Name: Isolement et coloration des kératinocytes de peau de souris pour lanalyse spécifique de cycle cellulaire de lexpression cellulaire de protéine par cytométrie de masse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: Découvrez l'isolement et la coloration des kératinocytes de peau de souris pour analyser l'expression protéique par cytométrie de masse. Cette méthode permet de profiler plus de 40 marqueurs dans les différentes phases du cycle cellulaire.

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Le département de dermatologie, le Gates Center for Regenerative Medicine de l'Université du Colorado et l'Université du Colorado (UC) Skin Disease Center Morphology and Phenotyping Cores (NIAMS P30 AR057212) ont apporté leur soutien à ce travail. Les auteurs reconnaissent l'UC Cancer Center Flow Cytometry Shared Resource and support grant (NCI P30 CA046934) pour le fonctionnement du cytomètre de masse et sont reconnaissants pour Karen Helm et Christine Childs au cœur de leurs conseils d'experts sur le débit et la masse cytométrique techniques.

Le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux du campus médical anschutz de l'Université du Colorado a approuvé les expériences sur les animaux décrites dans ce protocole.
1. Préparations
<ol><li>Concevoir un panneau d'anticorps marqué en métal. Utilisez le logiciel de conception de panneaux en ligne gratuit12 et inclure 127IododeoxyUridine (IdU), 164Dy (Dysprosium) étiqueté anti-CCNB1 (CYCLIN B1), 175Lu (Lutetium) phospho (p)-HISTONEH3Ser28 (pHH3), et 150 Nd (Neodymium)-pRETINOBLASTOMA protéineSer807/811 (pRB)13. Ajoutez d'autres anticorps marqués par le métal qui ne se chevauchent pas dans leur signal de canal14.</li>
	<li>Préparer une solution d'actions IdU. Dissoudre la poudre d'IdU à 10 mg/mL en 0,1 N NaOH à 60 oC. Aliquot IdU stock de solution dans les tubes de microcentrifuge et de congeler à -20 oC pour le stockage à long terme.<ol>
<li>Ajuster le pH de la solution IdU à 7,5 avec 12 N HCl immédiatement avant utilisation. Testez avec une bande de pH sur un aliquot de rejet pour s'assurer que la solution est au pH 7.5. REMARQUE : Le temps prolongé (à partir de 5 min) d'IdU au pH 7,5 entraînera des précipitations et un aliquot frais d'IdU est nécessaire lorsque cela se produit.</li>
		<li>Utilisez l'équipement de protection individuelle approprié (p. ex. gants, blouse de laboratoire et lunettes de sécurité) et travaillez dans une armoire de sécurité lorsque vous manipulez des solutions NaOH ou HCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer une solution de fixation au paraformaldéhyde 2x (PFA). Combinez 5 mL de 10x PBS (pH 7,5) et 1 ml de 16% de PFA avec 44 ml de dH2O de qualité moléculaire pure (3,2% de concentration finale). REMARQUE : Un stock de PFA peut être préparé comme précédemment publié15 ou acheter 16% des stocks exempts de métaux contaminants.<ol>
<li>Utilisez l'équipement de protection individuelle approprié et travaillez dans une armoire de sécurité lors de la manipulation de la poudre et des solutions PFA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer le baryum (Ba2)gratuit 1x PBS en combinant 5 ml de 10x PBS sans métal (pH 7,5) avec 45 ml de dH2O de qualité moléculaire pure. REMARQUE : La qualité du PBS et d'autres réactifs est très importante pour éviter de contaminer les métaux qui peuvent introduire le bruit de fond pendant l'analyse des données cytométriques de masse.</li>
	<li>Préparer une solution de bouillon de cisplatine de 100 mM. Dissoudre 300,5 mg de poudre de cisplatine dans 10 ml de DMSO. Conserver dans les aliquots à -80 oC. Préparer une solution de travail de 10 mM de cisplatine pour les expériences à utiliser sur 1 d.</li>
	<li>Préparer des solutions de séparation épiderme/derme. Préparer une solution de stock 20x dispase en dissolvant 30 mg dans 1 ml de HBSS ou PBS. Filtrer la stérilisation à l'intérieur d'un filtre de 0,22 m et entreposer les aliquots à -20 oC. Préparer une solution de stock de collagène de type IV de 1x à 1 mg/mL dans le HBSS, filtrer la stérilisation à l'aide d'un filtre de 0,22 m et stocker les aliquots à -20 oC.</li>
</ol>2. Étiquetage de la phase S par incorporation De l'UI par l'Incorporation
<ol><li>Pesez des souris. Utilisez des chiots néonatals P1-P3 ou des souris adultes de 8 à 10 semaines et utilisez des souris mâles ou femelles provenant d'un C57BL/6, d'un FvB ou de 129 milieux. Déterminer une dose de 0,1 mg d'IdU (pH 7,5)/g de poids corporel. Par exemple, une souris de 25 g nécessite 0,25 ml d'IdU.</li>
	<li>Administrer la dose d'IdU par injection intrapéritonéale et attendre 2 h avant de récolter les cellules. Utilisez une seringue de tuberculeuse pour injecter des chiots néonatals. REMARQUE : Une dose de 2 mg/mL d'IdU peut être utilisée avec des cellules de culture tissulaire avec une incubation de 1 h à 37 oC avant la récolte et l'étiquetage pour la cytométrie de masse.</li>
</ol>3. Isolement des cellules pour l'étiquetage
<ol><li>Décongeler les solutions de dépase et de collagène. Diluer la solution de stock de dériver 20x à 1x (1,5 mg/mL) dans le HBSS ou le PBS stérile. Conserver sur la glace jusqu'au moment de l'utilisation.</li>
	<li>Combinez 2 volumes de dispase avec 1 volume de collagène dans un volume total qui permet à la peau de flotter librement. Par exemple, la digestion de 5 peaux de souris néonatales peut être flottée sur 8 ml de 1x dispase avec 4 ml de collagène dans un plat Petri de 100 mm.</li>
	<li>Suivez des méthodes approuvées pour euthanasier les souris expérimentales (p. ex., surdosage d'isoflurane/pincement des orteils ou inhalation de CO 2/dislocation cervicale). Nettoyez la peau de l'oreille adulte avec une solution d'iode (voir Tableau des matériaux)et rincez à l'eau stérile lorsque des cellules isolées doivent être utilisées pour la culture tissulaire.</li>
	<li>Enlever chirurgicalement l'oreille à la base (Figure 1A). Rincer les oreilles dans le PBS stérile lorsque des cellules isolées doivent être utilisées pour la culture tissulaire. Déposer sur un plat Petri sec de 100 mm.</li>
	<li>Séparez soigneusement la peau postérieure de la peau postérieure en créant d'abord une poche au milieu ou au bord de la zone coupée à l'aide de forceps fins et en tirant les deux rabats de peau séparés (figure 1B-D). Procédez avec les peaux antérieures et postérieures. REMARQUE : Des instructions détaillées pour disséquer la peau néonatale de souris sont fournies par Litchi et coll.16 En outre, l'utilisation d'une portée de dissection peut aider à la séparation de la peau postérieure de la peau postérieure et à l'identification des côtés épidermiques/dermiques des peau: les cheveux sont visibles sur le côté épiderme tandis que le derme aura un aspect gélatineux.</li>
	<li>Placez soigneusement les peaux antérieures et postérieures de l'oreille avec le côté derme de la peau touchant la solution dispase/collagenase ( Figure 1E). Utilisez 1 mL pour la peau antérieure et postérieure d'une seule oreille par puits d'une plaque de 12 biens de culture. Incuber à 37 oC pendant 1 h. Alternativement, les peaux flottantes sur la solution de dispase 1x à 4 oC pour 16-18 h.3 REMARQUE : Travaillez dans une hotte de culture de tissu avec la technique stérile quand les cellules doivent être cultivées.</li>
	<li>Placez la peau digérée avec le côté épiderme touchant la surface d'un plat Petri propre. Aplatir la peau et faire glisser doucement le derme de l'épiderme en travaillant du centre aux bords dans un motif circulaire.</li>
	<li>Jetez le derme ou digérez-le plus loin pour libérer les fibroblastes pour la culture ou l'analyse des tissus16. REMARQUE: Le derme sera plus foncé en apparence et ont une composition gélatineuse et collante. Le derme devrait facilement se détacher. L'échec ou la difficulté en enlevant le derme suggère la digestion insuffisante de tissu. Cependant, l'incubation prolongée dans le tampon de digestion réduira la viabilité cellulaire. L'épiderme restera sur le plat Petri et aura un aspect blanchi.</li>
