biomedical Optics. 18, 106012(2013).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

La combinaison de l'imagerie avec d'autres techniques, y compris la biologie moléculaire et l'immunophénotypage de haute dimension a amélioré notre capacité d'étudier les cellules immunitaires dans leur contexte natif. En fait, alors que d'autres approches peuvent nécessiter la digestion des tissus et l'isolement cellulaire - ce qui peut conduire à la perte de l'intégrité des tissus - l'utilisation de l'imagerie in vivo ou ex vivo accorde un grand avantage dans l'étude de différents sous-types cellulaires d'une manière g...

Les ganglions lymphatiques (LN) sont des organes en forme d'ovoïde largement présents dans tout le corps avec la fonction cruciale de combler les réponses immunitaires innées et adaptatives. Les LN filtrent la lymphe afin d'identifier les particules étrangères et les cellules cancéreuses pour monter une réponse immunitaire contre eux1. Les cellules de présentation d'antigènes (APC), les lymphocytes T et les cellules B travaillent aux côtés pour générer des anticorps spécifiques à l'antigène (immunité humoristique) et des lymphocytes cytotoxiques (immunité cellulaire) pour éliminer les particules étrangères et les cellules cancéreuses2. Ainsi, la compréhension de la dynamique des cellules immunitaires présentes dans le système lymphatique aura des implications importantes pour le développement du vaccin et l'immunothérapie contre le cancer.
L'avènement de microscopes puissants - y compris de nouveaux microscopes confocal et super résolution - a permis un progrès extraordinaire dans la compréhension de la façon dont les différentes populations de cellules immunitaires se comportent dans leur environnement indigène3. Il est maintenant possible d'imager plusieurs sous-types cellulaires simultanés à l'aide d'une combinaison de sondes avec des souris génétiquement modifiées qui expriment des protéines fluorescentes sous contrôle de cibles spécifiques4,5. En fait, les techniques de haute dimension, y compris la cytométrie de masse et l'analyse multi-paramétrique de flux ont été cruciales pour élargir nos connaissances sur la compartimentation et la fonctionnalité de cellules immunitaires différentes dans la santé et la maladie6, 7. Cependant, pour préparer des échantillons pour ces techniques, les tissus ont besoin de digestion et les cellules sont séparées de leur milieu naturel pour être analysées dans des suspensions cellulaires. Pour dépasser ces limitations et permettre une meilleure traduction en biologie, l'objectif du protocole proposé ici est d'appliquer une méthodologie simple pour l'image ex vivo ganglions lymphatiques entiers en utilisant des microscopes confocal stock avec l'avantage d'une vitesse améliorée, tissu la préservation de la structure et la viabilité cellulaire par rapport à la coloration immunofluorescence conventionnelle. En utilisant cette approche, nous avons pu montrer que les souris déficientes pour les lymphocytes T, un sous-type de lymphocyte T impliqué dans la défense précoce de l'hôte contre les agents pathogènes4, ont compromis les follicules et les zones de cellules T par rapport aux souris de type sauvage. Ces résultats nous ont permis de poursuivre une étude dans laquelle nous avons démontré que les lymphocytes T jouent un rôle critique dans l'homéostasie des organes lymphoïdes et la réponse immunitaire humoristique4. En outre, ce protocole fournit une voie physiologique pour que les sondes et les anticorps atteignent le ganglion lymphatique, car ils sont administrés sous-cutanée et se dissipent par la circulation lymphatique de tissu, s'appuyant sur les rapports précédents qui ont employé l'étiquetage in situ avec des anticorps pour visualiser les structures lymphatiques-associées8,9, dynamique germinale centre10,11,12, et les cibles facilement accessibles à la circulation sanguine13 ,14,15.

