La microscopie de la force de traction à haut débit à l'aide du SMD révèle les effets dépendants de la dose de la transformation du facteur de croissance sur la transition épithéliale à mesenchymale
June 1st, 2019
Nous présentons un assay de traction de haut débit fabriqué avec le caoutchouc de silicone (PDMS). Ce nouvel exemple est approprié pour étudier les changements physiques dans la contractilité cellulaire au cours de divers processus et maladies biologiques et biomédicaux. Nous démontrons l'utilité de cette méthode en mesurant une augmentation dépendante de TGF-MD de contractilité pendant la transition épithélial-à-mesenchymal.
Mon laboratoire s’intéresse à la mécanobiologie, qui examine comment les cellules exercent et sont influencées par les forces mécaniques. Une façon de quantifier la mécanobiologie est de mesurer la contractilité cellulaire. Dans les cellules adhérentes, la contractilité se manifeste dans les forces de traction exercées sur le substrat cellulaire. Nous quantifions ces forces à l’aide d’une méthodologie généralement appelée microscopie de force de traction ou TFM. Et TFM est mis en œuvre dans une grande variété de méthodes différentes, mais un aspect commun est qu’il s’agit d’une technique de laboratoire plutôt sérielle et lente fait généralement dans un seul plat comme celui-ci ici. Cela nous limite à évaluer une population ou une condition à la fois. Tout au long de la culture cellulaire a été améliorée il ya quelque temps, mais la création de plats multiwell et nous avons pensé, ne serait-il pas génial qu’il nous pourrions à TFM avec le même débit accru et la même efficacité du temps et des reagents? Et c’était notre solution. Nous avons donc créé un plat de force de traction de 96 puits. Et il ressemble beaucoup à un plat conventionnel de culture de tissu de puits 96, cependant avec ce plat nous pouvons non seulement examiner 96 conditions différentes de culture cellulaire, mais également quantifier leur contractilité cellulaire. Cela présente une solution de débit beaucoup plus élevée que les approches à plat unique, ce qui nous permet d’examiner diverses conditions cellulaires et les réponses contractiles. Pendant la métastase de cancer, les cellules cancéreuses voyagent de leur emplacement primaire aux emplacements secondaires, propageant la maladie dans notre corps. Ce comportement métastatique des cellules cancéreuses explique 90% de la mort liée au cancer. L’un des mécanismes proposés pour les cellules cancéreuses épithéliales pour acquérir un phénotype plus migrateur et invasif est la transition épithéliale-mésenchymale, EMT. Pendant l’EMT, ils deviennent plus migrateurs et envahissants, changeant leur comportement physique. Pour mieux comprendre ces changements dans le comportement physique, nous utilisons notre substrat de silicium mou pour mesurer les changements dans la contractilité des cellules de glande mammaire de souris avec l’induction d’EMT par TGF-Dans cette étude, nous avons étudié comment différentes concentrations et temps d’incubation du comportement physique des cellules TGF-affect. Le polydimethylsiloxane est un caoutchouc très conforme avec le modulus young le plus bas d’environ 0,6 kilopascal. La rigidité de ce matériau peut également être tunable en utilisant différentes concentrations d’agent crosslink, y compris SYLGARD 184.To mesurer les propriétés mécaniques de PDMS nous utilisons un rhéomètre. Après avoir mélangé la partie A et la partie B du PDMS, dans un rapport de poids un à un et en ajoutant l’agent de séchage avec le pourcentage de poids spécifié, chargez le lot préparé sur la plaque du rhéomètre. Assurez-vous de charger suffisamment de l’échantillon pour couvrir complètement la zone du fuseau. Il est important de s’assurer que le fuseau touche complètement l’échantillon sans espace libre laissé à son bord. Tout échantillon supplémentaire doit être soigneusement coupé et effacé de la plaque. Mesurer le module de stockage final et la dépendance au temps de la viscoéasticité de chaque échantillon en faisant des balayages de temps et de fréquence à une souche de cisaillement oscillatoire de 0,5%Newsha]Ce graphique est un exemple de test de seq de temps, ayant fait pour mesurer le comportement rhéologique du polydimethylsiloxane avec la souche de cisaillement oscillatoire appliquée de 0,5% et la température de 100
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Aperçu
Cette étude présente un dosage de force de traction à haut débit fabriqué avec du caoutchouc silicone (PDMS), conçu pour étudier les changements physiques dans la contractilité cellulaire au cours de divers processus biologiques. L'utilité de la méthode est démontrée par la mesure des augmentations dépendantes du TGF-β dans la contractilité au cours de la transition épithéliale-mésenchymateuse.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Biomécanique
- Ingénierie biomédicale
Contexte
- La contractilité cellulaire est cruciale dans divers processus biologiques.
