Name: Un modèle orthotopic de souris orthopique dhépatocyteonon oncogène du cancer hépatocellulaire surgissant dans le cadre de linflammation et de la fibrose hépatiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: Découvrez un modèle orthotopique de souris pour étudier le cancer hépatocellulaire avec fibrose hépatique et injection intrasplénique. Cette méthode reproduit fidèlement les caractéristiques immunitaires cliniques de la tumeur.

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Ce travail est soutenu par NIH/NCI R01 CA164335-01A1 (K. F. Staveley-O'Carroll, PI) et NIH/NCI R01CA208396 (Mark Kester, Guangfu Li, Kevin F. Staveley-O'Carroll).

REMARQUE: Toute la procédure, y compris les sujets animaux ont été approuvés par l'IACUC à l'Université du Missouri. Toutes les souris ont reçu des soins humains selon les critères décrits dans le «Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire». La procédure suivante pour l'isolement cellulaire et l'inoculation doit être effectuée dans une hotte. Tous les artistes interprètes ou exécutants doivent porter l'équipement de protection individuelle standard pour la manipulation des souris et des tissus.
1. Induction de la fibrose hépatique et de la cirrhose avec injection IP de tétrachlorure de carbone (CCl4)
REMARQUE : Voir la figure 1. (CCl4 est réactif très dangereux, il doit être manipulé avec soin et avec le port de gants résistants aux produits chimiques)
<ol><li>Obtenir des souris mâles C57BL/6J âgées de six à huit semaines (voir Tableau des matériaux).</li>
	<li>Préparer une solution de 10 % CCl4 (v/v) dans de l'huile de maïs dans un tube de centrifugeuse. Déterminer le volume total en fonction du nombre de souris à injecter (voir l'étape 1.6).</li>
	<li>Utilisez la technique de manipulation appropriée des souris pour sélectionner une souris pour l'injection.</li>
	<li>Retenez manuellement la souris avec son côté dorsale (abdomen) vers le haut.</li>
	<li>Nettoyer le site d'injection sur la paroi abdominale de la souris en frottant avec 70% d'alcool.</li>
	<li>Injecter des souris mâles C57BL/6J avec 160 l de 10 % de solution CCl4 par injection intrapéritonéale (IP) à l'aide d'une aiguille jetable de calibre 25.</li>
	<li>Assurez-vous que l'aiguille pénètre juste à travers la paroi abdominale (environ 4-5 mm) avec le côté bevel vers le haut et légèrement incliné e à 15-20 degrés.</li>
	<li>Injectez des souris deux fois par semaine pour un total de quatre semaines - chaque souris recevra un total de huit injections. REMARQUE : Deux semaines après la dernière injection, les souris traitées sont prêtes pour l'inoculation d'ISPL des hépatocytes oncogènes des souris de MTD2.</li>
</ol>2. Isoler les hépatocytes tagogènes des souris Line MTD2
REMARQUE : Voir le tableau 1 pour les recettes de solutions.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>10x Earle's Balanced Salt Solution sans Ca ou Mg (EBSS sans Ca ou Mg)</td>
			<td>4 g KCl 68 g NaCl 1,4 g de NaH2PO4 H2o 10 g de dextrose Ajouter de l'eau à 1 litre, pH à 4,32 Passer par le filtre</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solution 1</td>
			<td>20 mL 10x EBSS sans Ca ou Mg 44 g NaHCO3 1,33 mL 1,5 M d'hélice 10 ml de 10 ml EGTA Ajouter de l'eau à 200 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solution 2</td>
			<td>100 mL 10x EBSS 2,2 g NaHCO3 6,67 mL 1,5 M Hepes Ajouter de l'eau à 1 litre</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solution de collagène de 0,75 %</td>
			<td>15 mg de collagène de type 1 20 ml de solution 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Moyen complet</td>
			<td>2 RPMI 50 mL FBS 5 mL 100x Pénicilline-Streptomycine</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Recettes de solution.
<ol><li>Obtenir des souris MTD238 pour servir de source d'hépatocytes oncogènes.</li>
	<li>Anesthésiez les souris MTD2 de 5 semaines à l'aide d'isoflurane de 2,5 %. REMARQUE : Une bonne anesthésiation sera vérifiée par la méthode de pincement des orteils. En bref, à l'aide de deux doigts, donner à l'orteil de la souris / pied une bonne pression. S'il n'y a pas de réaction de sevrage, l'animal est jugé assez profond pour commencer la chirurgie.</li>
	<li>Lorsqu'ils sont suffisamment sédatifs, placez les souris en position de supine et fixez les extrémités avec du ruban adhésif pour fournir une exposition adéquate de la surface abdominale.</li>
	<li>Effectuer une incision laparotomie midline à l'aide de ciseaux le long de la ligne alba assez grand pour fournir une exposition adéquate du foie.</li>
	<li>Déplacer les intestins vers la gauche pour fournir une meilleure exposition du foie et triade portail.</li>
