Name: Imagerie confocale direct des méristèmes apicaux de différentes espèces de plantes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Apprenez l'imagerie confocale directe des méristèmes apicaux chez Arabidopsis, tomate et soja. Cette méthode offre une haute résolution cellulaire sans fixation ni sectionnement.

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5 minutes

Les auteurs remercient Purdue Bindley Bioscience Center Imaging Facility pour accéder aux microscope confocal à balayage laser et le support technique, et les auteurs apprécient l’aide de Andy Schaber dans les installations d’imagerie Purdue Bindley. Cette activité a été financée par l’Université de Purdue dans le cadre du carrefour de AgSEED pour soutenir l’Agriculture et du développement Rural de l’Indiana.

1. préparation de plats médias et imagerie
<ol><li>Plaques de MS : ajouter 0,5 x milieu de Murashige et Skoog MS moyen, 1 % d’agar dans l’eau désionisée et ensuite ajuster le pH de 5,8 à l’aide de la solution d’hydroxyde de potassium (facultatif : ajouter 1 % de saccharose pour la culture de plantes à long terme). Plaques d’autoclave et verser.</li>
	<li>Imagerie des plats : remplir des boîtes de pétri en plastique (6 cm de large, 1,5 cm de profondeur) de 0,5 à 0,8 cm avec 1,5 % agarose fondu.</li>
</ol>2. croissance de la plante
<ol><li>
Croissance d’Arabidopsis<ol>
<li>Semer les graines stérilisées sur plaques de MS et placer les plaques sous 4 ° C pendant deux jours. Déplacez-vous MS plaques pour une courte journée (8 h lumière / 16 h d’obscurité), à 22 ° C pendant deux semaines.</li>
		<li>Transplanter dans le sol, les semis et cultivez-les dans une journée courte (8 h lumière / 16 h d’obscurité) à 22 ° C pendant quatre semaines.</li>
		<li>Transférer les plantes de lumière continue, à 22 ° C pour induire le passage de la végétative à la phase de reproduction et d’imagerie de l’inflorescence SAMs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Croissance de tomate et de soja<ol>
<li>Incuber les graines recouvertes de papier filtre mouillé en dessous de 28 ° C jusqu'à ce qu’elles germent.</li>
		<li>Transplanter dans le sol, les semis et cultivez-les dans une longue journée (16 h lumière / obscurité de 8 h) à 25 ° C pendant une semaine ou plus pour l’imagerie des SAMs végétatives.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. dissection de l’apex caulinaire
<ol><li>Dissection de l’apex caulinaire inflorescence<ol>
<li>Couper l’apex inflorescence avec tige principale 1-2 cm de la plante Arabidopsis boulonnée avec une lame de rasoir. Tenez la partie basale de la tige principale et prélever des organes de fleur anciennes autant que possible de la tige principale en disséquant sur le pédoncule avec une pince de bijoux. Attention : Évitez les doigts coupe lorsque vous utilisez une lame de rasoir. Jeter les lames de rasoir usagées contenant un bon pour objets tranchants.</li>
		<li>Tenir la tige attachée de l’apex de la tige avec une pince de bijoux ou de doigts dans le domaine de la stéréomicroscope, continuer à retirer le reste des fleurs jusqu'à ce que presque l’ensemble SAM peut considérer des oculaires. Retirez les pédoncules clairement à la jonction de la tige principale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dissection de l’apex de la pousse végétative<ol>
<li>Pour afficher les SAMs végétatives de tomate ou de soja, disséquer les cotylédons, les feuilles et les racines des plantes.</li>
		<li>Tenez l’hypocotyle des plantes sous le stéréomicroscope et disséquer davantage sur les primordiums foliaires couvrant les SAMs végétatives à l’aide de pinces à bijoux.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. coloration
<ol><li>Pour visualiser directement les cellules dans Sam, utilisez fraîchement préparé propidium solution d’iodure (PI) pour colorer les parois cellulaires. Dissoudre la poudre dans l’eau désionisée stérile PI, faire la solution colorante 1mL PI à la concentration de 1 mg/mL et stocker la solution de PI en tubes de microcentrifuge recouvert de papier d’aluminium.</li>
	<li>Pipetter 50 µL de solution de PI dans un endroit propre et vide de Pétri et trempette toute disséqué shoot apex en colorant pendant 2 min. rincer l’apex colorés deux fois dans l’eau désionisée stérile. Pendant le processus de coloration, immergez l’inflorescence entière SAM ou SAM végétatif dans la solution de PI pour réaliser la coloration uniforme.</li>
</ol>5. collection d’images
Remarque : pour cette méthode, tous les Sam sont imagées à l’aide d’un microscope confocal vertical et avec un 20 x lentille de pendage vers l’eau. Comme décrit dans d’autres protocoles9,12,13,15, il est également possible de l’image à l’aide d’un microscope inversé de SAMs. En outre, l’imagerie direct est possible à l’aide de différentes marques de microscopes confocaux, avec les mêmes étapes de préparation d’échantillon. Dans cette étude, les étapes d’imagerie sont décrites en détail à titre d’exemple.
<ol><li>Percer un trou au centre d’un plat d’imagerie avec une pincette et coller l’apex caulinaire colorées dressées dans le milieu.</li>
	<li>Remplissez le plat d’imagerie d’eau déionisée stérile afin d’immerger complètement l’échantillon. Visualisation du microscope stéréo, pipette de haut en bas pour enlever les bulles d’air piégées autour du méristème. Ensuite, réglez l’angle de la tige dans la gélose pour s’assurer que le SAM est entièrement visible de directement au-dessus.</li>
	<li>Placez le plat d’imagerie sur la scène de l’échantillon du microscope confocal. Lentille d’eau à pendage et descendre la platine du microscope échantillon pour laisser l’extrémité de la lentille tremper dans l’eau.</li>