	<li>Soulevez délicatement l'épiderme en saisissant les bords et épluchez-le de la surface du plat Petri. Placez soigneusement l'épiderme sur la solution de détachement cellulaire préchauffée (voir Tableau des matériaux) pendant 5 min à 37 oC ou 20 min à RT. Utilisez 500 l de solution de détachement cellulaire pour 2 épidermises d'oreilles adultes par puits d'une plaque de culture de 12 puits et utilisez 750 l de détachement cellulaire solution pour un épiderme néonatal unique par puits d'une plaque de culture de 6 puits.</li>
	<li>Saisir l'épiderme à l'aide de forceps stériles et frotter en faisant glisser l'épiderme contre le fond du plat pour dissocier les cellules. Ajouter 1 ml de DMEM contenant 1 % de FBS (0,01 ml) et passer à travers un tamis cellulaire de 40 m dans un tube de collecte. Bien rincer avec 2 ml de DMEM supplémentaires et ajouter à la suspension cellulaire.</li>
	<li>Centrifugeuse à 120 x g pendant 5 min. Aspirez soigneusement le supernatant.</li>
	<li>Resuspendre le granule de cellules dans 1-2 ml de DMEM contenant 1% FBS. Déterminez le nombre de cellules et de % de cellules vivantes à l'aide de Trypan Blue et d'un hémocytomètre ou d'un dispositif de comptage automatisé. Cellules de pellet comme décrit dans l'étape 3.11. REMARQUE : Les cellules peuvent être cultivées dans les médias appropriés de culture tissulaire après l'étape 3.12. 17 Annonces</li>
</ol>4. Étiquetage de Cisplatin pour déterminer les cellules vivantes/mortes
<ol><li>Resuspendre 1-3 x 106 cellules par 1 ml de DMEM contenant 25 M de cisplatine (2,5 l de stock/mL). Incuber 1 min et éteindre par pipetting avec un volume égal de FBS (p. ex., 1 ml).</li>
	<li>Centrifugeuse à 120 x g pendant 5 min. Décant supernatant dans un bécher contenant de l'eau de Javel diluée et des tubes d'inversion pour égoutter la solution restante sur un essuie-tout. Appuyez doucement pour libérer la solution restante sur le granule et la paroi latérale du tube.</li>
	<li>Resuspendre le granule de cellules dans 2 ml de Ba2-gratuit PBS. Cellules de pellet comme décrit dans l'étape 4.2. REMARQUE : Il est recommandé de fixer les cellules si elles ne peuvent pas être tachées immédiatement.</li>
</ol>5. Fixation des cellules étiquetées cisplatine (facultatif)
<ol><li>Resuspendre 1-3 x 106 cellules étiquetées cisplatine dans 1 ml de Ba2-free PBS. Cellules de Vortex sous faible puissance continue et ajoutez dropwise 1 mL (1 volume) du tampon de fixation 2x PFA. Incuber à RT pendant 10 min sur une plate-forme à bascule.</li>
	<li>Cellules de pellet comme décrit dans l'étape 4.2, mais centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Laver les cellules avec 2 ml de Ba2-free PBS et les cellules granulées comme décrit à l'étape 5.2. Répétez l'étape 5.3 une fois.</li>
	<li>Resuspendre la pastille en 2 ml de Ba2-gratuit PBS. Conserver à 4 oC pour 3 j. Ajouter le FBS à 3 % (p. ex., 0,3 mL de FBS/mL de cellules) du volume total si vous stockez plus longtemps, puis mélanger et congeler à -80 oC. REMARQUE : La fixation peut affecter la détection de certaines épitopes. Les effets de la fixation sur le signal d'anticorps doivent être déterminés empiriquement.</li>
</ol>6. Barcodage d'échantillons (facultatif mais recommandé)
<ol><li>Cellules de pellet comme décrit dans l'étape 5.2 et puis resuspend 1-3 x 106 cellules dans 1 ml de tampon de fixation 1x (voir tableau des matériaux). Incuber à RT pendant 10 min. Cellules pelletées telles que décrites à l'étape 5.2.</li>
	<li>Laver les cellules avec 1 ml de tampon de perméabilisation du code à barres (voir Tableau des matériaux). Cellules de pellet comme décrit dans l'étape 5.2. Répétez l'étape 6.2 une fois.</li>
	<li>Ajouter 100 l de tampon de perméabilisation de code à barres aux codes-barres (voir Tableau des matériaux)18 et mélanger immédiatement pendant que les cellules de l'étape 6.2 sont granulées.</li>
	<li>Resuspendre le granule de cellule dans 800 'L de tampon de perméabilisation de code à barres. Ajouter la solution de code à barres aux cellules, mélanger et incuber à RT pendant 30 min. Cellules pelletées telles que décrites à l'étape 5.2. Laver les cellules dans 2 ml de tampon de coloration cellulaire (voir Tableau des matériaux) et pelletàez à nouveau. REMARQUE: Jusqu'à 20 échantillons peuvent être étiquetés avec diverses combinaisons de métaux Palladium18. D'autres stratégies de codage à barres sont décrites ailleurs15.</li>
</ol>7. Étiquetage des cellules pour la cytométrie de masse
<ol><li>Resuspendre 1-3 x 106 cellules dans 1 ml de solution de travail tampon de coloration de l'antigène nucléaire (voir Tableau des matériaux). Combinez les échantillons dans un seul tube pour les étapes suivantes lors de l'utilisation d'échantillons codés à barres. Incuber à RT pendant 30 min. Pellet tel que décrit à l'étape 5.2.</li>
	<li>Resuspendre 1-3 x 106 cellules dans 2 ml de tampon de perméabilisation de la coloration de l'antigène nucléaire (voir Tableau des matériaux). Échelle au besoin. Par exemple, utilisez 6 ml de tampon pour 10 échantillons combinés avec un nombre cellulaire de 9 x 106 cellules. Pellet tel que décrit à l'étape 5.2.</li>
	<li>Répétez l'étape 7.2. Vortex doucement la pastille cellulaire dans le volume résiduel laissé dans le tube.</li>
	<li>Ajouter 50 l de cocktail d'anticorps intracellulaires par 1-3 x 106 cellules. Échelle au besoin. Par exemple, utilisez 150 l de cocktail d'anticorps pour 10 échantillons combinés avec un nombre cellulaire de 9 x 106 cellules. Mélanger et incuber à RT pendant 45 min. Ajouter 2 ml de tampon de coloration cellulaire et de granule tel que décrit à l'étape 5.2.</li>
	<li>Resuspendre 1-3 x 106 cellules granulés dans 2 ml de tampon cellule de coloration. Cellules de pellet comme décrit dans l'étape 5.2. Répétez l'étape 7.5 une fois. REMARQUE : D'autres solutions tampons peuvent être utilisées pour tacher la membrane extracellulaire ou les marqueurs cytoplasmiques et l'expérimentateur peut avoir à optimiser la coloration s'il est nécessaire de détecter les épitopes dans différents endroits cellulaires. Les cellules peuvent également être fixées en PFA après l'étape 7.5 lors de l'utilisation de cellules vivantes pour la coloration.</li>
	<li>Resuspendre 1-3 x 106 cellules dans 1 ml de solution d'intercalation et conserver 1-3 d à 4 oC.<ol>
<li>Entreposez les cellules à -80 oC dans le DMSO contenant la solution pour les cellules de granule d. telles que décrites à l'étape 5.2 si les cellules sont dans la solution d'intercalation. Resuspendre les granulés (1-3 x 106 cellules) dans 1 ml de tampon de coloration cellulaire et de cellules granulées telles que décrites à l'étape 5.2. Resuspendre le granule dans 1 ml de 10 % DMSO/90 % FBS19, le transférer dans un cryovial, le placer dans un contenant de congélation à l'isopropanol et le conserver à -80 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cellules de pellet comme décrit dans l'étape 5.2. Laver 1-3 x 106 cellules avec 2 ml de tampon de coloration cellulaire, granulement tel que décrit à l'étape 5.2. Effectuer deux lavages supplémentaires avec 2 ml d'eau, granulecomme comme décrit à l'étape 5.2.</li>
	<li>Diluer les perles d'étalonnage EQ 1:9 dans l'eau (solution de stock à 3,3 x 105 perles/mL).</li>
	<li>Resuspendre la pastille cellulaire à une concentration de 1 x 106 cellules/mL avec une solution diluée de perles d'Égalisation. Filtrer les cellules à travers des tubes d'écoulement de bouchon de passoire de 35 m.</li>
	<li>Exécuter des échantillons sur le cytomètre de masse et acquérir des données. Les données seront déposées dans un format de fichier Flow Cytometry Standard (FCS).</li>
</ol>8. Traitement et analyse des fichiers de données de cytométrie de masse
<ol><li>Normaliser les fichiers FCS. Utiliser un programme gratuit disponible au20 https://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest
</li>
	<li>Fichiers FCS décongestionné à barres. Séparez la population de codes à barres mis en commun en fichiers codés à barres distincts avec un programme gratuit disponible au18 https://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latest
</li>
	<li>Analyser les fichiers FCS normalisés. Utilisez des programmes commerciaux21,22 ou freeware (voir web.stanford.edu/group/nolan/resources.html).</li>
</ol>

