Dans Vitro génération du Somite dérivés de Human induit Pluripotent Stem cellules

L’induction de dérivés de la somite à partir de cellules souches pluripotentes induites, ou iPSC, est une étape cruciale pour l’utilisation de cellules souches pluripotentes pour la thérapie régénérative ou des applications de recherche sur la maladie. Cette technique peut être utilisée pour différencier les cellules iPS humaines en dérivés de somite tels que le myotome, le dermame, le scléotome et les cellules syndéomes dans des conditions chimiquement définies. Utilisant l’iPSC établi à partir d’un patient souffrant d’un désordre musculo-squelettique insoluble, cette méthode peut être employée pour modéliser le phénotype de la maladie et pour tester les nouvelles thérapies de drogue.

Cette méthode peut également être appliquée à la poursuite de notre compréhension de la biologie et des mécanismes sous-jacents au développement du mésoderm paraxial pendant l’embryogenèse humaine. Quatre jours avant de commencer l’induction mésodermique, enrober un plat de 10 centimètres de quatre millilitres de solution matricielle extracellulaire pour une incubation nocturne à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, remplacez la solution matricielle extracellulaire par huit millilitres de milieu de culture cellulaire sans mangeoire.

Pour commencer la culture sans mangeoire, lavez la culture humaine d’iPSC avec PBS, et ajoutez un millilitre de solution de CTK au plat de culture. Lorsque les cellules commencent à se détacher du fond du plat, lavez la culture deux fois avec du PBS frais pour enlever complètement toutes les cellules d’alimentation SNL avant d’ajouter un millilitre de milieu de culture cellulaire sans mangeoire au plat. Utilisez un grattoir cellulaire pour détacher manuellement les cellules souches et transférer les cellules dans un tube conique de 15 millilitres.

Pipette doucement la solution cellulaire trois fois avec une pointe de pipette de 1000 microlitres, et transférer les cellules dans le plat de culture extracellulaire enduit de matrice. Ensuite, retournez les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pendant trois jours. À la fin de l’incubation, remplacer le milieu de culture cellulaire sans mangeoire par huit millilitres de milieu d’induction mésodermique présomitique, et initier la différenciation mésodermique dans l’incubateur de culture cellulaire pour les quatre prochains jours, en changeant le milieu le troisième jour.

À la fin de l’incubation, isoler la protéine delta-like 1 cellules positives par cytométrie de flux, et de recueillir les cellules triées par centrifugation. Resuspendez la pastille dans un millilitre de milieu d’induction somitique de mésoderm pour compter, et ensemencez une fois 10 aux cinquièmes cellules dans chaque puits d’une plaque de solution extracellulaire de solution-enduite de 12 puits contenant un millilitre de milieu d’induction somitic de mésoderm complété avec 10 micromolaire du rho kinase, ou ROCHE, inhibiteur Y-27632. Ensuite, retournez les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pendant quatre jours de plus, en changeant le milieu ne contenant pas l’inhibiteur les jours un et trois de la culture.

Pour la différenciation syndetome des cellules sclérosées, laver les cellules sclérosome avec PBS avant de détacher les cellules avec 0,2 millilitres de réattant de dissociation cellulaire par puits. Après trois minutes à température ambiante, ajouter 0,8 millilitres de milieu basal chimiquement défini à chaque puits, et détacher les cellules à l’arme d’un grattoir cellulaire. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 millilitres pour centrifugation, et resuspendre la pastille en un millilitre de milieu d’induction syndetome pour le comptage.

Graine cinq fois 10 à la quatrième cellule dans chaque puits d’une plaque extracellulaire de 24 puits recouverte d’une matrice extracellulaire contenant un millilitre de milieu d’induction syndéome, et retourner la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pendant trois jours. Au troisième jour de l’induction syndéome, remplacer le milieu par un milieu d’induction syndetome deux, et retourner la plaque à l’incubateur pendant 18 jours, en changeant le milieu tous les trois jours. Après la différenciation mésomitique de mesoderm, plus de 85% des cellules sont positives pour la protéine delta-like 1, un marqueur du mésoderm présomitique, mais négatif pour PAX3, un marqueur du mésoderm somitique.

Cette population devient PAX3 cellules somitiques positives de mésoderm après quatre jours d’induction somitique de mésoderm. De plus, la coloration de la cadhérine-11, un marqueur du mésoderm somitique épithélialisé, ne s’accumule qu’aux jonctions cellule à cellule, à la suite de l’ajout de CHIR99021. La différenciation vers le dermomyotome, le myotome, le dermatome, le scléotome et le syndéome peut être évaluée par immunocytochimie et fluorescence PAX3.

Semblables aux fibroblastes dermiques humains, les cellules de dermatome iPSC-dérivées produisent le collagène et l’acide hyaluronique comme évalué par ELISA. Pour démontrer la réactivité comparable du syndéome humain iPSC-dérivé et des tenocytes adultes humains, un essai mécanique de stimulation d’étirement peut être exécuté. Avant la passation de l’iPSC, confirmez que la confluence de la culture se situe entre 70 et 80 % et que les cellules divisées se situent entre un et deux pour un pour quatre en conséquence.

Ce passage est essentiel à la différenciation réussie des IPSC. Pour les futures thérapies cellulaires utilisant cette méthode, il est nécessaire d’établir une nouvelle condition exempte de germes qui n’inclut aucun composants dérivés d’animaux non humains.