Isolement et coloration des kératinocytes de peau de souris pour l'analyse spécifique de cycle cellulaire de l'expression cellulaire de protéine par cytométrie de masse

Ce protocole est significatif pour deux raisons principales. Numéro un, il permet à un utilisateur d’être en mesure de déterminer les états du cycle cellulaire des cellules de la peau qui ont été isolés d’un modèle animal. Il nous permet également d’être en mesure d’analyser l’expression des protéines dans les phases discrètes du cycle cellulaire.

Par rapport aux méthodes précédentes de détermination de la prolifération cellulaire, notre méthode permet une détermination plus précise des différentes phases du cycle cellulaire, et nous pouvons également analyser plus de 40 marqueurs différents dans les différentes étapes de la division cellulaire. Cela améliore considérablement l’application et la polyvalence de la méthode. Ce protocole peut être utilisé dans la recherche sur le cancer et dans tout autre type de maladie où il est nécessaire de déterminer les modèles spécifiques d’expression des protéines du cycle cellulaire.

En outre, ce protocole peut être modifié à d’autres types de cellules, et dans d’autres organismes modèles. La première fois que l’utilisateur doit se concentrer sur l’obtention de la meilleure qualité de préparation cellulaire possible. Cela nécessite le traitement opportun de la peau expérimentale à l’aide de réhésifs frais, un minimum de temps de digestion des tissus, et l’élimination minutieuse du supernatant après centrifugation pour préserver l’intégrité et la quantité des cellules.

Pour commencer, concevez un panneau d’anticorps marqué en métal à l’aide d’un logiciel gratuit de conception de panneaux en ligne, tel que décrit dans le manuscrit. Préparez ensuite une solution de stock IdU en dissolvant la poudre IdU à 10 milligrammes par millilitre dans 0,1 hydroxyde de sodium normal à 60 degrés Celsius. Après avoir aliquoting solution de stock IdU dans des tubes de microcentrifugeuse, congelez-les à moins 20 degrés Celsius pour le stockage à long terme.

Immédiatement avant l’utilisation, réglez le pH de la solution IdU à 7,5 avec 12 acide chlorhydrique normal, et testez avec une bande de pH sur un aliquot de rejet pour s’assurer que la solution est au pH 7.5. Pour préparer une solution de fixation de deux x paraformaldéhyde, combinez cinq millilitres de 10 x PBS et un millilitre de 16%PFA avec 44 millilitres d’eau distillée pure de qualité moléculaire. Pour préparer la solution de stock de cisplatine de 100 millimlaires, dissoudre 300,5 milligrammes de poudre de cisplatine en 10 millilitres de DMSO.

Pour que les expériences soient utilisées sur une journée, préparez une solution de travail au cisplatine de 10 millimlaires. Pesez les souris, puis déterminez une dose à 0,1 milligramme d’IdU par gramme de poids corporel. Administrer la dose calculée d’UDI par injection intrapénitale et attendre deux heures avant de récolter les cellules.

Utilisez une paire de ciseaux de qualité chirurgicale pour enlever chirurgicalement l’oreille de la souris euthanasiée précédemment injectée avec idu à la base de l’oreille. Déposer l’oreille sur une boîte de Pétri sèche de 100 millimètres. Séparez soigneusement l’antérieur de la peau postérieure en utilisant des forceps fins pour créer une poche au milieu ou au bord de la zone coupée, puis tirez les deux volets de la peau à part, et procéder à la fois avec les peaux antérieures et postérieures.

Placez soigneusement les peaux antérieures et postérieures d’une oreille dans un puits d’une plaque de culture de 12 puits, remplie d’un millilitre de solution de dispase/collagène fraîchement préparée, le côté derma de la peau touchant la solution. Incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure pour digérer la peau. Placer l’oreille digérée ou la peau néonatale dans une boîte de Pétri propre, le côté épiderme touchant la surface du plat.

À l’aide de forceps, aplatir la peau et glisser doucement le derme de l’épiderme en travaillant du centre vers les bords dans un motif circulaire. Avec des forceps, saisir l’épiderme sur les bords et le soulever doucement en l’épluchant de la surface de la boîte de Pétri. Placez soigneusement l’épiderme sur la solution de détachement cellulaire préchauffé dans un puits d’une plaque.

Incuber pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius ou 20 minutes à température ambiante. Utilisez des forceps stériles pour saisir l’épiderme et frotter en faisant glisser l’épiderme contre le fond du plat pour dissocier les cellules. Ajouter un millilitre de DMEM contenant 1% de FBS, et passer à travers un tamis cellulaire de 40 micromètres dans un tube de collecte.

Rincer bien avec deux millilitres supplémentaires de DMEM et ajouter à la suspension cellulaire. Après avoir centrifugé à 120 fois g pendant cinq minutes, aspirez soigneusement le surnatant. Resuspendez la pastille cellulaire en un à deux millilitres de DMEM contenant 1%FBS, et pelletez les cellules à nouveau comme précédemment.

Pour étiqueter les cellules pour déterminer les cellules vivantes et mortes, résusquer un à trois millions de cellules en un millilitre de DMEM contenant 25 micromolaires de cisplatine et incuber pendant une minute. Étanchez par pipetting avec un volume égal de FBS. Après avoir centrifugé à 120 fois g pendant cinq minutes, décanter le supernatant dans un bécher contenant de l’eau de Javel diluée, et inverser les tubes pour égoutter la solution restante sur une serviette en papier.