- Comprendre les changements de contractilité peut fournir des indications sur les maladies.
- Les méthodes traditionnelles peuvent manquer de débit et de sensibilité.
- Le PDMS est un matériau polyvalent pour créer des dosages.
Objectif de l'étude
- Développer un dosage à haut débit pour mesurer la contractilité cellulaire.
- Évaluer l'impact du TGF-β sur la contractilité au cours de la transition épithéliale-mésenchymateuse.
- Fournir une méthode fiable pour étudier le comportement cellulaire dans diverses conditions.
Méthodes utilisées
- Fabrication d'un dosage de force de traction utilisant du PDMS.
- Mesure de la contractilité cellulaire en réponse au TGF-β.
- Analyse à haut débit pour évaluer plusieurs échantillons.
- Évaluation de la dynamique de la transition épithéliale-mésenchymateuse.
Résultats principaux
- Mesure réussie des changements de contractilité dans les cellules.
- Augmentations dépendantes du TGF-β dans la contractilité démontrées.
- Utilité du dosage basé sur le PDMS validée.
- Indications fournies sur la mécanique des processus de transition cellulaire.
Conclusions
- Le dosage de force de traction PDMS est efficace pour étudier la contractilité cellulaire.
- L'augmentation de contractilité au cours de la transition épithéliale-mésenchymateuse a été confirmée.
- Cette méthode peut être appliquée à diverses études biologiques et biomédicales.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
This high-throughput traction force microscopy platform enables quantitative assessment of cellular contractility in a scalable format, supporting mechanistic de-risking in early discovery. By linking TGF-β-induced epithelial-to-mesenchymal transition to measurable biophysical changes, the method provides predictive value for target validation in fibrosis and metastasis research. The PDMS-based system offers reproducibility and compatibility with existing multi-well workflows, enhancing enterprise reuse across discovery biology and assay development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of TGF-β as a modulator of cellular contractility during EMT, supporting target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides dose-dependent and time-resolved contractility data to prioritize mechanistic targets in fibrosis and cancer pathways.
- Predictive Value: Quantifies biophysical phenotypes linked to EMT, aiding in preclinical target selection and pathway de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, substrate-independent contractility measurements for assay standardization in mechanobiology screening.
- Operational Value: Compatible with 96-well formats, enabling parallel screening of compound libraries or cytokine doses.
- Assay Readiness: Uses stable, inert PDMS substrates with tunable modulus (0.4–100 kPa) and indefinite shelf life, reducing batch variability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links TGF-β dose and duration to contractile output, supporting biomarker-aligned preclinical models of EMT.
- Mechanistic De-risking: Enables evaluation of contractility changes as a functional readout in disease-relevant systems prior to in vivo validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by correlating molecular intervention with biophysical phenotype modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing biophysical readouts that inform early-phase decision-making.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of TGF-β signaling effects on cellular mechanics and contractility.
- Screening: Enables high-throughput, reproducible quantification of traction forces across multi-well formats for dose-response analysis.
- Analytics: Generates contractility metrics (force magnitude, distribution) that allow comparison of TGF-β concentrations and exposure times.
- Translational Research: Connects in vitro EMT induction to measurable biomechanical changes, supporting preclinical model relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable traction force platform applicable across cell types and mechanobiology targets in oncology and fibrosis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in mechanobiological phenotypes.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized PDMS substrates and multi-well compatibility.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling parallel condition testing and reducing reagent consumption per data point.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on quantitative contractility shifts during pathogenic transitions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, TFM image analysis, and PDMS substrate preparation.
- Depends on rheometry for substrate characterization and fluorescence microscopy for traction force quantification.
- Necessitates standardization of seeding density, substrate functionalization, and imaging conditions across wells.
- Adaptation to different cell types may require optimization of substrate stiffness and adhesion ligands.
- Practical limitations include substrate thickness uniformity and potential autofluorescence of PDMS at certain wavelengths.