<ol><li>Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+proliferation+markers%3A+PCNA%2C+Ki-67%2C+MCM-2+and+antiapoptotic+protein+Bcl-2+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer.</a> Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).</li>
<li>Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67+expression+is+superior+to+mitotic+count+and+novel+proliferation+markers+PHH3%2C+MCM4+and+mitosin+as+a+prognostic+factor+in+thick+cutaneous+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22BioMedCentral+Cancer%22%5BJournal%5D)">Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma.</a> BioMedCentral Cancer. 10, 140(2010).</li>
<li>Ryan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+S6+signaling+is+associated+with+cell+survival+and+multinucleation+in+hyperplastic+skin+after+epidermal+loss+of+AURORA-A+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase.</a> Cell Death & Differentiation. , (2018).</li>
<li>Magaud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+immunocytochemical+labeling+of+cell+and+tissue+samples+with+monoclonal+anti-bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).</li>
<li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).</li>
<li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li>
<li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunohistochemistry%2C+imaging%2C+and+quantitation%3A+a+review%2C+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification%2C+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li>
<li>Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+constancy+in+heteroploidy+and+the+stem+line+theory+of+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors.</a> Science. 174 (4010), 714-717 (1971).</li>
<li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).</li>
<li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).</li>
<li>Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+for+analysis+of+immune+system+functional+states%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).</li>
<li>http://www.dvssciences.com. , 
 <a target="_blank" href="http://www.dvssciences.com">http://www.dvssciences.com</a> (2019).</li>
<li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li>
<li>Brodie, T. M., Tosevski, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Dimensional+Single-Cell+Analysis+with+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).</li>
<li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experimentation%22%5BJournal%5D)">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).</li>
<li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes%2C+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).</li>
<li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defects+in+Stratum+Corneum+Desquamation+Are+the+Predominant+Effect+of+Impaired+ABCA12+Function+in+a+Novel+Mouse+Model+of+Harlequin+Ichthyosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis.</a> PLoS One. 11 (8), e0161465(2016).</li>
<li>Zunder, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).</li>
<li>Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+mass+cytometry+sample+cryopreservation+after+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining.</a> Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).</li>
<li>Finck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li>
<li>http://www.cytobank.org. , 
 <a target="_blank" href="http://www.cytobank.org">http://www.cytobank.org</a> (2019).</li>
<li>http://www.flowjo.com. , 
 <a target="_blank" href="http://www.flowjo.com">http://www.flowjo.com</a> (2019).</li>
<li>Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD45%3A+an+emerging+role+as+a+protein+tyrosine+phosphatase+required+for+lymphocyte+activation+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development.</a> Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).</li>
<li>Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EWS%2FFLI-1+induces+rapid+onset+of+myeloid%2Ferythroid+leukemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).</li>
<li>Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified+and+Efficient+Method+to+Isolate+Primary+Human+Keratinocytes+from+Adult+Skin+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experimentation%22%5BJournal%5D)">A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue.</a> Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).</li>
<li>Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+proliferation+and+differentiation+capacity+of+stem+cells+using+disaggregated+adult+mouse+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis.</a> Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).</li>
<li>Germain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+human+keratinocyte+isolation+and+culture+using+thermolysin%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin.</a> Burns. 19 (2), 99-104 (1993).</li>
<li>Fluhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+anatomical+location+on+barrier+recovery%2C+surface+pH+and+stratum+corneum+hydration+after+acute+barrier+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption.</a> British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).</li>
<li>Webb, A., Li, A., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+and+phenotype+of+human+adult+keratinocyte+stem+cells+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin.</a> Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).</li>
<li>Torchia, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+variant+of+Aurora+kinase+A+promotes+genomic+instability+leading+to+highly+malignant+skin+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors.</a> Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).</li>
<li>Frei, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Le protocole décrit dans ce document peut être complété en environ 8 h. Le résultat final est une suspension des cellules enrichies en KCs qui peuvent être analysés pour l'expression des protéines d'une manière cellulaire dépendante du cycle. Plusieurs études antérieures ont décrit des méthodes pour isoler les KCde la peau humaine et de la souris16,25. Ces études comprennent également des protocoles pour l'isolement des KC spour la cytométrie du débit<sup class="...

