Biosynthèse d'un Flavonol d'un Flavanone par l'établissement d'une cascade bienzymatique d'un pot
14 août 2019
La dérivation d'un flavonol est cruciale pour son application dans les soins de santé et l'industrie alimentaire. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la biosynthèse d'un flavonol à partir d'un flavanone et discuter des étapes cruciales et de ses avantages par rapport à d'autres approches.
En utilisant ce protocole, nous pouvons facilement produire un certain nombre de flavonols à partir de flavanones dans un pot. Cette technique permet d’économiser du travail et du temps, d’être très rentable et facile à contrôler, ce qui lui permet d’avoir un énorme potentiel d’industrialisation. Oui, cette méthode peut donner un aperçu de la production économique d’autres métabolites secondaires, mais elle a besoin de quelques modifications lorsqu’elle y est appliquée.
Il n’aura généralement rien ou très faible rendement. Mon conseil est de manipuler les enzymes recombinantes sur la glace et d’ajouter 10% de glycérine à la solution stock des enzymes. C’est parce que ce n’est qu’à travers la démonstration visuelle qu’une nouvelle main peut comprendre les détails importants et la vérité affectant l’exécution réussie de l’expérience.
Préparez d’abord des tampons. Faites deux fois tampon synthétique en dissolvant la quantité appropriée de tris-base, ascorbate de sodium, acide alpha ketoglutaric dans l’eau dé-ionisée, et pipette quantité appropriée de glycérol à la solution. Utilisez une pipette pour ajouter de l’acide chlorhydrique pour ajuster le pH à 7,2 et ajuster le volume en ajoutant de l’eau déionisée.
Conservez le tampon deux fois synthétique à quatre degrés Celsius pour une utilisation future. Ensuite, faire une solution 100 fois stock en dissolvant l’héptahydrate de sulfate ferreux dans l’eau déionisée. Faire une solution de stock de flavonoïde de 25 millimolaires en dissolvant flavonoïde dans le méthanol, et stocker la solution à moins 20 degrés Celsius.
L’étape la plus critique est de mettre en place un système synthétique. Pour mettre en place un système synthétique pour produire un flavanol à partir d’un flavanone, préparez d’abord le système synthétique dans un tube de deux millilitres selon les réhésifs énumérés dans ce tableau. Placez le tube ouvert dans un bloc de chaleur secouant à 40 degrés Celsius, à 600 rpm pendant quarante minutes.
Après cela, mettre fin à la réaction en ajoutant 10 microlitres d’acide acétique, et 100 microlitres d’acétate d’éthyle. Deux heures plus tard, utilisez une pipette pour transferer la phase organique supérieure dans un tube de 1,5 millilitre et placez le tube dans un capot pour le séchage à l’air à température ambiante. Pour effectuer l’analyse de TLC, récupérez d’abord les tubes du capot, et redissolvez la poudre flavanoïde dans 160 microlitres de méthanol dans un tube.
Préparez des échantillons flavonoïdes authentiques avec des concentrations en série, en diluant la solution de stock flavonoïde de 25 millimlaires dans le méthanol. Chargez un microlitre de l’échantillon de réaction redissolide, et un microlitre de l’échantillon flavonoïde authentique, sur une plaque de polyamide. Faites de même pour les autres concentrations de flavonoïdes authentiques sur la même plaque.
Ensuite, dans un capot de fumée, mettre la plaque chargée échantillon dans un cylindre de chromatographie rempli d’un système de solvant. Fixez la plaque au fond du cylindre et exécutez la plaque dans le système de solvant pendant 20 minutes. Sécher à l’air les assiettes à température ambiante.
À l’intérieur d’un vaporisateur, vaporiser les assiettes d’une solution éthanolique de chlorure d’aluminium, puis sécher à nouveau à la température ambiante pendant 30 minutes. Visualisez les taches sur les plaques sous une lumière UV à 254 nanomètres, et prenez des images, puis sur l’ordinateur, ouvrez le logiciel ImageJ. Cliquez sur fichier, ouvert, pour ouvrir l’image à analyser.
Cliquez sur l’outil de sélection le plus rectangulaire gauche de l’interface utilisateur ImageJ. Décrivons le retour sur investissement dans l’image avec la souris, et appuyez sur un pour étiqueter le premier retour sur investissement. Déplacez la sélection rectangulaire avec la souris directement sur le roi suivant, et appuyez sur deux pour étiqueter le deuxième retour sur investissement.
Répétez l’étiquetage de toutes les autres IA en appuyant sur deux. Appuyez sur trois pour générer des parcelles de profil pour toutes les IA, dans une fenêtre contexturée. Ensuite, utilisez l’outil de sélection en ligne droite pour laisser tomber les lignes de base afin de définir une zone fermée pour chaque pic d’intérêt.
Activez l’outil baguette magique, en cliquant sur l’icône correspondante dans l’interface utilisateur ImageJ. Cliquez à l’intérieur du pic pour afficher les résultats de tous les pics dans une fenêtre contextée. Ensuite, dans Excel, tracer les valeurs grises de la fenêtre pop-up par rapport aux concentrations flavonoïdes correspondantes, pour faire une courbe standard basée sur TLC de l’authentique flavonoïde.
