La microscopie de la force de traction à haut débit à l'aide du SMD révèle les effets dépendants de la dose de la transformation du facteur de croissance sur la transition épithéliale à mesenchymale
1 juin 2019
Nous présentons un assay de traction de haut débit fabriqué avec le caoutchouc de silicone (PDMS). Ce nouvel exemple est approprié pour étudier les changements physiques dans la contractilité cellulaire au cours de divers processus et maladies biologiques et biomédicaux. Nous démontrons l'utilité de cette méthode en mesurant une augmentation dépendante de TGF-MD de contractilité pendant la transition épithélial-à-mesenchymal.
Mon laboratoire s’intéresse à la mécanobiologie, qui examine comment les cellules exercent et sont influencées par les forces mécaniques. Une façon de quantifier la mécanobiologie est de mesurer la contractilité cellulaire. Dans les cellules adhérentes, la contractilité se manifeste dans les forces de traction exercées sur le substrat cellulaire. Nous quantifions ces forces à l’aide d’une méthodologie généralement appelée microscopie de force de traction ou TFM. Et TFM est mis en œuvre dans une grande variété de méthodes différentes, mais un aspect commun est qu’il s’agit d’une technique de laboratoire plutôt sérielle et lente fait généralement dans un seul plat comme celui-ci ici. Cela nous limite à évaluer une population ou une condition à la fois. Tout au long de la culture cellulaire a été améliorée il ya quelque temps, mais la création de plats multiwell et nous avons pensé, ne serait-il pas génial qu’il nous pourrions à TFM avec le même débit accru et la même efficacité du temps et des reagents? Et c’était notre solution. Nous avons donc créé un plat de force de traction de 96 puits. Et il ressemble beaucoup à un plat conventionnel de culture de tissu de puits 96, cependant avec ce plat nous pouvons non seulement examiner 96 conditions différentes de culture cellulaire, mais également quantifier leur contractilité cellulaire. Cela présente une solution de débit beaucoup plus élevée que les approches à plat unique, ce qui nous permet d’examiner diverses conditions cellulaires et les réponses contractiles. Pendant la métastase de cancer, les cellules cancéreuses voyagent de leur emplacement primaire aux emplacements secondaires, propageant la maladie dans notre corps. Ce comportement métastatique des cellules cancéreuses explique 90% de la mort liée au cancer. L’un des mécanismes proposés pour les cellules cancéreuses épithéliales pour acquérir un phénotype plus migrateur et invasif est la transition épithéliale-mésenchymale, EMT. Pendant l’EMT, ils deviennent plus migrateurs et envahissants, changeant leur comportement physique. Pour mieux comprendre ces changements dans le comportement physique, nous utilisons notre substrat de silicium mou pour mesurer les changements dans la contractilité des cellules de glande mammaire de souris avec l’induction d’EMT par TGF-Dans cette étude, nous avons étudié comment différentes concentrations et temps d’incubation du comportement physique des cellules TGF-affect. Le polydimethylsiloxane est un caoutchouc très conforme avec le modulus young le plus bas d’environ 0,6 kilopascal. La rigidité de ce matériau peut également être tunable en utilisant différentes concentrations d’agent crosslink, y compris SYLGARD 184.To mesurer les propriétés mécaniques de PDMS nous utilisons un rhéomètre. Après avoir mélangé la partie A et la partie B du PDMS, dans un rapport de poids un à un et en ajoutant l’agent de séchage avec le pourcentage de poids spécifié, chargez le lot préparé sur la plaque du rhéomètre. Assurez-vous de charger suffisamment de l’échantillon pour couvrir complètement la zone du fuseau. Il est important de s’assurer que le fuseau touche complètement l’échantillon sans espace libre laissé à son bord. Tout échantillon supplémentaire doit être soigneusement coupé et effacé de la plaque. Mesurer le module de stockage final et la dépendance au temps de la viscoéasticité de chaque échantillon en faisant des balayages de temps et de fréquence à une souche de cisaillement oscillatoire de 0,5%Newsha]Ce graphique est un exemple de test de seq de temps, ayant fait pour mesurer le comportement rhéologique du polydimethylsiloxane avec la souche de cisaillement oscillatoire appliquée de 0,5% et la température de 100
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Aperçu
Cette étude présente un test de force de traction à haut débit, fabriqué avec du caoutchouc de silicone (PDMS), conçu pour étudier les changements physiques de la contractilité cellulaire durant divers processus biologiques. L'utilité de cette méthode est démontrée par la mesure des augmentations de la contractilité dépendantes du TGF-β lors de la transition épithélio-mésenchymateuse.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Biomécanique
- Génie biomédical
Contexte
- La contractilité cellulaire est cruciale dans divers processus biologiques.
- La compréhension des modifications de la contractilité peut fournir des informations sur les maladies.
- Les méthodes traditionnelles peuvent manquer de débit et de sensibilité.
- Le PDMS est un matériau polyvalent pour la création de tests.
Objectif de l'étude
- Développer un test à haut débit pour mesurer la contractilité cellulaire.
- Évaluer l'impact du TGF-β sur la contractilité durant la transition épithélio-mésenchymateuse.