La corrélation de l'expression génique avec les stades du cycle cellulaire demeure un défi dans l'analyse des modèles animaux de maladies hyperplastiques comme le cancer. Une partie de ce défi est la co-détection des protéines d'intérêt (POI) avec des marqueurs de prolifération. Les cellules proliférantes peuvent être trouvées dans diverses phases de cycle cellulaire comprenant G1, S, G2, et M. Ki67 est l'un des marqueurs les plus couramment utilisés de la prolifération et est exprimée dans toutes les phases du cycle cellulaire. Il a été largement utilisé dans l'analyse des tissus humains et de souris1,2,3. Cependant, comme d'autres marqueurs de prolifération générale, Ki67 ne discerne pas les phases individuelles du cycle cellulaire. Une approche plus précise utilise l'incorporation d'analogues de nucléotide de thymidine comme la bromodeoxyuridine (BrdU) dans des cellules qui reproduisent activement leur génome (c.-à-d. la phase S)4,5. Un inconvénient à l'utilisation des analogues nucléotides est la nécessité de les administrer aux animaux vivants heures avant l'analyse. Ki67 et BrdU sont généralement détectés sur les sections de tissus fixes par l'utilisation d'anticorps. L'un des avantages de cette approche est que l'emplacement des points d'accès peut être déterminé dans l'architecture tissulaire (p. ex., la couche basale de l'épiderme cutané). Cette approche ne nécessite pas non plus de dissociation tissulaire qui peut conduire à des changements dans l'expression des gènes. L'un des inconvénients est que la fixation des tissus ou le traitement du tissu pour la section congelée ou paraffine de l'OCT peut obstruer les cibles des anticorps (c.-à-d. les antigènes). La récupération des antigènes nécessite généralement une digestion thermique ou tissulaire. La quantification des intensités de coloration peut également être difficile. Cela est dû aux variations de la coloration, de l'épaisseur de la section, de la détection du signal et du biais de l'expérimentateur. En outre, un nombre limité de marqueurs peut être détecté simultanément dans la plupart des configurations de laboratoire typiques. Pourtant, de nouvelles approches de coloration multiplex promettent de surmonter ces limites; exemples sont la cytométrie de masse d'imagerie et l'amplification du signal Tyramide6,7.
La cytométrie des flux est une autre technologie puissante pour détecter les cellules proliférantes. Il permet la détection multiplexe des marqueurs dans les mêmes cellules, mais nécessite une dissociation tissulaire pour la plupart des types de cellules non hématopoïétiques. L'analyse des cellules proliférantes est régulièrement effectuée par l'utilisation de colorants qui lient l'ADN (p. ex., Propidium Iodide (PI))8. La cytométrie de flux permet également une détermination plus précise des phases du cycle cellulaire lorsqu'elle est associée à la détection de l'incorporation BrdU9. Bien qu'il s'adresse avec force, la cytométrie du flux BrdU/PI a ses inconvénients. Il n'est pas en mesure de résoudre les phases G2/M et G0/G1 sans l'inclusion d'anticorps spécifiques à la phase. Cependant, le nombre d'anticorps qui peuvent être utilisés est limité par l'autofluorescence cellulaire, les retombées spectrales des émissions de fluorophore et l'utilisation de contrôles de compensation. Cette limitation indique qu'il est plus difficile et laborieux de co-détecter l'expression des marqueurs de cycle cellulaire avec des POI. Une approche plus facile est d'utiliser la cytométrie de masse10,11. Cette technologie utilise des anticorps conjugués métalliques qui ont un spectre de détection plus étroit. Une fois que les cellules sont tachées d'anticorps marqués par le métal, elles sont vaporisées et les métaux détectés par la spectrométrie de masse cytométrie (CyTOF). En raison de ces propriétés, la cytométrie de masse permet la détection multiplexe de marqueurs différents à l'aide de plates-formes existantes10,11. En outre, il est possible de coder à barres des échantillons avec des métaux qui se traduisent par des économies d'anticorps précieux tout en réduisant la variabilité des taches d'échantillon en échantillon. D'autre part, la cytométrie de masse a plusieurs inconvénients. Il existe un nombre limité d'anticorps étiquetés métalliques disponibles dans le commerce pour les cellules non dérivées du sang. La quantification de la teneur en ADN est moins sensible par rapport à l'utilisation de colorants fluorescents de l'ADN et la cytométrie de masse a une plage dynamique réduite de détection de signal par rapport à la cytométrie de flux de fluorescence.
Le protocole décrit ici a été conçu pour analyser la dynamique du cycle cellulaire des kérainocytes nouvellement isolés (KCs) de la peau de souris et caractériser l'expression protéique spécifique au cycle cellulaire dans ces cellules en utilisant la cytométrie de masse. Ce protocole peut également être utilisé avec des cellules cultivées ou adapté à d'autres types de cellules.