Calculez ensuite le rendement du flavonoïde d’intérêt produit dans ce protocole, selon la formule qui en résulte. Utilisez une seringue pour traiter chaque échantillon séquentiellement à l’aide d’un filtre de 0,45 micromètre et de 0,22 micromètre. Chargez les échantillons dans un système HPLC-MS à l’aide d’une buse d’aspiration et séparez les échantillons à 30 degrés Celsius à l’aide d’une colonne C18.
Elute la colonne à un millilitre par minute par un gradient de 10 à 85 pour cent de nitrile d’acétyl dans l’eau, et de surveiller l’absorption de l’éléuate de 200 à 800 nanomètres. Effectuez l’analyse LC-MS en mode i jion négatif, avec un débit d’azote de séchage de 10 litres par minute à 300 degrés Celsius, dans un flux de gaz de gaine de sept litres par minute à 250 degrés Celsius, et recueillez des données à l’aide d’un logiciel intégré. Pour extraire des chromatographes à longueur d’onde unique, ouvrez le programme d’analyse qualitative et cliquez sur fichier, fichier de données ouvert.
Sélectionnez le fichier à analyser dans la fenêtre de fichier de données ouvertes, et cliquez sur ouvert pour ouvrir le fichier. Cliquez à droite sur la souris dans la fenêtre de résultats chromatogramme, puis extraire des chromatogrammes dans un menu pop-up. Dans la liste des types, cliquez sur d’autres chromatogrammes.
Dans la boîte combo détecteur, sélectionnez DAD1, puis cliquez bien pour afficher les résultats HPLC dans la fenêtre de résultats du chromatogramme. Cliquez sur l’icône d’intégration manuelle amarrée en haut de la fenêtre de résultats du chromatogramme. Dessinez la ligne de base pour le pic requis pour l’analyse manuelle de l’intégration avec la souris.
Cliquez sur afficher, liste de pic d’intégration, pour afficher les résultats. Copiez les résultats des zones de pointe à Excel, et tracez une courbe standard basée hplc du flavonoïde authentique par rapport aux concentrations flavonoïdes correspondantes, puis calculez le rendement du flavonoïde d’intérêt produit dans ce protocole selon la formule résultante. Répétez ensuite les mêmes procédures pour extraire des chromatogrammes à longueur d’onde unique afin d’analyser les données sur la SP pour la masse exacte des composés flavonoïdes.
Cliquez sur l’icône sélectionner la plage sur la barre d’outils des résultats du chromatogramme. Sélectionnez le pic d’intérêt. Cliquez à droite sur la souris dans la plage sélectionnée, et cliquez sur le spectre ms extrait dans le menu pop-up pour afficher les résultats dans la fenêtre de résultats du spectre MS.
Pour déterminer si ce système in vitro peut être utilisé pour la conversion d’une flavanone en flavonol, nrn a été ajouté dans le système. Deux nouvelles taches sont apparues sur une plaque de TLC en polyamide. Un endroit a montré une distance de migration similaire à celle de DHK, et l’autre similaire à celle de KMF.
Une analyse plus poussée par HPLC et LC-MS a démontré que le nouveau produit chimique a montré un temps de rétention de 12 minutes et 20 minutes respectivement, dans un pic d’ions quasi moléculaire M au-dessus de Z à 287 et 285 qui étaient identiques à ceux de DHK et KMF. Pour déterminer si le système peut être utilisé pour la conversion d’autres flavanones en flavonols correspondants, erd a été ajouté dans le système. Deux nouvelles taches sur une plaque TLC en polyamide affichaient une distance de migration similaire à celle du DHQ et du QRC respectivement.
Les analyses HPLC et LC-MS ont démontré que ces nouveaux produits chimiques ont révélé un temps de rétention de 10 minutes et 16 minutes respectivement, et un pic iion quasi moléculaire M au-dessus de Z à 303 et 301, ce qui correspondait exactement à ceux du DHQ et du QRC. Lors de la préparation du système synthétique, vous devez ajouter l’enzyme enfin, et ajouter le sulfate ferreux avant-dernier. Oui, il fournit un guide pour la production économique d’autres métabolites secondaires.
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Aperçu
Cet article présente un protocole de biosynthèse de flavonols à partir de flavanones, en soulignant ses avantages dans les domaines de la santé et de l'industrie alimentaire. La méthode est efficace, rentable et possède un potentiel industriel important.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biochimie
- Pharmacologie
- Science des aliments
Contexte
- Les flavonols sont des composés importants dans diverses applications.
- Les méthodes traditionnelles de synthèse peuvent être laborieuses et coûteuses.
- Cette étude vise à améliorer l'efficacité de la production de flavonols.
- Comprendre le processus de biosynthèse peut permettre d'obtenir de meilleurs rendements et de nouvelles applications.
Objectif de l'étude
- Présenter un protocole détaillé de biosynthèse des flavonols.
- Discuter des avantages de cette méthode par rapport aux approches traditionnelles.
- Explorer le potentiel d'industrialisation de la technique.
Méthodes utilisées
- Synthèse en un seul récipient des flavonols à partir des flavanones.