	<li>Disséquer au-dessus du foie pour exposer le cava de veine inférieur (IVC).</li>
	<li>Ligate l'IVC au-dessus du foie à l'aide d'une pince à artère.</li>
	<li>Pour en revenir à la bordure inférieure du foie, utilisez une aiguille de papillon (voir les matériaux) pour accéder IV à la veine du portail. Fixer le cathéter à la main.</li>
	<li>Perfil le foie de souris successivement à l'aide d'une seringue d'injection à 8,9 ml/min avec 15 ml de solution 1, 15 ml de solution de collagène de 0,75% 2, et 15 ml de solution 2 via le cathéter.</li>
	<li>Récoltez le foie perfusé en coupant et en prenant la masse tumorale des souris de MTD2 dans un tube conique de 50 ml avec 10-15 ml de PBS.</li>
	<li>Retirez PBS et lavez un temps supplémentaire avec PBS; ne pas centrifuger à cette étape.</li>
	<li>Couper le foie en petits morceaux à l'aide de ciseaux, puis laver à nouveau avec PBS 2x pour enlever le sang restant.</li>
	<li>Ajouter 5 ml de milieu COMPLET de RPMI au tube conique et hacher continuellement le foie avec des ciseaux en petits morceaux (lt;3 mm)-tissu devrait passer en douceur par une pipette de 5 ml.</li>
	<li>Ajouter RPMI complet à un volume final de 30 ml et suspendre le foie à l'aide d'une pipette de 5 ml.</li>
	<li>Filtrer la solution mixte à l'utilisation d'une passoire de 70 m dans un tube conique de 50 ml.</li>
	<li>Laver la passoire plusieurs fois avec RPMI complet et ajuster le volume final à 50 ml en ajoutant un support RPMI supplémentaire.</li>
	<li>Faire tourner rapidement la suspension par centrifugeuse jusqu'à un maximum de 500 tr/min; une fois que la vitesse est accélérée à 50 x g,la centrifugeuse doit être arrêtée.</li>
	<li>Décant le supernatant et suspendez les granulés dans 20 ml de PBS.</li>
	<li>Compter les cellules à l'aide de l'exclusion bleue Trypan et un hémocytomètre, puis ajuster la concentration cellulaire à 2,5 x 106/mL pour l'inoculation cellulaire suivante. REMARQUE: Le rendement attendu de 5 grammes de tissu tumoral est de 80 millions d'hépatocytes avec la viabilité de 'gt;95%.</li>
</ol>3. Inoculation des hépatocytes des souris MTD2 au foie des souris sauvages de type C57BL/6J par injection d'ISPL
<ol><li>La technique aseptique doit être utilisée dans toutes les procédures</li>
	<li>Anesthésier les souris C57BL/6J mâles traitées cCl4avec 2,5% d'isoflurane, les souris doivent être traitées avec du lubrifiant pour les yeux pour empêcher les yeux de se dessécher.</li>
	<li>Préparer des seringues avec 200 l d'hépatocytes pour l'injection.</li>
	<li>Lorsqu'il est suffisamment sédatif, placez les souris avec le côté gauche vers le haut.</li>
	<li>Raser tout le flanc gauche des souris, puis frotter la zone, en alternant entre 70% d'alcool et de bêtadine trois fois.</li>
	<li>Administrer 5 mg/kg de carprofène sous-cutané ouly avant l'incision chirurgicale.</li>
	<li>Faire une incision de 1 cm sur le flanc gauche parallèle à la côte 13e de l'extrême dorsal début juste en dessous du muscle de la colonne vertébrale.</li>
	<li>Identifiez la rate, puis extériez-la à l'aide de forceps à pointe émoussée.</li>
	<li>Clip la rate avec deux clips de titane de taille moyenne. Placez les deux clips entre l'artère splénique et la veine, laissez de la place entre les clips pour couper plus tard après l'inoculation. REMARQUE : L'objectif est d'isoler le pôle inférieur de la rate afin de réduire le risque d'ensemencement.</li>
	<li>Injecter 200 L (0,5 million) d'hépatocytes préparés dans le pôle inférieur de la rate à l'aide d'une aiguille de 27 G.</li>
	<li>Clip la branche inférieure du pédicle (navires à pôles spléniques inférieurs) avec un clip de taille moyenne.</li>
	<li>Couper la rate entre les deux clips initialement placés.</li>
	<li>Enlever le poteau inférieur de la rate qui a été directement injecté avec des cellules tumorales.</li>
	<li>Utilisez 3-0 polyglactin 910 interrompu suturing pour fermer la couche musculaire interne.</li>
	<li>Utilisez des pinces à plaies en acier stérilisées pour fermer la couche externe de la peau. REMARQUE : Les clips en acier sont préférés aux sutures pour éviter que les animaux ne mâchent des sutures, laissant une plaie béante.</li>
	<li>Administrer 5 mg/kg de carprofène sous-cutané après la suture.</li>
	<li>Placez tous les animaux en convalescence sur un coussin chauffant à température contrôlée et surveillez de près jusqu'à ce qu'ils soient complètement remis de l'anesthésie.</li>
	<li>Donnez aux souris un accès gratuit à l'eau après la chirurgie. Si la souris se déshydrate pendant la chirurgie, administrez des liquides sous-cutanés (1 ml).</li>
	<li>Enlever les pinces de peau à 7-10 jours postopératoirement.</li>
</ol>