	<li>Ouvrez le logiciel de microscope confocal et recherchez le SAM dans le fond clair dans les oculaires. Déplacer la SAM échantillon droite au-dessous de l’objectif en ajustant le contrôleur XY, puis se concentrer sur la SAM d’oculaires en ajustant avec prudence le contrôleur Z.</li>
	<li>Activer la fonction de l’acquisition du logiciel de microscope confocal (voir Table des matières), démarrer le mode direct pour afficher l’exemple de l’écran d’ordinateur et configurer tous les paramètres de l’expérience de balayage au laser.<ol>
<li>Lors du réglage des paramètres, utilisez Gamme indicateur fonction pour définir si le signal est saturé ou non.</li>
		<li>Éventuellement, appliquez la fonction réutiliser pour recharger tous les paramètres depuis le fichier sélectionné confocal. NOTE : A suggéré d’imagerie paramètres : Laser ligne (excitation) : 515 nm ou 561 nm ; Émission 570-650 nm ; sténopé : 1 unité aérée (UA) ; Gain : 600-750, mode de numérisation : encadrer ; Taille d’image : 512 X 512 ou 1024 X 1024 ; vitesse de numérisation : du 7 au Max ; Direction de numérisation : bidirectionnelle ; Numéro de l’établissement d’une moyenne : 2-4 ; Avec une moyenne de méthode : moyenne ; Profondeur de couleur : 16 bits ; Intervalle de balayage : 0,5 à 1 µM. De plus, optimiser tous ces paramètres selon la nature des échantillons de plantes différentes et aux besoins spécifiques d’imagerie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. traitement de l’image
<ol><li>Pour visualiser les vues de coupe transversale et orthogonales optique, utilisez le même logiciel commercial pour l’acquisition d’imagerie. Ouvrez le fichier original confocal, cliquez sur le menu ortho, sélectionnez ortho. Puis sélectionnez soit la position x, z et y position position de l’image et enregistrer les images que les fichiers tiff.<ol>
<li>Éventuellement, sélectionnez distance 3D fonction pour définir la distance physique entre deux points qui ont été sélectionnés par la cheminée de l’images confocales.</li>
		<li>Vous pouvez également utiliser Fidji/Image J, le paquet de traitement image ressource ouverte pour visualiser les vues de la section transversale et orthogonales.</li>
		<li>Ouvrez le fichier confocal original avec les îles Fidji, cliquez sur le menu image, sélectionnez piles et puis sélectionnez vues orthogonales.</li>
		<li>Sélectionnez XY, YZet XZ avions en position médiane et enregistrez sous les images au format Tiff.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour visualiser une projection 3D transparente, utilisez le même logiciel.<ol>
<li>Ouvrez le fichier original confocal, cliquez sur le menu 3Det sélectionnez Transparent pour générer une vue de projection 3D.</li>
		<li>Éventuellement, cliquez sur menu 3D, sélectionnez apparenceet sélectionnez transparence pour ajuster les trois paramètres de la projection dont seuil, rampe et Maximum pour la transparence de la 3D image.</li>
		<li>Cliquez sur le menu 3D, sélectionnez apparence, puis lumière pour régler la luminosité de l’image 3D.</li>
		<li>Exporter les images projetées et les enregistrer comme des fichiers Tiff.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour visualiser une projection 3D d’intensité maximale, ouvrez les fichiers confocal avec le même logiciel et cliquez sur le menu 3D.<ol>
<li>Sélectionnez le menu 3D et maximale.</li>
		<li>Également utiliser J Fidji/Image pour visualiser une projection 3D d’intensité maximale.</li>
		<li>Ouvrez le fichier confocal original avec les îles Fidji, cliquez sur le menu de l’Image et sélectionnez piles.</li>
		<li>Sélectionnez le projet 3D et enregistrez sous les images au format Tiff.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour la visualisation de la profondeur de codage d’afficher des images 3D, utilisez le même logiciel.<ol>
<li>Cliquez sur le menu 3D , puis sélectionnez apparence.</li>
		<li>Sélectionnez spécial , puis sélectionnez la Profondeur de codage.</li>
		<li>Également utiliser J Fidji/Image pour visualiser la profondeur vue de codage.</li>
		<li>Ouvrez les fichiers confocale, cliquez sur le menu image, sélectionnez Hyperstack.</li>
		<li>Sélectionnez le code temporel-couleur et enregistrer en tant que des images au format Tiff. NOTE : La profondeur de codage z-pile aussi est possible via le plugin Z Code Stack pour Fidji.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour visualiser la 3D rotation vue tel qu’indiqué (film 1 et 2 de film), utiliser le même logiciel (voir la Table des matières).<ol>
<li>Ouvrir les fichiers confocale, cliquez sur le menu 3Det sélectionnez série.</li>
		<li>Sélectionnez rendu sérieet sélectionnez l’une des quatre options notamment tourner autour de x, y faire demi-tour, début et finet liste Position.</li>
		<li>Enregistrer la série de rendu que les fichiers AVI.</li>
		<li>Également utiliser J Fidji/Image pour visualiser la vue 3D rotation.</li>
		<li>Ouvrez le fichier confocal original avec les îles Fidji, cliquez sur le menu de l’Imageet sélectionnez Stacks.</li>
		<li>Sélectionnez le projet 3D et enregistrer des vidéos au format AVI.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+cell+division+patterns+in+developing+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic control of cell division patterns in developing plants.</a> Cell. 88 (3), 299-308 (1997).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cascade+of+arabinosyltransferases+controls+shoot+meristem+size+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato.</a> Nature Genetics. 47 (7), 784-792 (2015).</li>