- Utilisation d'enzymes recombinantes avec des recommandations spécifiques de manipulation.
- Démonstrations visuelles pour faciliter la compréhension du protocole.
- Discussion des modifications nécessaires pour d'autres métabolites secondaires.
Résultats principaux
- Le protocole permet d'économiser du temps et de la main-d'œuvre.
- Il est très rentable et facile à maîtriser.
- Potentiel de hauts rendements avec une manipulation adéquate des enzymes.
- Apercus sur la production économique de métabolites secondaires.
Conclusions
- La méthode offre une alternative viable pour la production de flavonols.
- Elle a des implications importantes pour les applications industrielles.
- Des modifications supplémentaires pourraient améliorer son applicabilité à d'autres composés.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
Cette cascade enzymatique permet une production efficace in vitro de flavonols à partir de flavanones, offrant une voie échelonnée et rentable pour générer des squelettes de flavonoïdes pertinents sur le plan pharmacologique. Le système bi-enzymatique en un seul réacteur réduit la complexité du procédé et permet une génération rapide d'analogues de produits naturels pour le criblage en phase précoce. Sa compatibilité avec l'expression recombinante dans E. coli facilite son intégration dans des plateformes de production microbienne pour la dérivation de métabolites secondaires.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'analyse des relations structure-activité en offrant un accès à des produits flavonoliques définis à partir de précurseurs flavanones.
- Valeur opérationnelle : Facilite la synthèse rapide d'analogues de flavonoïdes pour des études sur l'interaction avec des cibles et la modulation de voies métaboliques.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Produit des composés de flavonols purifiés, utilisables comme étalons de référence dans des dosages biochimiques et cellulaires.
- Valeur opérationnelle : Génère des résultats quantifiables par CCM et HPLC/LC/MS, permettant la standardisation et la reproductibilité des dosages.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Permet la réduction des risques mécanistiques en fournissant des métabolites authentiques de flavonols pour évaluer la biodisponibilité et l'activité biologique dans des systèmes pertinents pour la maladie.
- Valeur opérationnelle : Permet la production continue de composés d'essai pour les profils précliniques et les workflows d'optimisation des candidats médicaments.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation précoce de cibles jusqu'à l'identification de composés candidats, en fournissant une source fiable de composés flavonoïdes pour l'évaluation en aval.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses sur les voies médiées par les flavonols en permettant la synthèse contrôlée d'analogues spécifiques.
- Criblage : Fournit des composés prêts à être utilisés dans des tests et de pureté définie, soutenant les campagnes de criblage à haut débit et les criblages secondaires.
- Analytique : Génère des données de HPLC et de LC/MS adaptées à la quantification, à la confirmation de l'identité et à l'analyse comparative entre différentes conditions réactionnelles.
- Recherche translationnelle : Fournit des étalons de flavonols destinés à être utilisés dans des modèles précliniques pour évaluer l'interaction avec la cible et la modulation de la voie.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme enzymatique réutilisable pour générer des bibliothèques de flavonoïdes dans plusieurs projets et domaines thérapeutiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans les études de relations structure-activité (SAR) des flavonoïdes en fournissant des produits synthétiques purs et reproductibles.
- Valeur opérationnelle : Réduit le temps et la main-d'œuvre nécessaires à la synthèse grâce à une cascade en un seul réacteur, améliorant ainsi le débit et l'efficacité des réactifs.
- Valeur stratégique : Diminue le coût de production des flavonols, permettant une exploration plus large de l'espace chimique des flavonoïdes en phase précoce de découverte.
- Impact sur le portefeuille : Favorise une priorisation ajustée au risque en permettant une génération rapide d'analogues pour des décisions d'orientation (go/no-go) dans les programmes centrés sur les flavonoïdes.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en expression de protéines recombinantes, purification d'enzymes et optimisation des réactions enzymatiques.
- Dépend de l'accès à des tubes chauffants agitateurs, des plaques de CCM, des systèmes HPLC-MS et des réactifs analytiques standards.
- Exige la préparation standardisée de tampons et des protocoles de manipulation des enzymes (par exemple, stockage à froid, ajout de glycérol) pour assurer la reproductibilité.
- L'adaptation à d'autres substrats flavanones peut nécessiter l'optimisation des rapports enzymatiques, des concentrations en cofacteurs ou de la durée de réaction.
- L'isolement du produit repose sur une extraction liquide-liquide et une évaporation, ce qui peut limiter l'automatisation en l'absence d'équipements supplémentaires.
Foire aux questions sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:04
Title
1:13
Produce a Flavonol from a Flavanone in an in vitro Bienzyme Synthetic System
2:48
Thin Layer Chromatography (TLC) Analysis
5:21
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and Liquid Chromatography/ Mass Spectrometry (LC/MS) Analyses
7:50
Results: Conversion of Flavanone into Flavono
9:16
Conclusion
![Cercosporin-Photocatalyzé [4+1]- et [4+2]-Annulations d’Azoalkenes dans des conditions douces](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F60786.jpg%3Fv%3D2026-07-04T08%253A08%253A27.000Z&w=384&q=75)