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<li>Held, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+antigen+expression+and+tumorigenesis+in+transgenic+mice+containing+a+mouse+major+urinary+protein%2FSV40+T+antigen+hybrid+gene%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">T antigen expression and tumorigenesis in transgenic mice containing a mouse major urinary protein/SV40 T antigen hybrid gene.</a> EMBO Journal. 8, 183-191 (1989).</li>
<li>Hanahan, D., Weinber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
</ol>

Il n'y en a pas à déclarer.

Avec ce protocole, nous avons établi un modèle murine fiable et reproductible de HCC qui imite l'initiation et la progression humaines de HCC. Cliniquement, de nombreux facteurs de risque induisent successivement des lésions hépatiques, la fibrose hépatique, la cirrhose et l'étape finale de HCC. Dans notre protocole, l'injection IP de CCl4 est utilisée pour produire d'abord la fibrose hépatique chez les souris de type sauvage, ce qui permet aux hépatocytes oncogènes suivants de former les tumeurs dans le cadre...

Le cancer hépatocellulaire (HCC) est le type de cancer le plus rapidement croissant aux États-Unis (US)1,2,3. Chaque année, environ 850 000 nouveaux cas sont diagnostiqués4,5 et 700 000 patients meurent de cette maladie mortelle6,7,8,9,10 , ce qui en fait la deuxième cause de décès lié au cancer dans le monde. La gestion de HCC inclut la résection chirurgicale, la transplantation, l'ablation, la chimioembolization, ou les thérapies systémiques, telles que le sorafenib11. Le diagnostic et la gestion tôt avec la résection ou la transplantation chirurgicale ont l'avantage global de survie le plus élevé4. Malheureusement, la majorité des patients présents à un stade ultérieur et nécessitent une prise en charge avec ablation, chimioembolisation ou sorafenib12. Sorafenib, un inhibiteur de la tyrosine kinase récepteur (RTKI), a été approuvé par la Food and Drug Administration en 2008 comme la seule thérapie médicamenteuse systémique disponible pour le traitement de HCC non résécable. Bien que le médicament ne prévoit qu'une légère augmentation de la survie globale, de 7,9 à 10,7 mois13, il a fourni une nouvelle stratégie thérapeutique qui pourrait être utilisé pour gérer HCC.
Manipuler le système immunitaire pour éliminer les cancers établis est un domaine en croissance rapide dans la recherche sur le cancer14. Les études de point de contrôle immunitaire ont considérablement avancé le développement de médicaments immunothérapeutiques dans le traitement du cancer15,16. La FDA a approuvé l'utilisation d'anticorps (Abs) contre l'antigène cytotoxique T-lymphocyte 4 (CTLA-4), la protéine de mort cellulaire programmée 1 (PD-1), et son ligand PD-L1 pour le traitement du mélanome, du cancer du poumon, du cancer de la tête et du cou, et du cancer de la vessie17, 18 ans, états-unis qui , 19 ans, états-unis qui , 20. Les essais cliniques de monothérapie ou de thérapie combinée utilisant un ou plusieurs anticorps contre PD-1, PD-L1, ou CTLA-4 pour le traitement du HCC avancé sont en cours21,22,23, et certains essais ont donné des résultats favorables. En 2017, la FDA a accordé l'approbation accélérée pour l'anticorps anti-PD-1 pour traiter les patients HCC, qui sont la résistance au sarafenib, mais le taux de réponse global de cette thérapie est seulement 14,3%. D'autres stratégies n'ont pas été traduites en pratique clinique pour le moment24,25. Surmonter la tolérance immunitaire profonde induite par la tumeur pour améliorer la thérapie de point de contrôle immunitaire26; prédire l'efficacité du traitement de contrôle immunitaire; prévenir les effets indésirables liés au système immunitaire; l'optimisation de l'itinéraire, de la posologie et de la fréquence de l'administration; et trouver des combinaisons efficaces de thérapies27,28,29 restent toutes des tâches extrêmement difficiles.
Il existe plusieurs approches conventionnelles utilisées pour induire HCC dans les modèles de souris actuellement et sont utilisés en fonction de la question de recherche particulière de l'enquêteur30. Les modèles chimiquement induits de souris de HCC avec des composés génotoxiques imitent la malignité injury-induite. Les modèles de xénogreffe par l'implantation ectopique ou orthotopic des lignées de cellules de HCC sont appropriés pour le criblage de drogue. Un certain nombre de souris génétiquement modifiées ont été conçues pour étudier la physiopathologie de HCC. Les souris transgéniques exprimant des gènes viraux, des oncogènes et/ou des facteurs de croissance permettent d'identifier les voies impliquées dans l'hépatocarcinogenèse. En raison des limitations inhérentes, ces modèles ne récapitulent pas les caractéristiques immunitaires typiques vues dans HCC humain, qui a considérablement empêché l'élucidation des mécanismes sous-jacents et le développement des stratégies immunothérapeutiques innovatrices14 ,15. Nous avons récemment créé un modèle de murine cliniquement pertinent. Ce nouveau modèle imite non seulement l'initiation et la progression humaines de HCC mais reflète également les dispositifs les plus typiques de la maladie humaine comprenant le dysfonctionnement immunisé. Nous avons caractérisé ses caractéristiques biologiques et immunologiques. S'appuyant sur ce nouveau modèle, nous avons exploré diverses stratégies immunothérapeutiques pour traiter HCC31,32,33,34,35,36, 37. Cette plate-forme unique nous permet d'étudier les mécanismes de l'immunotolérance induite par la tumeur et de développer des stratégies thérapeutiques de preuve de concept pour HCC vers la traduction clinique éventuelle.