<table><tbody><tr><td>Plaque à 12 puits</td><td>Cell Treat</td><td>229512</td><td></td></tr><tr><td>solution intercalateur</td><td>Fluidigm</td><td>201192A</td><td>125 &micro ; M - Ir solution intercalateur</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>30525-89-4</td><td>16 %&nbsp ; PFA</td></tr><tr><td>Tubes d’écoulement</td><td>Fisher/Corning</td><td>352235</td><td>35 &micro ; m taille des pores&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tamis cellulaire</td><td>Fisher</td><td>22363547</td><td>40 &mu ; m taille des pores&nbsp ;</td></tr><tr><td>Solution de décollement cellulaire</td><td>CELLnTEC</td><td>CnT-ACCUTASE-100</td><td>Accutase</td></tr><tr><td>Solution d’iode</td><td>ThermoFisher/Purdue</td><td>67618-151-17</td><td>Bétadine 7,5 % d’iode gommage chirurgical</td></tr><tr><td>Tampon de perméabilisation de code-barres&nbsp ;</td><td>Fluidigm</td><td>201060</td><td>Cell-ID 20-Plex Barcoding Kit</td></tr><tr><td>Barcodes</td><td>Fluidigm</td><td>201060</td><td>Cell-ID 20-Plex Barcoding Kit</td></tr><tr><td>Bandelettes de pH</td><td>EMD</td><td>9590</td><td>colorpHast</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td>Dulbecco' s Modified Eagle Media</td></tr><tr><td>Pinces fines</td><td>Dumont & Fils</td><td>0109-5-PO</td><td>Dumostar #5</td></tr><tr><td>Pince de précision courbe</td><td>Dumont & Fils</td><td>0109-7-PO</td><td>Dumostar #7</td></tr><tr><td>Perles d’étalonnage</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td>EQ Perles d’étalonnage à quatre éléments</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td>Hank’s Balanced Salt Solution</td></tr><tr><td></td><td>Water Fisher</td><td>SH30538.03</td><td>Hyclone Molecular Biology eau de qualité</td></tr><tr><td>Iododésoxyuridine</td><td>&nbsp ; Sigma</td><td>I7125</td><td>IdU</td></tr><tr><td>Cryo flacons</td><td>ThermoFisher</td><td>366656PK</td><td>filetage interne</td></tr><tr><td>Tampon de coloration cellulaire</td><td>Fluidigm</td><td>201068</td><td>Maxpar Tampon de coloration</td></tr><tr><td>cellulaire Fix & Tampon de perme</td><td>Fluidigm</td><td>201067</td><td>Maxpar Fix & Tampon permanent</td></tr><tr><td>Tampon Fix I</td><td>Fluidigm</td><td>201065</td><td>Maxpar Fix I</td></tr><tr><td>Tampon salin tamponné au phosphate</td><td>Rockland</td><td>MB-008</td><td>Sans métal 10x récipient de</td></tr><tr><td>congélation à l’isopropanol</td> PBS <td>ThermoFisher</td><td>5100-0001</td><td>Mr.Frosty</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Fisher</td><td>BP359-500 Boîte de</td> Pétri <td>NaOH</td></tr><tr><td></td><td>Kord-Valmark</td><td>2900</td><td>Fourni par Genesee 32-107&nbsp ;</td></tr><tr><td>15 mL conique</td><td>Olympus/Genesee</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conique</td><td>Olympus/Genesee</td><td>28-106</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 6 puits</td><td>Cell Treat</td><td>229506</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatine</td><td>Sigma</td><td>479306</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma/Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Fisher</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de coloration de l’antigène nucléaire Tampon de coloration de l’antigène</td><td>nucléaire Fluidigm</td><td>201063</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de coloration de l’antigène</td><td>nucléaire Fluidigm</td><td>201063</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Seringue à tuberculine</td><td>BD</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type IV&nbsp ;</td><td>Worthington Bioscience</td><td>CLSS-4</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement et coloration des kératinocytes de peau de souris pour l'analyse spécifique de cycle cellulaire de l'expression cellulaire de protéine par cytométrie de masse

