Électrophorèse d’ADN à l’aide de Thiazole Orange au lieu de bromure d’éthidium ou autres colorants
31 mars 2019
Nous présentons ici un protocole pour utiliser thiazole orange pour la détection de l’ADN dans les expériences d’électrophorèse de gel. L’utilisation d’orange thiazole permet d’éliminer le bromure d’éthidium, et la détection par fluorescence peut être réalisée avec UV ou lumière bleue.
Ce protocole est une alternative facile et peu coûteuse à l’utilisation du bromure d’éthidium pour la détection de l’ADN pendant l’électrophorèse. En enlevant le bromure d’éthidium, la lumière UV ou la lumière bleue peuvent être utilisées pour la détection. La lumière bleue n’est pas dommageable pour l’ADN, ce qui améliore les chances de succès pour les expériences en aval.
C’est vraiment facile d’essayer cela. Vous n’avez qu’à remplacer le bromure d’éthidium dans vos gels par de l’orange thiazole. Pour commencer, préparez 1% de mini-gels en mélangeant environ 0,7 gramme d’agarose dans 70 millilitres de tampons tris-acétate-EDTA ou tris-borate.
Ensuite, dissoudre l’orange thiazole dans DMSO pour faire une solution de stock de 10 000 X. Bien qu’il ne soit pas particulièrement sensible à la lumière, conservez le thiazole orange dans l’obscurité lorsqu’il n’est pas utilisé. Pour un stockage à long terme, faire des aliquots du mélange thiazole orange-DMSO et les congeler.
Ensuite, ajouter l’orange thiazole à une concentration finale de 1,3 microgramme par millilitre, et micro-ondes le mélange de tampon d’agarose et d’orange thiazole pour dissoudre l’agarose pendant environ 60 secondes. Verser le mélange d’agarose dans un appareil de coulée de gel contenant un peigne approprié, et permettre à la solution agarose de se solidifier en gel. Pour charger le gel, placez d’abord le gel dans l’appareil électrophoresis, s’il n’est pas déjà présent.
Ajoutez ensuite tae ou TBE tampon en cours d’exécution pour couvrir la surface du gel. Ensuite, à l’aide d’un colorant de chargement, chargez 10 microlitres d’un échantillon d’ADN. Inclure une échelle de dimensionnement de l’ADN pour référence.
Fixez le couvercle et les électrodes, et exécutez le mini-gel à 100 volts jusqu’à ce que le colorant de chargement se déplace environ quatre à sept centimètres pour un mini-gel. Si l’orange thiazole n’a pas été appliquée avant la coulée de gel, tacher le gel en l’immergeant dans le tampon contenant de l’orange thiazole avec une agitation douce pendant environ 20 minutes ou jusqu’à ce que les bandes soient complètement détectées. Pour visualiser le gel à l’aide d’un transilluminateur UV, retirez le gel de l’appareil électrophoresis et placez-le sur le transilluminateur UV.
Pour visualiser le gel à l’aide d’un transilluminateur de lumière bleue ou d’une lampe de poche, placez le gel sur le transilluminateur de lumière bleue ou dirigez la lampe de poche LED bleue sur le gel d’en haut ou d’en bas. Utilisez un filtre d’émission d’ambre pour filtrer la lumière bleue, permettant la visualisation de la fluorescence des complexes orange thiazole d’ADN et pour protéger les colorants. Pour faciliter la digestion ou la ligature, découpez les bandes d’ADN désirées du gel et procédez à l’extraction de l’ADN à l’aide d’un kit ou d’un protocole facilement disponible.
Sélectionnez les paramètres d’excitation et d’émission appropriés dans l’appareil d’imagerie par gel. En l’absence d’un système d’imagerie avec des filtres appropriés, placez un filtre ambrée entre la caméra et la source d’excitation gel blue-light. Les limites de détection sont similaires entre le bromure d’éthidium, l’orange thiazole et un colorant commercial commun à adn détectable par la lumière bleue, la limite de détection pour les trois colorants étant d’un à deux nanogrammes par voie dans un mini-gel.
Le gel d’agarose taché d’orange thiazole d’un digest de restriction est détectable quand il est excité avec un UV ou un transilluminateur de lumière bleue ou avec une lampe de poche bleue de lumière. Bien que l’orange thiazole semble être moins dangereuse que le bromure d’éthidium, l’équipement de protection individuelle standard comme les gants et les lunettes doit encore être porté.
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Aperçu
Ce protocole présente une alternative simple et peu coûteuse au bromure d'éthidium pour la détection de l'ADN en électrophorèse sur gel. En utilisant l'orange de thiazole, les chercheurs peuvent exploiter soit la lumière UV soit la lumière bleue pour la détection par fluorescence, améliorant ainsi la sécurité de l'ADN durant les expériences.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biochimie
- Biologie moléculaire
- Techniques d'électrophorèse
Contexte
- Le bromure d'éthidium est une coloration courante de l'ADN, mais il présente des risques pour l'intégrité de l'ADN.
- Le vert de thiazole constitue une alternative plus sûre pour la visualisation de l'ADN.
- La détection par fluorescence peut être réalisée à l'aide d'une lumière bleue non dommageable.
- Cette méthode est économique et facile à mettre en œuvre.
Objectif de l'étude
- Fournir un protocole de détection de l'ADN sans utiliser le bromure d'éthidium.
- Démontrer l'efficacité de l'orange de thiazole en électrophorèse sur gel.
- Mettre en évidence les avantages de l'utilisation de la lumière bleue pour la visualisation de l'ADN.