<table><tbody><tr><td>Appareil d’anesthésie</td><td>VETEQUIP</td><td>IMPAC6</td><td>appareil d’anesthésie pour la chirurgie</td></tr><tr><td>Aiguille papillon</td><td>BD</td><td>8122963</td><td>Aiguille utilisée pour la perfusion hépatique</td></tr><tr><td>C57BL/6 souris</td><td>Jackson Lab</td><td>000664&nbsp ;</td><td>souris utilisées dans le prototol</td></tr><tr><td>Carprofène</td><td>CRESCENT CHEMICAL</td><td>20402</td><td>carprofène pour l’élimination de la douleur</td></tr><tr><td>Passoire cellulaire&nbsp ;</td><td>CORNING</td><td>REF 431751</td><td>Passoire à cellules, 70&micro ; m, pour l’isolement des hépatocytes</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-30R</td><td>pour l’isolement cellulaire</td></tr><tr><td>Clips&nbsp ;</td><td>Teleflex Medical</td><td>REF 523700</td><td>Titane Pinces pour</td></tr><tr><td>microscope</td> à rate <td>Zeiss</td><td>Primovert&nbsp ;</td><td>Microscope pour l’observation cellulaire</td></tr><tr><td>Mtd2 souris</td><td>N/A</td><td></td><td>Don du Dr William A Tenu à l’Institut du cancer de Roswell Park en 2002, maintenu dans notre laboratoire</td></tr><tr><td>Aiguille</td><td>BD</td><td>REF 305109</td><td>BD aiguille de précision, 27G x 1/2 (0,4 mm x 13 mm)</td></tr><tr><td>Suture</td><td>ETHICON</td><td>J303H</td><td>enduite VICRYL</td></tr><tr><td>Suture SV40 T Ag anticorps</td><td>Abcam</td><td>ab16879</td><td>anti-SV40 Anticorps antigène T pour IHC</td></tr><tr><td>Seringue</td><td>BD</td><td>REF 309626</td><td>Seringue TB 1 mL pour injection cellulaire</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>SIGMA</td><td>T 8154</td><td>Trypan blue solution pour test de viabilité cellulaire</td></tr><tr><td>Pinces de plaie</td><td>Reflex</td><td>reflex9, réf. 201-1000</td><td>Pinces de plaie en acier inoxydable pour la fermeture de la plaie</td></tr></tbody></table>

un modèle orthotopic de souris orthopique d'hépatocyteonon oncogène du cancer hépatocellulaire surgissant dans le cadre de l'inflammation et de la fibrose hépatiques

An Oncogenic Hepatocyte-Induced Orthotopic Mouse Model of Hepatocellular Cancer Arising in the Setting of Hepatic Inflammation and Fibrosis

L'absence d'un modèle animal cliniquement pertinent traitant des caractéristiques immunitaires typiques du cancer hépatocellulaire (HCC) a considérablement entravé l'élucidation des mécanismes sous-jacents et le développement de stratégies immunothérapeutiques novatrices. Pour développer un modèle animal idéal récapitulant le HCC humain, les souris mâles immunocompétentes C57BL/6J reçoivent d'abord une injection de tétrachlorure de carbone (CCl4) pour induire la fibrose hépatique, puis reçoivent des hépatocytes oncogènes histologiquement normaux de jeunes mâles Souris transgéniques d'antigène de T (TAg)-genos (MTD2) par inoculation intra-splénique (ISPL). Les androgènes produits chez les souris mâles destinataires à la puberté initient l'expression de TAg sous le contrôle d'un promoteur foie-spécifique. En conséquence, les hépatocytes transférés deviennent des cellules cancéreuses et forment des masses de tumeur dans le cadre de la fibrose/cirrhose de foie. Ce nouveau modèle imite l'initiation et la progression humaines de HCC dans le contexte de la fibrose/cirrhose de foie et reflète les dispositifs les plus typiques de HCC humain comprenant le dysfonctionnement immunisé.