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

L'objectif de ce protocole est de détecter et de quantifier les changements d'expression des protéines d'une manière dépendante du cycle cellulaire à l'aide de cellules individuelles isolées de l'épiderme de la peau de souris. Il y a sept étapes importantes : séparation de l'épiderme du derme, digestion de l'épiderme, coloration des populations épidermiques avec cisplatine, codage à barres d'échantillon, coloration avec des anticorps métalliques marqués pour les marqueurs de cycle cellulaire et les protéines de l'intérêt, la détection d'anticorps marqués par le métal par cytométrie de masse, et l'analyse de l'expression dans les différentes phases du cycle cellulaire. L'avantage de cette approche par rapport aux méthodes histologiques est le potentiel d'analyse du modèle d'expression de marqueurs différents dans une seule cellule à différentes phases du cycle cellulaire. Cette approche permet également l'analyse multivariée de corrélation de l'expression de protéine qui est plus quantifiable que les méthodes histologiques/imaging. L'inconvénient de ce protocole est qu'une suspension des cellules simples est nécessaire, ce qui entraîne la perte de l'information de localisation fournie par la coloration des sections de tissu. Cette approche peut également nécessiter l'inclusion de marqueurs supplémentaires pour identifier différents types de cellules dans les suspensions de cellules brutes. L'application de ce protocole est évidente dans l'analyse des modèles hyperplastiques de maladie de peau. En outre, ce protocole peut être adapté pour l'analyse de sous-types spécifiques de cellules (par exemple, les cellules souches) par l'ajout d'anticorps spécifiques à la lignée. Ce protocole peut également être adapté pour l'analyse des cellules de la peau chez d'autres espèces expérimentales.

Le tableau 1 montre les rendements cellulaires et la viabilité attendus de l'oreille de souris adulte (figure 1) et de la peau néonatale dans des conditions non pathologiques. Le tableau montre également des données représentatives d'animaux provenant d'un fond mixte C57/126. On s'attend à ce que la peau d'autres souches entraîne des rendements cellulaires et des viabilities similaires. Le rendement approximatif dépend de la surface de la pea...

Ce protocole décrit comment isoler les kératinocytes cutanés des modèles de souris, les tacles avec des anticorps marqués en métal, et analyser les cellules tachées par cytométrie de masse afin de profiler le modèle d'expression des protéines d'intérêt dans les différentes phases du cycle cellulaire.

Isolement et coloration des kératinocytes de peau de souris pour l'analyse spécifique de cycle cellulaire de l'expression cellulaire de protéine par cytométrie de masse