<li>Bommert, P., Nagasawa, N. S., Jackson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+variation+in+maize+kernel+row+number+is+controlled+by+the+FASCIATED+EAR2+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative variation in maize kernel row number is controlled by the FASCIATED EAR2 locus.</a> Nature Genetics. 45 (3), 334-337 (2013).</li>
<li>Je, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+maize+organ+primordia+via+FASCIATED+EAR3+regulates+stem+cell+proliferation+and+yield+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Signaling from maize organ primordia via FASCIATED EAR3 regulates stem cell proliferation and yield traits.</a> Nature Genetics. 48 (7), 785-791 (2016).</li>
<li>Ping, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dt2+is+a+gain-of-function+MADS-domain+factor+gene+that+specifies+semideterminacy+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Dt2 is a gain-of-function MADS-domain factor gene that specifies semideterminacy in soybean.</a> Plant Cell. 26 (7), 2831-2842 (2014).</li>
<li>Vaughan, J. G., Jones, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+angiosperm+inflorescence+apex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the angiosperm inflorescence apex.</a> Nature. 171, 751(1953).</li>
<li>Sijacic, P., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+from+live-imaging+in+shoot+meristem+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel insights from live-imaging in shoot meristem development.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 52 (4), 393-399 (2010).</li>
<li>Tax, F. E., Durbak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meristems+in+the+movies%3A+live+imaging+as+a+tool+for+decoding+intercellular+signaling+in+shoot+apical+meristems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Meristems in the movies: live imaging as a tool for decoding intercellular signaling in shoot apical meristems.</a> Plant Cell. 18 (6), 1331(2006).</li>
<li>Grandjean, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+cell+division%2C+cell+growth%2C+and+differentiation+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).</li>
<li>Heisler, M. G., Ohno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-imaging+of+the+Arabidopsis+inflorescence+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem.</a> Methods in Molecular Biology. 1110, 431-440 (2014).</li>
<li>Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+lineage+analysis+to+study+cell+division+orientation+in+the+Arabidopsis+shoot+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-time lineage analysis to study cell division orientation in the Arabidopsis shoot meristem.</a> Methods in Molecular Biology. 1370, 147-167 (2016).</li>
<li>Prunet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+confocal+Imaging+of+developing+Arabidopsis+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live confocal Imaging of developing Arabidopsis flowers.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55156(2017).</li>
<li>Prunet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+confocal+imaging+of+Arabidopsis+flower+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds.</a> Developmental Biology. 419, 114-120 (2016).</li>
<li>Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+lineage+analysis+reveals+oriented+cell+divisions+associated+with+morphogenesis+at+the+shoot+apex+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131, 4225-4237 (2004).</li>
<li>Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Shoot+Meristems+on+an+Inverted+Confocal+Microscope+Using+an+Objective+Lens+Inverter+Attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 773(2017).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAIRY+MERISTEM+with+WUSCHEL+confines+CLAVATA3+expression+to+the+outer+apical+meristem+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HAIRY MERISTEM with WUSCHEL confines CLAVATA3 expression to the outer apical meristem layers.</a> Science. 361 (6401), 502-506 (2018).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+plant+stem+cell+function+by+conserved+interacting+transcriptional+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators.</a> Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).</li>
<li>Nimchuk, Z. L., Zhou, Y., Tarr, P. T., Peterson, B. A., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+stem+cell+maintenance+by+transcriptional+cross-regulation+of+related+receptor+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Plant stem cell maintenance by transcriptional cross-regulation of related receptor kinases.</a> Development. 142 (6), 1043(2015).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LEAFY+Controls+Auxin+Response+Pathways+in+Floral+Primordium+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">LEAFY Controls Auxin Response Pathways in Floral Primordium Formation.</a> Science Signaling. 6 (270), ra23(2013).</li>
<li>Truernit, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+whole-mount+imaging+of+three-dimensional+tissue+organization+and+gene+expression+enables+the+study+of+phloem+development+and+structure+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous décrivons ici une méthode d’imagerie simple qui peut être appliquée à l’étude des méristèmes apicaux de différentes plantes avec une modification mineure, ouvrant une nouvelle voie pour étudier la régulation de méristème à des stades végétatifs et reproducteurs de plantes modèles et cultures. Contrairement à la SEM et les méthodes de coloration histologiques, ce protocole peut aider à révéler la surface vue tant les structures cellulaires internes des SAMs, sans la nécessité d’une fixation de l’échantillon à forte m...