Des hépatocytes oncogéniques isolés chez des souris transgéniques TAg (figure 2) ont été ensemencés dans le foie de souris de type sauvage par injection intra-splénique (figure 3). Les hépatocytes transplantés avec succès et fiable augmenté tumeurs orthotopiques HCC (Figure 4) avec la tumeur spécifique antigène SV40 TAg (Figure 5) dans le cadre de l'inflammation hépatique et la fibrose ( Figure1).
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Ici, nous décrivons le développement d'un modèle de murine médicalement pertinent du cancer du foie récapitulant les dispositifs immunisés typiques du cancer hépatocellulaire (HCC).

Un modèle orthotopic de souris orthopique d'hépatocyteonon oncogène du cancer hépatocellulaire surgissant dans le cadre de l'inflammation et de la fibrose hépatiques

The absence of a clinically relevant animal model addressing the typical immune characteristics of hepatocellular cancer (HCC) has significantly impeded ...

L’utilisation juste d’un modèle pour développer un modèle hépatocellulaire de masse de cancer pourrait aider des personnes élucider leur immunotolerance tumeur-induite et traitement spécifique induit, n’importe quelle immunoresponses de tumeur. La tumeur orthotopique qui se développe avec la technique de fibrose hépatique imite les caractéristiques cliniques du cancer du foie humain. Cette méthode pourrait fournir un outil utile dans l’étude immunologique hépatocellulaire de cancer.La démonstration visuelle de cette méthode peut illustrer les étapes plus techniquement difficiles, telles que l’injection intrasplenique, qui sont essentielles pour une exécution réussie de ce protocole. Ensuite, retenez manuellement un mâle, de six à huit semaines C57 noir 6 souris dorsale côté vers le haut. Utilisez d’autres gommages à 70 % d’éthanol et de bétadine pour nettoyer le site d’injection à trois reprises.Livrez ensuite 160 microlitres de tétrachlorure de carbone à la souris par injection intraperitoneal et retournez l’animal dans sa cage d’origine. Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des pieds, chez une souris transgénique simienne de cinq mois 40 T, placez la souris en position supine et fixez les membres avec du ruban adhésif. Faire une incision de laparotomie médiane le long de la longueur de l’alba linea, assez grand pour fournir une exposition adéquate du foie, et déplacer les intestins vers la gauche.Disséquer au-dessus du foie pour l’exposition au cava vena inférieur. Induire une pince d’artère pour ligate le navire. Utilisez une aiguille papillon pour obtenir un accès intraveineux à la veine du portail et fixez manuellement le cathéter.Changer soigneusement les seringues pour chaque solution, livrer avec succès 15 millilitres de solution un, 15 millilitres de 0,75%collagenase solution deux, et 15 millilitres de solution deux sans collagène via cathéter, à un taux d’écoulement d’environ 8,9 millilitres de solution par minute. À la fin de la perfusion, récolter la masse tumorale dans un tube conique de 50 millilitres contenant 10 à 15 millilitres de PBS. Exciser la tumeur de la prochaine souris MTD2 comme vient de le démontrer.Utilisez des ciseaux pour couper les foies en petits morceaux. Transférer les tissus dans un nouveau récipient de PBS frais pour enlever le reste du sang du tissu avant de transférer les morceaux