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Ce protocole est significatif pour deux raisons principales. Numéro un, il permet à un utilisateur d’être en mesure de déterminer les états du cycle cellulaire des cellules de la peau qui ont été isolés d’un modèle animal. Il nous permet également d’être en mesure d’analyser l’expression des protéines dans les phases discrètes du cycle cellulaire.Par rapport aux méthodes précédentes de détermination de la prolifération cellulaire, notre méthode permet une détermination plus précise des différentes phases du cycle cellulaire, et nous pouvons également analyser plus de 40 marqueurs différents dans les différentes étapes de la division cellulaire. Cela améliore considérablement l’application et la polyvalence de la méthode. Ce protocole peut être utilisé dans la recherche sur le cancer et dans tout autre type de maladie où il est nécessaire de déterminer les modèles spécifiques d’expression des protéines du cycle cellulaire.En outre, ce protocole peut être modifié à d’autres types de cellules, et dans d’autres organismes modèles. La première fois que l’utilisateur doit se concentrer sur l’obtention de la meilleure qualité de préparation cellulaire possible. Cela nécessite le traitement opportun de la peau expérimentale à l’aide de réhésifs frais, un minimum de temps de digestion des tissus, et l’élimination minutieuse du supernatant après centrifugation pour préserver l’intégrité et la quantité des cellules.Pour commencer, concevez un panneau d’anticorps marqué en métal à l’aide d’un logiciel gratuit de conception de panneaux en ligne, tel que décrit dans le manuscrit. Préparez ensuite une solution de stock IdU en dissolvant la poudre IdU à 10 milligrammes par millilitre dans 0,1 hydroxyde de sodium normal à 60 degrés Celsius. Après avoir aliquoting solution de stock IdU dans des tubes de microcentrifugeuse, congelez-les à moins 20 degrés Celsius pour le stockage à long terme.Immédiatement avant l’utilisation, réglez le pH de la solution IdU à 7,5 avec 12 acide chlorhydrique normal, et testez avec une bande de pH sur un aliquot de rejet pour s’assurer que la solution est au pH 7.5. Pour préparer une solution de fixation de deux x paraformaldéhyde, combinez cinq millilitres de 10 x PBS et un millilitre de 16%PFA avec 44 millilitres d’eau distillée pure de qualité moléculaire. Pour préparer la solution de stock de cisplatine de 100 millimlaires, dissoudre 300,5 milligrammes de poudre de cisplatine en 10 millilitres de DMSO.Pour que les expériences soient utilisées sur une journée, préparez une solution de travail au cisplatine de 10 millimlaires. Pesez les souris, puis déterminez une dose à 0,1 milligramme d’IdU par gramme de poids corporel. Administrer la dose calculée d’UDI par injection intrapénitale et attendre deux heures avant de récolter les cellules.Utilisez une paire de ciseaux de qualité chirurgicale pour enlever chirurgicalement l’oreille de la souris euthanasiée précédemment injectée avec idu à la base de l’oreille. Déposer l’oreille sur une boîte de Pétri sèche de 100 millimètres. Séparez soigneusement l’antérieur de la peau postérieure en utilisant des forceps fins pour créer une poche au milieu ou au bord de la zone coupée, puis tirez les deux volets de la peau à part, et procéder à la fois avec les peaux antérieures et postérieures.Placez soigneusement les peaux antérieures et postérieures d’une oreille dans un puits d’une plaque de culture de 12 puits, remplie d’un millilitre de solution de dispase/collagène fraîchement préparée, le côté derma de la peau touchant la solution. Incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure pour digérer la peau. Placer l’oreille digérée ou la peau néonatale dans une boîte de Pétri propre, le côté épiderme touchant la surface du plat.À l’aide de forceps, aplatir la peau et glisser doucement le derme de l’épiderme en travaillant du centre vers les bords dans un motif circulaire. Avec des forceps, saisir l’épiderme sur les bords et le soulever doucement en l’épluchant de la surface de la boîte de Pétri. Placez soigneusement l’épiderme sur la solution de détachement cellulaire préchauffé dans un puits d’une plaque.Incuber pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius ou 20 minutes à température ambiante. Utilisez des forceps stériles pour saisir l’épiderme et frotter en faisant glisser l’épiderme contre le fond du plat pour dissocier les cellules. Ajouter un millilitre de DMEM contenant 1% de FBS, et passer à travers un tamis cellulaire de 40 micromètres dans un tube de collecte.Rincer bien avec deux millilitres supplémentaires de DMEM et ajouter à la suspension cellulaire. Après avoir centrifugé à 120 fois g pendant cinq minutes, aspirez soigneusement le surnatant. Resuspendez la pastille cellulaire en un à deux millilitres de DMEM contenant 1%FBS, et pelletez les cellules à nouveau comme précédemment.Pour étiqueter les cellules pour déterminer les cellules vivantes et mortes, résusquer un à trois millions de cellules en un millilitre de DMEM contenant 25 micromolaires de cisplatine et incuber pendant une minute. Étanchez par pipetting avec un volume égal de FBS. Après avoir centrifugé à 120 fois g pendant cinq minutes, décanter le supernatant dans un bécher contenant de l’eau de Javel diluée, et inverser les tubes pour égoutter la solution restante sur une serviette en papier.Resuspendez la pastille cellulaire en deux millilitres de PBS sans cation de baryum, et centrifugez-les à nouveau comme décrit précédemment. Pour fixer les cellules, résuspendez la pastille cellulaire dans un millilitre de PBS sans cation de baryum. Vortex les cellules sous basse puissance continue et ajouter un millilitre des deux x PFA fixation tampon drop-wise.Placer sur une plate-forme à bascule et incuber à température ambiante pendant 10 minutes. Après avoir centrifugé à 500 fois g pendant cinq minutes, décanter soigneusement le surnatant. Lavez les cellules avec deux millilitres de PBS sans cation de baryum, centrifugez à nouveau dans les mêmes conditions, et répétez l’étape de lavage.Enfin, resuspendez la pastille en deux millilitres de PBS sans cation de baryum. Centrifuger les cellules à 500 fois g pendant cinq minutes et décanter soigneusement le surnatant. Resuspendez les cellules en un millilitre d’un tampon de fixation x, et incubez à température ambiante pendant 10 minutes et répétez la centrifugation.Pour laver les cellules, ajouter un millilitre de tampon de perméabilisation du code à barres. Pendant la centrifugation cellulaire à 500 fois g pendant cinq minutes, préparer les codes à barres en y ajoutant 100 microlitres de tampon de perméabilisation du code à barres, et mélanger immédiatement. Resuspendez la pastille cellulaire dans 800 microlitres de tampon de perméabilisation du code à barres.Ajouter la solution de code à barres aux cellules, mélanger et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Centrifugeuse à 500 fois g pendant cinq minutes. Lavez les cellules en deux millilitres de tampon de coloration cellulaire et centrifugeuse à nouveau.Ensuite, resuspendez un à trois millions de cellules dans un millilitre de solution de travail tampon de coloration d’antigène nucléaire, et incubez à température ambiante pendant 30 minutes. Après avoir centrifugé à 500 fois g pendant cinq minutes, décanter soigneusement le surnatant. Resuspendez à nouveau les cellules dans un millilitre de tampon de perméabilisation et de centrifugeuse d’antigène nucléaire.Après la résuspension et la centrifugation répétées, résuspendez la pastille cellulaire dans le volume résiduel avec un léger vortex. Ajouter 50 microlitres de cocktail intracellulaire d’anticorps, mélanger et incuber à température ambiante pendant 45 minutes. Ajouter deux millilitres de tampon de coloration cellulaire.Centrifugeuse à nouveau dans les mêmes conditions que dans l’étape précédente, et enlever le surnatant. Resuspendez la pastille en deux millilitres de tampon de coloration cellulaire, centrifugeuse à 500 fois g pendant cinq minutes, et répétez la résuspendance et la centrifugation. Resuspendez les cellules en un millilitre de solution d’intercalation, et stockez pendant un à trois jours à quatre degrés Celsius.Après avoir centrifugé les cellules à nouveau, laver la pastille avec deux millilitres de tampon de coloration cellulaire, centrifugeuse dans les mêmes conditions, et effectuer deux lavages supplémentaires avec deux millilitres d’eau, avec la même centrifugation. Resuspendez la pastille cellulaire à une concentration d’un million de cellules par millilitre avec la solution diluée de perle d’EQ, puis exécutez les échantillons sur le cytomètre de masse. Les rendements cellulaires attendus et la viabilité de l’oreille adulte de la souris et de la peau néonatale sont déterminés.Le rendement approximatif dépend de la surface de la peau. La peau néonatale est un meilleur choix pour les expériences qui nécessitent un plus grand nombre de cellules. La stratégie de base de gating à sélectionner pour les cellules intactes, simples et viables, après normalisation et déconvolution des données de cytométrie de masse codées à barres, est montrée.Le pourcentage de cellules viables peut indiquer la qualité ou l’état des cellules avant la coloration. Des différences dans la viabilité entre les cellules de carcinome cultivés par rapport aux cellules isolées d’oreille de souris sont montrées, aussi. Des cellules viables ont été gated sur la longueur d’événement contre CD45 pour exclure des cellules hématopoïétiques.L’inclusion de marqueurs de lignée permet de sélection des populations cellulaires d’intérêt dans différentes phases du cycle cellulaire. Le profil de base du cycle cellulaire est obtenu par la détection du BrdU par rapport à l’IP dans la cytométrie du flux fluorescent. Cependant, l’inclusion d’autres marqueurs de prolifération avec cytométrie de masse, permet une identification plus précise des phases du cycle cellulaire.Suivant cette approche, des profils de cycle cellulaire peuvent être construits pour différents types de cellules ou conditions expérimentales, telles que les profils de cellules négatives cd45 par rapport aux cellules positives CD45 de la même expérience. Dans un autre exemple, l’analyse des marqueurs qui définissent les voies de signalisation EGFR et mTOR PI3K dans la phase G-one, a révélé des profils d’expression similaires dans les cellules négatives CD45, montrées dans les cellules positives orange et CD45, montrées en bleu. La cytométrie de masse nécessite beaucoup de cellules de haute qualité.Si un utilisateur s’intéresse à une population de cellules rares, un plus grand nombre de cellules peut être nécessaire. Les cellules vivantes isolées peuvent être utilisées pour l’analyse de l’ADN ou de l’ARN, des études biochimiques ou peuvent être utilisées dans la culture tissulaire avant la fixation et la coloration pour la cytométrie de masse. L’utilisateur doit utiliser un équipement de protection personnelle et une armoire de sécurité si nécessaire, lorsque vous travaillez avec du paraformaldéhyde, de l’acide chlorhydrique ou de l’hydroxyde de sodium.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Cancérogenèse est un processus impliquant des interactions entre les cellules cancéreuses et le micro de cancer. Pour disséquer les événements moléculaires, il faut isoler les différentes populations de cellules à différents stades au cours du développement du cancer. En utilisant un modèle de souris pour le carcinome basocellulaire, nous décrivons un protocole pour les analyses cellulaires au cours de la cancérogenèse.