<table><tbody><tr><td>BV421 anti-CD4</td><td>BD Horizon</td><td>562891</td><td>GK1.5 ; 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>BB515 anti-CD19</td><td>BD Horizon</td><td>564509</td><td>1D3 ; 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>BB515 Rat IgG2a, &kappa ; Contrôle des isotypes</td><td>BD Horizon</td><td>564418</td><td>R35-95 ; 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>BV421 Souris IgG2b, K Contrôle des isotypes</td><td>BD Horizon 562603</td><td></td><td>R35-38 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>Cellview Plat de culture</td><td>Greiner-Bio</td><td>627861</td><td>35x10 mm avec fond en verre</td></tr><tr><td>Seringues à insuline</td><td>BD Plastipak-Insulin</td><td></td> <td>U-100</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech Science Marque</td><td>7557</td><td>taille 21 x 20 cm / 100 feuilles par boîte</td></tr><tr><td>Pince incurvée de microchirurgie</td><td>Instruments chirurgicaux WEP sur</td><td>mesure</td><td>12,5 cm</td></tr><tr><td>Ciseaux incurvés de microchirurgie</td><td>Instruments chirurgicaux WEP fabriqués</td><td>sur mesure</td><td>11,5 cm</td></tr><tr><td>Aiguille</td><td>BD PrecisionGlide-30</td><td></td> <td>jauge & temps ; &frac12 ; pouce</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Te + A1R tête confocale</td><td>Nikon</td><td>-</td><td>chargé avec 4 lignes laser principales (405, 488, 543 et 647 nm)</td></tr><tr><td>PE anti-F4/80</td><td>BD Pharmigen</td><td>565410</td><td>T45-2342 ; 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>PE Rat IgG2a, &kappa ; Isotype Control</td><td>BD Pharmigen</td><td>553930</td><td>R35-95 ; 0,2 mg mL-1</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 710 Microscope confocal Zeiss avec</td><td></td><td></td> <td>4 lignes laser principales (405, 488, 543 et 647 nm)</td></tr></tbody></table>

visualisation de la structure des ganglions lymphatiques et de la localisation cellulaire à l'aide de la microscopie confocale ex-vivo

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Les ganglions lymphatiques (LN) sont des organes répartis dans le corps, où les réponses immunitaires innées peuvent se connecter à l'immunité adaptative. En fait, les LN sont stratégiquement interposés dans le chemin des vaisseaux lymphatiques, permettant le contact intime des antigènes de tissu avec toutes les cellules immunitaires résidentes dans le LN. Ainsi, la compréhension de la composition cellulaire, de la distribution, de l'emplacement et de l'interaction à l'aide de l'imagerie LN complète ex vivo permettra d'ajouter à la connaissance sur la façon dont le corps coordonne les réponses immunitaires locales et systémiques. Ce protocole montre une stratégie d'imagerie ex vivo à la suite d'une administration in vivo d'anticorps fluorescents qui permet une méthodologie très reproductible et facile à réaliser en utilisant des microscopes confocals conventionnels et des réactifs. Grâce à l'injection sous-cutanée d'anticorps, il est possible d'étiqueter différentes populations cellulaires dans le drainage des LN sans affecter les structures tissulaires qui peuvent être potentiellement endommagées par une technique conventionnelle de microscopie d'immunofluorescence.

Ce manuscrit présente des techniques pour enlever les ganglions lymphatiques inguinaux et popliteal sans endommager leur structure à la suite de l'injection d'anticorps fluorescents pour tacher des populations cellulaires spécifiques dans ces organes (figure1 et figure 2 ).
La combinaison puissante de l'immunolabeling des cellules de LN avec BV421 anti-CD4 et BB515 anti-CD19 et l'analyse de formation image confocale a défini la locali...

Ce protocole décrit une technique pour imager différentes populations de cellules dans les ganglions lymphatiques drainants sans altérations dans la structure d'organe.

Visualisation de la structure des ganglions lymphatiques et de la localisation cellulaire à l'aide de la microscopie confocale ex-Vivo

