Biosynthèse d'un Flavonol d'un Flavanone par l'établissement d'une cascade bienzymatique d'un pot

En utilisant ce protocole, nous pouvons facilement produire un certain nombre de flavonols à partir de flavanones dans un pot. Cette technique permet d’économiser du travail et du temps, d’être très rentable et facile à contrôler, ce qui lui permet d’avoir un énorme potentiel d’industrialisation. Oui, cette méthode peut donner un aperçu de la production économique d’autres métabolites secondaires, mais elle a besoin de quelques modifications lorsqu’elle y est appliquée.

Il n’aura généralement rien ou très faible rendement. Mon conseil est de manipuler les enzymes recombinantes sur la glace et d’ajouter 10% de glycérine à la solution stock des enzymes. C’est parce que ce n’est qu’à travers la démonstration visuelle qu’une nouvelle main peut comprendre les détails importants et la vérité affectant l’exécution réussie de l’expérience.

Préparez d’abord des tampons. Faites deux fois tampon synthétique en dissolvant la quantité appropriée de tris-base, ascorbate de sodium, acide alpha ketoglutaric dans l’eau dé-ionisée, et pipette quantité appropriée de glycérol à la solution. Utilisez une pipette pour ajouter de l’acide chlorhydrique pour ajuster le pH à 7,2 et ajuster le volume en ajoutant de l’eau déionisée.

Conservez le tampon deux fois synthétique à quatre degrés Celsius pour une utilisation future. Ensuite, faire une solution 100 fois stock en dissolvant l’héptahydrate de sulfate ferreux dans l’eau déionisée. Faire une solution de stock de flavonoïde de 25 millimolaires en dissolvant flavonoïde dans le méthanol, et stocker la solution à moins 20 degrés Celsius.

L’étape la plus critique est de mettre en place un système synthétique. Pour mettre en place un système synthétique pour produire un flavanol à partir d’un flavanone, préparez d’abord le système synthétique dans un tube de deux millilitres selon les réhésifs énumérés dans ce tableau. Placez le tube ouvert dans un bloc de chaleur secouant à 40 degrés Celsius, à 600 rpm pendant quarante minutes.

Après cela, mettre fin à la réaction en ajoutant 10 microlitres d’acide acétique, et 100 microlitres d’acétate d’éthyle. Deux heures plus tard, utilisez une pipette pour transferer la phase organique supérieure dans un tube de 1,5 millilitre et placez le tube dans un capot pour le séchage à l’air à température ambiante. Pour effectuer l’analyse de TLC, récupérez d’abord les tubes du capot, et redissolvez la poudre flavanoïde dans 160 microlitres de méthanol dans un tube.

Préparez des échantillons flavonoïdes authentiques avec des concentrations en série, en diluant la solution de stock flavonoïde de 25 millimlaires dans le méthanol. Chargez un microlitre de l’échantillon de réaction redissolide, et un microlitre de l’échantillon flavonoïde authentique, sur une plaque de polyamide. Faites de même pour les autres concentrations de flavonoïdes authentiques sur la même plaque.

Ensuite, dans un capot de fumée, mettre la plaque chargée échantillon dans un cylindre de chromatographie rempli d’un système de solvant. Fixez la plaque au fond du cylindre et exécutez la plaque dans le système de solvant pendant 20 minutes. Sécher à l’air les assiettes à température ambiante.

À l’intérieur d’un vaporisateur, vaporiser les assiettes d’une solution éthanolique de chlorure d’aluminium, puis sécher à nouveau à la température ambiante pendant 30 minutes. Visualisez les taches sur les plaques sous une lumière UV à 254 nanomètres, et prenez des images, puis sur l’ordinateur, ouvrez le logiciel ImageJ. Cliquez sur fichier, ouvert, pour ouvrir l’image à analyser.

Cliquez sur l’outil de sélection le plus rectangulaire gauche de l’interface utilisateur ImageJ. Décrivons le retour sur investissement dans l’image avec la souris, et appuyez sur un pour étiqueter le premier retour sur investissement. Déplacez la sélection rectangulaire avec la souris directement sur le roi suivant, et appuyez sur deux pour étiqueter le deuxième retour sur investissement.

Répétez l’étiquetage de toutes les autres IA en appuyant sur deux. Appuyez sur trois pour générer des parcelles de profil pour toutes les IA, dans une fenêtre contexturée. Ensuite, utilisez l’outil de sélection en ligne droite pour laisser tomber les lignes de base afin de définir une zone fermée pour chaque pic d’intérêt.