de tissu dans un tube conique de 50 millilitres contenant cinq millilitres de milieu rpmi complet. Hacher les échantillons de foie lavés jusqu’à ce que les morceaux puissent s’insérer facilement à travers la pointe d’une pipette de cinq millilitres.Ajouter suffisamment de milieu au tube pour atteindre un volume final de 30 millilitres. Utilisez une pipette de cinq millilitres pour triturer les fragments de tissu, avant de filtrer la solution à travers une passoire de 70 micromètres dans un nouveau tube de 50 millilitres. Laver la passoire plusieurs fois avec un milieu complet.Réglez le volume final à 50 millilitres avec un support complet supplémentaire. Faites tourner rapidement la suspension par centrifugation jusqu’à un maximum de 50 fois g avant d’arrêter la centrifugeuse et de décanter le supernatant. Puis resuspendez la pastille en 20 millilitres de PBS pour le comptage.Pour l’injection intrasplenique des hépatocytes MTD2, chargez une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 27 par animal receveur avec 220 microlitres d’hépatocytes par souris. Confirmer un manque de réponse au pincement des pieds chez un animal anesthésié traité au tétrachlorure de carbone. En commençant juste en dessous du muscle de la colonne vertébrale, ensuite, faire une incision d’un centimètre sur le flanc gauche parallèle à la treizième côte de l’extrême dorsale et utiliser des forceps émoussés pour extérioriser la rate.Couper la rate avec deux clips de titane de taille moyenne entre l’artère splénique et la veine, et livrer 200 microlitres de cellules dans le pôle inférieur de la rate. Coupez la branche inférieure du pédule avec un clip de taille moyenne et coupez la rate entre les deux clips initialement placés. Enlever le pôle inférieur de la rate qui a été directement injecté avec des cellules tumorales et utiliser 3-0 polyglactine 910 interrompu suturing pour fermer la couche musculaire interne.Utilisez ensuite des pinces à plaies en acier stérilisées pour fermer la couche externe de la peau et administrer sous-cutanéement cinq milligrammes par kilogramme de carprofène. Après isolement des souris transgéniques d’antigène de T comme démontré, les hépatocytes et les cellules d’infiltration de tumeur peuvent être observés. Les cellules démontrent généralement une viabilité de près de 100% après traitement.Après l’inoculation intrasplenique dans les animaux traités au tétrachlorure de carbone de type sauvage, les hépatocytes transplantés cultivent avec succès et fiabilité des tumeurs orthotopiques du carcinome hépatocellulaire qui expriment l’antigène 40 T du virus simien spécifique à la tumeur. La préparation de notre population viable et pure d’hépatocytes de la masse MTD2 et l’administration précise de l’injection intrasplenique sont importantes pour le succès de la procédure. Bien que notre équipe ait testé l’inoculation d’hépatocyte dans les souris destinataires par injection intravasculaire et intraperitoneal, ces autres méthodes n’ont pas pu induire le carcinome hépatocellulaire orthotopique.Ce modèle fournit une plate-forme unique permettant l’investigation pour la surveillance immunisée et la tolérance dans ses premiers et les derniers stades de la progression de tumeur. S’il vous plaît être prudent lors de l’utilisation du tétrachlorure de carbone, car il est toxique.