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Ce protocole reproductible et facile à exécuter utilise une stratégie d’imagerie des ganglions lymphatiques ex vivo pour suivre le drainage des anticorps fluorescents étiquetés in vivo administrés aux organes lymphoïdes secondaires locaux. La démonstration de cette technique permet une visualisation spécifique de la procédure, ce qui peut faciliter une exécution réussie du protocole. Il s’agit d’une technique très simple et simple qui peut être effectuée par n’importe qui.Le seul aspect difficile est la manipulation de la souris, qui nécessite une certaine formation. Cette technique a l’avantage d’une conservation améliorée d’effort de tissu de vitesse et de viabilité cellulaire comparée aux méthodes fluorescentes conventionnelles de coloration. La formation de la procédure serait Bruna Tatematsu, un technicien du laboratoire.Diluer les anticorps d’intérêt, conjugués aux fluorophores appropriés, dans 100 microlitres de PBS pour l’imagerie inguinale des ganglions lymphatiques, ou 50 microlitres de PBS pour l’imagerie des ganglions lymphatiques popliteal. Pour l’imagerie inguinale des ganglions lymphatiques, chargez 100 microlitres du cocktail d’anticorps dans une seringue d’insuline d’un millilitre, équipée d’une aiguille de 30 jauges par demi-pouce, et injectez subcutanément les anticorps dans la cuisse interne de la souris expérimentale. Pour l’imagerie des ganglions lymphatiques popliteal, injecter 50 microlitres du cocktail d’anticorps sous-cutanée dans un coussin de patte de l’animal expérimental.Ensuite, retournez l’animal dans sa boîte d’origine. Pour la récolte inguinale de ganglion lymphatique drainant, après avoir attendu au moins trois heures de l’injection, immobiliser la souris sur le stade acrylique avec du ruban adhésif et appliquer de l’huile minérale sur la peau abdominale. Utilisez des ciseaux de microchirurgie standard et des forceps incurvés en microchirurgie pour faire une incision de la peau midline dans l’abdomen du pubis au processus xyphoïde, et dissocier la musculature abdominale de la peau.Faire des incisions horizontales de la peau dans le haut et le bas de la ligne d’incision verticale, pour créer des volets de la peau sur le côté de l’injection, et rétracter la peau pour visualiser le ganglion lymphatique. Fixez le rabat de la peau à la plaque acrylique, et utilisez les forceps pour enlever le ganglion lymphatique translucide, habituellement bilobulaire sphérique drainant. Pour la récolte popliteal drainante de ganglion lymphatique, au moins 12 heures après l’injection, immobiliser la souris dans la position encline sur un stade acrylique.Appliquer l’huile minérale sur le mollet et le genou sur le côté injecté de l’animal. Ensuite, faire une incision de midline dans le mollet du talon au genou, et dissocier la musculature de veau de la peau. Exposez la fossa popliteal.Le ganglion lymphatique popliteal apparaîtra comme une sphère translucide dans le fossa. Ensuite, retirez le ganglion lymphatique avec les forceps incurvés de microchirurgie. Pour préparer le ganglion lymphatique à l’imagerie, placez les organes entiers dans un plat de culture de 35 par 10 millimètres avec un fond de verre, et utilisez des forceps pour enlever toute graisse entourant le tissu.Centrez l’organe au milieu du plat et couvrez le tissu d’un morceau d’essuie-glace délicat imbibé de solution saline. Pour l’imagerie ex vivo, placez le plat dans la fente inversée du microscope confocal et utilisez la lumière conventionnelle du microscope confocal et l’objectif 4-10X pour obtenir la mise au point correcte. Passer de la fonction de lumière au mode laser et utiliser un échantillon isotopique taché, non taché ou non fluorescent pour ajuster la puissance laser, compenser et gagner pour éliminer la fluorescence automatique et toute coloration non spécifiée.Acquérir des images dans le cadre des objectifs 4, 10 et 20X en mettant l’accent sur la structure des ganglions lymphatiques et la distribution cellulaire et en utilisant une définition de 1024 pixels d’ici 1024. Ensuite, utilisez un logiciel d’analyse d’imagerie approprié pour séparer les canaux, pour ajouter l’échelle et les couleurs d’intérêt, et pour reconstruire la vue 3D. La puissante combinaison de l’immunolabeling des cellules de ganglion lymphatique avec des anticorps anti-CD4 et anti-CD19 et de l’analyse confocale de formation image permet la localisation des cellules de T et de B dans les ganglions lymphatiques inguinaux.Dans les ganglions lymphatiques popliteal, comme dans le tissu inguinal, les follicules de cellules B sont entourés par des populations de lymphes T, une caractéristique de la structure des ganglions lymphatiques. Comme on l’observe dans ces images, les phagocytes n’intériorisent pas les anticorps injectés, ce qui indique que la coloration des cellules B et T est spécifique. De plus, la reconstruction de l’étiquetage indique que la coloration des cellules T et B ne se chevauche pas, confirmant ainsi la spécificité de la coloration.Des cellules monocellulaires sont observées dans tout le ganglion lymphatique inguinal, y compris le sinus subcapsulaire. Avec la majorité des cellules mononucléaires exprimant CX3XR1, suivie par CCR2 et CXCR31CCR2 cellules doublement positives. Le même modèle de distribution cellulaire et de phénotypes cellulaires est observé dans le ganglion lymphatique popliteal.Les deux ganglions lymphatiques présentent également des régions sombres sans expression mononucléaire des récepteurs cellulaires qui sont occupées par les lymphocytes. En outre, les cellules mononucléaires sont rares dans la zone intérieure des ganglions lymphatiques, restant concentrées dans les zones extérieures du tissu, ce qui indique que ces cellules occupent principalement le sinus subcapsulaire des ganglions lymphatiques. Le mélange d’anticorps doit être injecté avec précision dans le tissu sous-cutané pour que le système lymphatique draine correctement les anticorps vers le ganglion lymphatique.Cette méthode peut être appliquée à la biodistribution des médicaments fluorescents étiquetés et aux études de ciblage cellulaire des nanoparticules fluorescentes étiquetées.

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