Le méristème de la plante contient un réservoir de cellules souches indifférenciées et maintient en permanence la croissance des organes végétaux et développement1. Pendant le développement post-embryonnaire, presque tous les tissus hors sol d’une plante sont dérivés de méristème apical (SAM). Dans les cultures, l’activité et la taille de la SAM et ses dérivées méristèmes floraux sont étroitement associées aux nombreuses caractéristiques agronomiques telles que shoot architecture, production de fruits et rendement en graines. Par exemple, chez la tomate, un SAM élargi entraîne une augmentation de la pousse et l’inflorescence ramification et donc des résultats dans la production d’appoint fleurs et fruits organes2. Chez le maïs, une augmentation de taille de SAM mène à un plus grand nombre de graines et le rendement total3,4. Chez le soja, l’indétermination de méristème est également étroitement associée à l’architecture de shoot et rendement5.
La morphologie et l’anatomie de SAMs peuvent être caractérisés par plusieurs méthodes différentes, y compris la coupe/coloration histologique et le scanning electron microscopy (SEM)6, qui ont grandement contribué à améliorer la recherche de méristème en fournissant la vue en coupe ou une vue de surface tridimensionnelle (3D) de SAMs. Toutefois, les deux méthodes prennent beaucoup de temps, impliquant plusieurs étapes expérimentales de la préparation de l’échantillon à l’acquisition de données, et ces méthodes dépendent principalement des échantillons fixes. Les progrès récents en microscopie confocale à balayage laser ont réussi à surmonter ces limitations et nous fournissent un outil puissant pour étudier la structure cellulaire et les processus de développement de l’usine tissus et organes7,8. Par optique plutôt que le tissu physique sectionnement, confocale microscopie permet la collecte d’une série d’images de z-pile et la reconstruction 3D subséquente de l’échantillon par le biais de logiciels d’analyse image.
Ici, nous décrivons une procédure efficace pour étudier à l’intérieur et des structures superficielles des vivants SAMs de différents plant des essences à l’aide de laser, microscopie confocale, qui potentiellement permet aux chercheurs d’accomplir tous les expérimentale processus au sein aussi court que 20 minutes. Différente des autres méthodes publiées pour l’imagerie confocale direct d’Arabidopsis inflorescence SAMs9,10,11,12,13,14, 15 et Arabidopsis fleurs12,13, nous démontrons que ce protocole est très efficace pour l’étude non seulement les méristèmes d’inflorescence de l’espèce modèle mais aussi de la pousse végétative méristèmes apicaux de différentes cultures, telles que la tomate et le soja. Cette méthode ne repose pas sur des marqueurs fluorescents transgéniques et peut potentiellement être appliquée afin d’étudier les méristèmes de beaucoup de différentes espèces et cultivars. En outre, nous présentons également l’étapes permettant d’afficher et d’analyser les différentes SAMs dans une vue 3D de traitement d’image simple. Pris ensemble, cette méthode simple facilitera les chercheurs à mieux comprendre la structure et le processus de développement des méristèmes d’organismes modèles et des récoltes.