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L'infection de souris avec une Adénovirus exprimant l'auto-antigène majeur humaine cytochrome P450 2D6 (hCYP2D6) reconnus par des sérums de patients souffrant de de type 2 résultats des l'hépatite auto-immunes dans une forme persistante de maladie du foie auto-immune à médiation caractérisé par l'hépatite, fibrose extensive et de génération d'un CYP2D6 -réponse immunitaire spécifique.

Le modèle du CYP2D6 animale: Comment provoquer une hépatite auto-immune chez la souris

Xénogreffes de tumeurs humaines dans des souris immunodéficientes sont des outils précieux pour étudier la biologie du cancer. Des protocoles spécifiques pour générer des xénogreffes sous-cutanées et intra-hépatiques à partir de cellules humaines de carcinome hépatocellulaire ou des fragments de tumeur sont décrits. La régénération du foie induite par une hépatectomie partielle dans les souris receveuses sont présentées en tant que stratégie pour faciliter la prise de greffe intrahépatique.

Génération de sous-cutanée et intra-hépatique droits de carcinome hépatocellulaire xénogreffes chez la souris immunodéficientes

La perturbation de l’écoulement de la bile entraîne une lésion hépatique cholestatique inflammatoire sévère avec une séquence caractéristique d’altérations morphologiques dépendante du temps. Nous présentons ici un protocole de ligature chirurgicale du canal cholédoque chez la souris qui permet d’induire une forte réponse fibrotique après 21 à 28 jours.

Bile ligature du canal chez la souris: induction de inflammatoire lésions hépatiques et les fibrose par obstructive cholestase

La dissémination métastatique du cancer est la principale cause de décès liés au cancer. Nous fournissons une description en profondeur de notre méthodologie de chirurgie de survie pour établir un système orthotopique "patient comme" modèle de souris syngénique pour étudier les mécanismes de métastases dans les tumeurs d'organes solides.