Méthodes utilisées
- Préparation de mini-gels à 1 % à l'aide d'agarose et de tampons appropriés.
- Remplacement du bromure d'éthidium par l'orange de thiazole dans les gels.
- Détection par fluorescence à l'aide de lumière UV ou bleue.
- Évaluation de l'intégrité de l'ADN après électrophorèse.
Résultats principaux
- Le thiazole orange colore efficacement l'ADN en électrophorèse sur gel.
- La détection peut être réalisée en toute sécurité à l'aide de lumière bleue.
- Le protocole est simple et reproductible.
- Les expériences en aval montrent des taux de réussite améliorés en raison d'une réduction des dommages à l'ADN.
Conclusions
- Le thiazole orange constitue une alternative valable au bromure d'éthidium.
- L'utilisation de lumière bleue minimise les dommages de l'ADN pendant la détection.
- Cette méthode améliore la fiabilité des expériences ultérieures de biologie moléculaire.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'électrophorèse sur gel d'ADN reste un protocole fondamental dans la validation ciblée et le développement de tests, où l'intégrité de l'échantillon influence directement la fiabilité des étapes ultérieures. Le remplacement du bromure d'éthidium par l'orange de thiazole réduit le risque de génotoxicité tout en conservant la sensibilité de détection, ce qui favorise des criblages de composés et des filières d'identification de candidats-médicaments plus sûrs. Cela permet aux équipes de recherche et développement en biopharmacie de préserver la qualité de l'ADN pour des applications telles que le clonage, le séquençage ou les tests fonctionnels, sans compromettre le débit ou l'efficacité économique.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet la vérification d'hypothèses par analyse de fragments d'ADN sans introduire d'artéfacts dus à la coloration qui pourraient fausser la confirmation de la cible.
- Valeur opérationnelle : Compatible avec les infrastructures d'imagerie existantes en lumière UV ou bleue, ne nécessitant aucune refonte du protocole pour les laboratoires utilisant actuellement le bromure d'éthidium.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Fournit un dimensionnement quantitatif de l'ADN avec des limites de détection de 1 à 2 ng/voie, permettant une analyse précise des fragments dans l'évaluation de l'efficacité du clonage ou de la validation des produits de PCR.
- Valeur opérationnelle : Élimine la manipulation des déchets dangereux et les exigences particulières d'élimination associées au bromure d'éthidium, simplifiant ainsi la conformité aux normes de sécurité en laboratoire.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Préserve l'intégrité de l'ADN pour des applications en aval telles que la ligature, la transformation ou la transfection, améliorant ainsi les taux de réussite dans la génération de constructions pour les modèles précliniques.
- Valeur opérationnelle : Permet une visualisation sous lumière bleue, réduisant les dommages induits par les UV sur les échantillons et augmentant la reproductibilité entre les expériences répétées.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode s'intègre dans le flux de travail de biologie de la découverte, où l'analyse de l'ADN oriente la validation de la cible, l'identification du composé actif et le développement du construit préclinique, notamment lors de l'évaluation de modifications génétiques ou des résultats de criblage.
- Biologie de la découverte : Permet une séparation et une mesure précises de fragments d'ADN, facilitant une évaluation fiable des modifications génétiques, de l'intégrité des plasmides ou des amplicons PCR lors de la confirmation de cibles.
- Tri : Offre une visualisation quantitative et reproductible des bandes, essentielle pour évaluer la diversité des bibliothèques ou confirmer les résultats positifs dans les tests basés sur les acides nucléiques.
- Analytique : Génère des données d'intensité de fluorescence comparables entre les échantillons, permettant une comparaison cohérente du rendement ou de la pureté de l'ADN dans différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Préserve la fonctionnalité de l'ADN pour son utilisation dans la transfection de cellules de mammifères ou la production de vecteurs viraux, une étape cruciale pour faire progresser les candidats vers les essais précliniques.
- Réutilisation en entreprise : Constitue un remplacement direct de réactif pouvant être standardisé entre équipes et sites sans avoir à recertifier le matériel ou les logiciels d'électrophorèse.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en minimisant les dommages induits à l'ADN par les colorants, améliorant ainsi la fiabilité des données de biologie moléculaire utilisées pour l'évaluation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Utilise du thiazole orange peu coûteux et non dangereux, avec un stockage simple (stock concentré en DMSO, aliquoté et congelé), réduisant ainsi le coût des réactifs et les contraintes de sécurité.
- Valeur stratégique : Améliore la fiabilité des décisions d'avancement ou d'abandon en préservant l'intégrité des échantillons pour des analyses ultérieures telles que le séquençage, le clonage ou les tests fonctionnels.
- Impact sur le portefeuille : Favorise un développement ajusté au risque en garantissant que la qualité des données fondées sur l'ADN répond aux critères requis pour l'optimisation des candidats et la sélection de candidats précliniques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Expertise en biologie moléculaire en matière de préparation de gel d'agarose et d'électrophorèse.
- Appareil d'électrophorèse standard muni d'un transilluminateur UV ou à lumière bleue et d'un filtre d'émission ambre pour la détection.
- Dégel et mélange systématiques des aliquotes congelées de thiazole orange-DMSO afin d'assurer une coloration uniforme.
- Validation de l'efficacité de la coloration dans divers systèmes modèles (par exemple, ADN plasmidique, ADN génomique) lors de l'adaptation à de nouveaux types d'échantillons.
- Limite : nécessite une optimisation du temps de coloration (20 min) en cas d'utilisation d'une coloration post-électrophorèse, ajoutant ainsi une étape par rapport aux méthodes utilisant des gels préformés.