<table><tbody><tr><td>Agar Phyto</td><td>Dot Scientific Inc.</td><td>DSA20300-1000</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Dot Scientific Inc.</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4955</td><td>Dumont #5SF Pince super fine Inox Pointe Taille .025 x .005mm, pour la dissection des apex des pousses.</td></tr><tr><td>LSM 880 Microscope confocal droit&nbsp ;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skoog MS moyen</td><td>Dot Scientific Inc.</td><td>DSM10200-50</td><td></td></tr><tr><td>Plan APO 20x/1.1 Lentille d’immersion dans l’eau</td><td>Zeiss Boîtes de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pétri en plastique 100 mm X 15 mm</td><td>CELLTREAT Scientific Products</td><td>229694</td><td>Utilisation comme fabrication de plaques MS</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri en plastique60 mm X 15</td><td>CELLTREAT Scientific Products</td><td>229665</td><td>Utilisation comme boîtes d’imagerie</td></tr><tr><td>Mélange de propagation</td><td>Sungro Horticulture</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iodure de propidium</td><td>Acros Organics</td><td>440300250</td><td>solution à 1 mg/mL dans l’eau, pour colorer les parois cellulaires</td></tr><tr><td>Lame de rasoir</td><td>PERSONNA</td><td>62-0179</td><td>Pour couper l’apex des pousses des plantes</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Tissue</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>Zen black</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Logiciel d’acquisition d’images</td></tr></tbody></table>