Un «Patient-Like&quot; Orthotopique Syngénique modèle de souris de carcinome hépatocellulaire Métastases

Ce protocole fournit une méthode fiable pour établir des souris humanisées avec le système immunitaire humain et les cellules hépatiques. Les souris immunodéficientes doublement reconstituées réalisées par injection intrasplégique d'hépatocytes humains et de CD34- cellules souches hématopoïétiques sont sensibles à l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine-1 et récapitulent les lésions hépatiques observées dans patients infectés par le VIH.

Création du modèle de souris TK-NOG humanisé double pour la pathogénie du foie associée au VIH

Ce protocole présente un modèle biomimétique 3D avec compartiment stromal fibrotique d’accompagnement. Préparé avec des hydrogels physiologiquement pertinents dans des rapports imitant les propriétés biophysiques de la matrice extracellulaire stromal, un médiateur actif des interactions cellulaires, de la croissance tumorale et de la métastase.

Un modèle biomimétique pour le cancer du foie pour étudier les interactions tumeur-stroma dans un environnement 3D avec tunable propriétés bio-physiques

L’injection veineuse portale d’organoïdes du cancer colorectal (CCR) génère des métastases hépatiques riches en stroma. Ce modèle murin de métastases hépatiques du CCR représente un outil utile pour étudier les interactions tumeur-stroma et développer de nouvelles thérapies dirigées par le stroma telles que les thérapies géniques médiées par le virus adéno-associé.

Injection veineuse portale d’organoïdes du cancer colorectal pour étudier la métastase hépatique Stroma

Ici, nous présentons un protocole pour créer des xénogreffes orthotopiques de carcinome hépatocellulaire avec et sans ligature de l’artère hépatique et effectuer une imagerie non invasive par tomographie par émission de positrons (TEP) de l’hypoxie tumorale en utilisant [18 F]Fluoromisonidazole ([18 F]FMISO) et [18 F]Fluorodésoxyglucose ([18F]FDG).

Imagerie TEP/RM non invasive dans un modèle murin orthotopique de carcinome hépatocellulaire

Les organoïdes générés à partir des tumeurs des patients sont injectés orthotopiquement dans le foie de la souris. La résection du tissu hépatique non tumoral conduit à un environnement régénérateur dans le tissu hépatique où se trouve la tumeur.

Un modèle de xénogreffe organoïde dérivé d’un patient atteint d’un cancer hépatocellulaire pour étudier l’impact de la régénération hépatique sur la croissance tumorale

Le modèle murin d’hépatectomie partielle de 2/3 (66 %) est bien décrit dans la littérature, mais les hépatectomies plus étendues imitant le syndrome de petite taille après une transplantation hépatique ont rarement été utilisées. Nous décrivons une procédure d’hépatectomie prolongée à 78 % dans un modèle murin qui entraîne une létalité postopératoire d’environ 50 % chez des souris saines.

Hpatectomie prolongée à 78 % dans un modèle chirurgical de souris

Ce protocole présente un pipeline d’imagerie complet pour visualiser et modéliser la morphologie des cellules étoilées hépatiques dans le tissu hépatique intact. Cette approche combine le marquage fluorescent des fibroblastes utilisant la génétique de la souris, une préparation tissulaire in situ basée sur la perfusion hépatique, et une méthode modifiée de nettoyage tissulaire iDISCO pour obtenir une transparence optique.

Cartographie de la morphologie des cellules étoilées hépatiques dans des modèles murins de fibrose hépatique

Découvrez un modèle orthotopique de souris pour étudier le cancer hépatocellulaire avec fibrose hépatique et injection intrasplénique. Cette méthode reproduit fidèlement les caractéristiques immunitaires cliniques de la tumeur.

Un modèle orthotopic de souris orthopique dhépatocyteonon oncogène du cancer hépatocellulaire surgissant dans le cadre de linflammation et de la fibrose hépatiques (Vidéo) | JoVE Journal

Un modèle orthotopic de souris orthopique d'hépatocyteonon oncogène du cancer hépatocellulaire surgissant dans le cadre de l'inflammation et de la fibrose hépatiques

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