Resuspendez la pastille cellulaire en deux millilitres de PBS sans cation de baryum, et centrifugez-les à nouveau comme décrit précédemment. Pour fixer les cellules, résuspendez la pastille cellulaire dans un millilitre de PBS sans cation de baryum. Vortex les cellules sous basse puissance continue et ajouter un millilitre des deux x PFA fixation tampon drop-wise.

Placer sur une plate-forme à bascule et incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Après avoir centrifugé à 500 fois g pendant cinq minutes, décanter soigneusement le surnatant. Lavez les cellules avec deux millilitres de PBS sans cation de baryum, centrifugez à nouveau dans les mêmes conditions, et répétez l’étape de lavage.

Enfin, resuspendez la pastille en deux millilitres de PBS sans cation de baryum. Centrifuger les cellules à 500 fois g pendant cinq minutes et décanter soigneusement le surnatant. Resuspendez les cellules en un millilitre d’un tampon de fixation x, et incubez à température ambiante pendant 10 minutes et répétez la centrifugation.

Pour laver les cellules, ajouter un millilitre de tampon de perméabilisation du code à barres. Pendant la centrifugation cellulaire à 500 fois g pendant cinq minutes, préparer les codes à barres en y ajoutant 100 microlitres de tampon de perméabilisation du code à barres, et mélanger immédiatement. Resuspendez la pastille cellulaire dans 800 microlitres de tampon de perméabilisation du code à barres.

Ajouter la solution de code à barres aux cellules, mélanger et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Centrifugeuse à 500 fois g pendant cinq minutes. Lavez les cellules en deux millilitres de tampon de coloration cellulaire et centrifugeuse à nouveau.

Ensuite, resuspendez un à trois millions de cellules dans un millilitre de solution de travail tampon de coloration d’antigène nucléaire, et incubez à température ambiante pendant 30 minutes. Après avoir centrifugé à 500 fois g pendant cinq minutes, décanter soigneusement le surnatant. Resuspendez à nouveau les cellules dans un millilitre de tampon de perméabilisation et de centrifugeuse d’antigène nucléaire.

Après la résuspension et la centrifugation répétées, résuspendez la pastille cellulaire dans le volume résiduel avec un léger vortex. Ajouter 50 microlitres de cocktail intracellulaire d’anticorps, mélanger et incuber à température ambiante pendant 45 minutes. Ajouter deux millilitres de tampon de coloration cellulaire.

Centrifugeuse à nouveau dans les mêmes conditions que dans l’étape précédente, et enlever le surnatant. Resuspendez la pastille en deux millilitres de tampon de coloration cellulaire, centrifugeuse à 500 fois g pendant cinq minutes, et répétez la résuspendance et la centrifugation. Resuspendez les cellules en un millilitre de solution d’intercalation, et stockez pendant un à trois jours à quatre degrés Celsius.

Après avoir centrifugé les cellules à nouveau, laver la pastille avec deux millilitres de tampon de coloration cellulaire, centrifugeuse dans les mêmes conditions, et effectuer deux lavages supplémentaires avec deux millilitres d’eau, avec la même centrifugation. Resuspendez la pastille cellulaire à une concentration d’un million de cellules par millilitre avec la solution diluée de perle d’EQ, puis exécutez les échantillons sur le cytomètre de masse. Les rendements cellulaires attendus et la viabilité de l’oreille adulte de la souris et de la peau néonatale sont déterminés.

Le rendement approximatif dépend de la surface de la peau. La peau néonatale est un meilleur choix pour les expériences qui nécessitent un plus grand nombre de cellules. La stratégie de base de gating à sélectionner pour les cellules intactes, simples et viables, après normalisation et déconvolution des données de cytométrie de masse codées à barres, est montrée.

Le pourcentage de cellules viables peut indiquer la qualité ou l’état des cellules avant la coloration. Des différences dans la viabilité entre les cellules de carcinome cultivés par rapport aux cellules isolées d’oreille de souris sont montrées, aussi. Des cellules viables ont été gated sur la longueur d’événement contre CD45 pour exclure des cellules hématopoïétiques.

L’inclusion de marqueurs de lignée permet de sélection des populations cellulaires d’intérêt dans différentes phases du cycle cellulaire. Le profil de base du cycle cellulaire est obtenu par la détection du BrdU par rapport à l’IP dans la cytométrie du flux fluorescent. Cependant, l’inclusion d’autres marqueurs de prolifération avec cytométrie de masse, permet une identification plus précise des phases du cycle cellulaire.

Suivant cette approche, des profils de cycle cellulaire peuvent être construits pour différents types de cellules ou conditions expérimentales, telles que les profils de cellules négatives cd45 par rapport aux cellules positives CD45 de la même expérience. Dans un autre exemple, l’analyse des marqueurs qui définissent les voies de signalisation EGFR et mTOR PI3K dans la phase G-one, a révélé des profils d’expression similaires dans les cellules négatives CD45, montrées dans les cellules positives orange et CD45, montrées en bleu. La cytométrie de masse nécessite beaucoup de cellules de haute qualité.

Si un utilisateur s’intéresse à une population de cellules rares, un plus grand nombre de cellules peut être nécessaire. Les cellules vivantes isolées peuvent être utilisées pour l’analyse de l’ADN ou de l’ARN, des études biochimiques ou peuvent être utilisées dans la culture tissulaire avant la fixation et la coloration pour la cytométrie de masse. L’utilisateur doit utiliser un équipement de protection personnelle et une armoire de sécurité si nécessaire, lorsque vous travaillez avec du paraformaldéhyde, de l’acide chlorhydrique ou de l’hydroxyde de sodium.