Activez l’outil baguette magique, en cliquant sur l’icône correspondante dans l’interface utilisateur ImageJ. Cliquez à l’intérieur du pic pour afficher les résultats de tous les pics dans une fenêtre contextée. Ensuite, dans Excel, tracer les valeurs grises de la fenêtre pop-up par rapport aux concentrations flavonoïdes correspondantes, pour faire une courbe standard basée sur TLC de l’authentique flavonoïde.

Calculez ensuite le rendement du flavonoïde d’intérêt produit dans ce protocole, selon la formule qui en résulte. Utilisez une seringue pour traiter chaque échantillon séquentiellement à l’aide d’un filtre de 0,45 micromètre et de 0,22 micromètre. Chargez les échantillons dans un système HPLC-MS à l’aide d’une buse d’aspiration et séparez les échantillons à 30 degrés Celsius à l’aide d’une colonne C18.

Elute la colonne à un millilitre par minute par un gradient de 10 à 85 pour cent de nitrile d’acétyl dans l’eau, et de surveiller l’absorption de l’éléuate de 200 à 800 nanomètres. Effectuez l’analyse LC-MS en mode i jion négatif, avec un débit d’azote de séchage de 10 litres par minute à 300 degrés Celsius, dans un flux de gaz de gaine de sept litres par minute à 250 degrés Celsius, et recueillez des données à l’aide d’un logiciel intégré. Pour extraire des chromatographes à longueur d’onde unique, ouvrez le programme d’analyse qualitative et cliquez sur fichier, fichier de données ouvert.

Sélectionnez le fichier à analyser dans la fenêtre de fichier de données ouvertes, et cliquez sur ouvert pour ouvrir le fichier. Cliquez à droite sur la souris dans la fenêtre de résultats chromatogramme, puis extraire des chromatogrammes dans un menu pop-up. Dans la liste des types, cliquez sur d’autres chromatogrammes.

Dans la boîte combo détecteur, sélectionnez DAD1, puis cliquez bien pour afficher les résultats HPLC dans la fenêtre de résultats du chromatogramme. Cliquez sur l’icône d’intégration manuelle amarrée en haut de la fenêtre de résultats du chromatogramme. Dessinez la ligne de base pour le pic requis pour l’analyse manuelle de l’intégration avec la souris.

Cliquez sur afficher, liste de pic d’intégration, pour afficher les résultats. Copiez les résultats des zones de pointe à Excel, et tracez une courbe standard basée hplc du flavonoïde authentique par rapport aux concentrations flavonoïdes correspondantes, puis calculez le rendement du flavonoïde d’intérêt produit dans ce protocole selon la formule résultante. Répétez ensuite les mêmes procédures pour extraire des chromatogrammes à longueur d’onde unique afin d’analyser les données sur la SP pour la masse exacte des composés flavonoïdes.

Cliquez sur l’icône sélectionner la plage sur la barre d’outils des résultats du chromatogramme. Sélectionnez le pic d’intérêt. Cliquez à droite sur la souris dans la plage sélectionnée, et cliquez sur le spectre ms extrait dans le menu pop-up pour afficher les résultats dans la fenêtre de résultats du spectre MS.

Pour déterminer si ce système in vitro peut être utilisé pour la conversion d’une flavanone en flavonol, nrn a été ajouté dans le système. Deux nouvelles taches sont apparues sur une plaque de TLC en polyamide. Un endroit a montré une distance de migration similaire à celle de DHK, et l’autre similaire à celle de KMF.

Une analyse plus poussée par HPLC et LC-MS a démontré que le nouveau produit chimique a montré un temps de rétention de 12 minutes et 20 minutes respectivement, dans un pic d’ions quasi moléculaire M au-dessus de Z à 287 et 285 qui étaient identiques à ceux de DHK et KMF. Pour déterminer si le système peut être utilisé pour la conversion d’autres flavanones en flavonols correspondants, erd a été ajouté dans le système. Deux nouvelles taches sur une plaque TLC en polyamide affichaient une distance de migration similaire à celle du DHQ et du QRC respectivement.

Les analyses HPLC et LC-MS ont démontré que ces nouveaux produits chimiques ont révélé un temps de rétention de 10 minutes et 16 minutes respectivement, et un pic iion quasi moléculaire M au-dessus de Z à 303 et 301, ce qui correspondait exactement à ceux du DHQ et du QRC. Lors de la préparation du système synthétique, vous devez ajouter l’enzyme enfin, et ajouter le sulfate ferreux avant-dernier. Oui, il fournit un guide pour la production économique d’autres métabolites secondaires.