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La peau abrite un réseau complexe de cellules immunitaires. Nous décrivons une méthodologie efficace pour la digestion de la peau de souris, à partir de différentes parties du corps de l’animal, afin d’obtenir une suspension unicellulaire et d’analyser les différentes populations de leucocytes résidant dans la peau par cytométrie en flux.

Préparation de Suspensions de cellules uniques pour l&#39;analyse cytofluorimétrie de différentes régions de la peau de souris

Ce protocole décrit la digestion enzymatique de la peau de souris dans un milieu riche en nutriments, suivie d’une séparation par gradient pour isoler les leucocytes.  Les cellules ainsi dérivées peuvent être utilisées pour diverses applications en aval. Il s’agit d’une alternative efficace, économique et améliorée aux machines de dissociation des tissus et aux protocoles de digestion tissulaire basés sur la trypsine et la dispase.

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Le follicule pileux de souris est un modèle idéal pour étudier la biologie des cellules souches adultes. Nous présentons ici un protocole permettant d’isoler différentes populations de follicules pileux, de cellules souches et de kératinocytes épidermiques, en utilisant la digestion enzymatique de la peau dorsale de souris suivie d’une analyse FACS.

Isoler follicule pileux cellules souches et kératinocytes épidermiques de la peau Dorsale Souris

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Ce rapport décrit un protocole CUBIC pour clarifier plein des biopsies de peau d'épaisseur de la souris, et de visualiser les profils d'expression de la protéine, les cellules proliférantes, et sébocytes à la résolution d'une seule cellule en 3D. Cette méthode permet une évaluation précise de l'anatomie de la peau et de la pathologie et de phénotypes épidermiques anormales dans des lignées de souris génétiquement modifiées.

Protocole CUBIC Visualise Protein Expression à cellule unique Résolution dans les préparations entières de la peau de montage

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Isolation et culture des kératinocytes de la souris primaire de la peau de souris néonatale et adulte

L'objectif de ce protocole est d'isoler les kératinocytes épidermiques de la peau dorsale de souris adultes pour une variété d'applications en aval telles que la biologie moléculaire, la biochimie, le tri cellulaire activé par fluorescence et les utilisations in vitro primaires (p. ex., clonogènes kératinocytes).

Isolement des kératinocytes épidermiques de souris et de leur culture clonogène in vitro

L’expansion clonale est une caractéristique clé de la réponse des lymphocytes T spécifiques à l’antigène. Cependant, le cycle cellulaire des lymphocytes T répondant à l’antigène a été mal étudié, en partie à cause de limitations techniques. Nous décrivons une méthode de cytométrie en flux pour analyser les lymphocytes T CD8 spécifiques de l’antigène à expansion clonale dans la rate et les ganglions lymphatiques de souris vaccinées.

Un test de cytométrie en flux basé sur l’ADN / Ki67 pour l’analyse du cycle cellulaire des lymphocytes T CD8 spécifiques de l’antigène chez des souris vaccinées

Un protocole efficace pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) est présenté ici des cellules satellites musculaires des membres de souris, adapté à l’étude de la régulation de la transcription dans les fibres musculaires par clivage sous cibles et libération par nucléase (CUT&amp;RUN).

Un protocole efficace pour l’analyse CUT&amp;RUN de cellules satellites de souris isolées par FACS

Nous décrivons des protocoles pour la préparation de la suspension unicellulaire de cellules épithéliales thymiques de souris et la coloration de molécules intracellulaires pour l’analyse cytométrique en flux.

Préparation de suspension unicellulaire de cellules épithéliales thymiques de souris et coloration de molécules intracellulaires pour l’analyse cytométrique en flux

Découvrez l'isolement et la coloration des kératinocytes de peau de souris pour analyser l'expression protéique par cytométrie de masse. Cette méthode permet de profiler plus de 40 marqueurs dans les différentes phases du cycle cellulaire.

Isolement et coloration des kératinocytes de peau de souris pour lanalyse spécifique de cycle cellulaire de lexpression cellulaire de protéine par cytométrie de masse (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement et coloration des kératinocytes de peau de souris pour l'analyse spécifique de cycle cellulaire de l'expression cellulaire de protéine par cytométrie de masse

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