- Fournir une méthode fiable pour l'étude du comportement cellulaire dans diverses conditions.
Méthodes utilisées
- Conception d'un test de force de traction utilisant le PDMS.
- Mesure de la contractilité cellulaire en réponse au TGF-β.
- Analyse à haut débit pour évaluer plusieurs échantillons.
- Évaluation de la dynamique de la transition épithélio-mésenchymateuse.
Résultats principaux
- Mesure réussie des modifications de la contractilité cellulaire.
- Mise en évidence d'augmentations de la contractilité dépendantes du TGF-β.
- Validation de l'utilité du test basé sur le PDMS.
- Apport de connaissances sur les mécanismes des processus de transition cellulaire.
Conclusions
- Le test de force de traction au PDMS est efficace pour l'étude de la contractilité cellulaire.
- Une augmentation de la contractilité durant la transition épithélio-mésenchymateuse a été confirmée.
- Cette méthode peut être appliquée à diverses études biologiques et biomédicales.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
Cette plateforme de microscopie de force de traction à haut débit permet une évaluation quantitative de la contractilité cellulaire dans un format évolutif, soutenant la réduction des risques mécanistiques en phase de découverte précoce. En reliant la transition épithélio-mésenchymateuse induite par le TGF-β à des changements biomécaniques mesurables, la méthode offre une valeur prédictive pour la validation de cibles dans la recherche sur la fibrose et les métastases. Le système à base de PDMS assure une reproductibilité et une compatibilité avec les protocoles existants en multi-puits, renforçant son réutilisation dans les pipelines de biologie de la découverte et de développement d'essais.
Applications stratégiques en R-D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'étudier le TGF-β en tant que modulateur de la contractilité cellulaire durant l'EMT, soutenant ainsi la vérification d'hypothèses ciblées.
- Valeur opérationnelle : Fournit des données de contractilité dépendantes de la dose et résolues dans le temps, permettant de hiérarchiser les cibles mécanistiques dans les voies de fibrose et de cancer.
- Valeur prédictive : Quantifie les phénotypes biophysiques associés à l'EMT, facilitant la sélection préclinique des cibles et la réduction des incertitudes liées aux voies biologiques.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Fournit des mesures quantitatives de la contractilité indépendantes du substrat, permettant la standardisation des tests en criblage en mécanobiologie.
- Valeur opérationnelle : Compatible avec les formats à 96 puits, permettant le criblage parallèle de bibliothèques de composés ou de doses de cytokines.
- Prêt à l'emploi pour les tests : Utilise des substrats en PDMS stables et inertes à module ajustable (0,4–100 kPa) et à durée de conservation illimitée, réduisant ainsi la variabilité entre lots.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Corrèle la dose et la durée de l'exposition au TGF-β à la production contractile, soutenant ainsi des modèles précliniques d'EMT alignés sur des biomarqueurs.
- Dérisquage mécanistique : Permet l'évaluation des modifications de la contractilité comme paramètre fonctionnel dans des systèmes pertinentes pour la maladie, avant une validation in vivo.
- Avancement ajusté au risque : Facilite les décisions d'aller/arrêt en corrélant l'intervention moléculaire à la modulation du phénotype biophysique.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de cibles à l'identification de candidats, en fournissant des données biophysiques qui éclairent la prise de décisions en phase précoce.
- Biologie de la découverte : Permet de tester l'hypothèse selon laquelle la signalisation TGF-β affecte la mécanique cellulaire et la contractilité.
- Criblage : Permet une quantification reproductible et à haut débit des forces de traction dans des formats multi-puits pour l'analyse de réponse en fonction de la dose.
- Analytique : Génère des paramètres de contractilité (amplitude et distribution des forces) permettant de comparer différentes concentrations de TGF-β et durées d'exposition.
- Recherche translationnelle : Relie l'induction in vitro de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) à des modifications biomécaniques mesurables, renforçant la pertinence des modèles précliniques.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme reutilisable de mesure des forces de traction, applicable à différents types cellulaires et cibles en mécanobiologie dans les domaines de l'oncologie et de la fibrose.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté des phénotypes mécanobiologiques.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et l'évolutivité grâce à des substrats PDMS standardisés et une compatibilité avec les plaques multi-puits.
- Valeur stratégique : Optimise l'efficacité du capital en permettant des tests parallèles de conditions et en réduisant la consommation de réactifs par point de données.
- Impact sur le portefeuille : Facilite la priorisation ajustée au risque des cibles selon les variations quantitatives de contractilité durant les transitions pathogènes.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture cellulaire, en analyse d'images de microscopie des forces de traction (TFM) et en préparation de substrats en PDMS.
- Repose sur la rhéométrie pour la caractérisation des substrats et sur la microscopie de fluorescence pour la quantification des forces de traction.
- Exige une standardisation de la densité d'ensemencement, de la fonctionnalisation du substrat et des conditions d'imagerie entre les puits.
- L'adaptation à différents types cellulaires peut nécessiter une optimisation de la rigidité du substrat et des ligands d'adhésion.
- Les limitations pratiques incluent l'uniformité de l'épaisseur du substrat et la possibilité de fluorescence autofluorescente du PDMS à certaines longueurs d'onde.