imagerie confocale direct des méristèmes apicaux de différentes espèces de plantes

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

Les fonctions de méristème apical (SAM) pousse comme un réservoir des cellules souches conservées et il génère presque tous les tissus hors sol pendant le développement post-embryonnaire. L’activité et la morphologie des SAMs déterminent des caractéristiques agronomiques importants, tels que l’architecture de shoot, taille et nombre d’organes reproducteurs et surtout, le rendement en grain. Ici, nous fournissons un protocole détaillé permettant d’analyser aussi bien la morphologie de la surface et la structure cellulaire interne du vivant SAMs provenant de différentes espèces par le biais de microscope confocal à balayage laser. Tout le processus depuis la préparation de l’échantillon à l’acquisition d’images de haute résolution en trois dimensions (3D) peut être accompli au sein aussi court que 20 minutes. Nous démontrons que ce protocole est très efficace pour l’étude non seulement l’inflorescence SAMs de l’espèce modèle, mais aussi les méristèmes végétatives de différentes cultures, fournissant un outil simple mais puissant pour étudier l’organisation et le développement de méristèmes dans différentes espèces de plantes.

Pour évaluer l’efficacité de notre protocole et d’étudier la morphologie des méristèmes de différentes espèces, nous avons effectué des expériences d’imagerie confocale direct sur le méristème de l’inflorescence de l’Arabidopsis et les méristèmes végétatives de tomate et soja. Dans cette étude, Arabidopsis écotype Landsberg erecta, cultivar de tomate Micro-Tom et le cultivar de soja Williams 82 ont été utilisés comme exemples.
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Ce protocole présente comment vivre image et analyser les méristèmes apicaux de différentes espèces de plantes à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser.

Imagerie confocale direct des méristèmes apicaux de différentes espèces de plantes

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Les mésentèmes apicals contrôlent la croissance et la reproduction des plantes. Cette méthode nous aide à étudier la morphologie et les structures internes des meristems apiques de pousse non seulement dans les espèces modèles, mais aussi dans différentes cultures. Cette technique est une procédure très efficace.Le meristem apical de pousse peut être directement visualisé dans une résolution cellulaire élevée sans n’importe quelle fixation d’échantillon laborieux et étapes de sectionnement de tissu. Pour commencer, cultivez des arabidopsis, des tomates et des plants de soja, comme le détaille le protocole du texte. Coupez l’apex de pousse d’inflorescence des usines boulonnées d’Arabidopsis.Tenez la partie basale de la tige principale et utilisez des forceps pour enlever autant d’organes floraux plus anciens que possible de la tige principale. Continuez à enlever le reste des fleurs dans le champ du microscope stéréo jusqu’à ce que le meristem apical de pousse puisse être vu des oculaires. Pour voir les meristems apical de pousse végétative de tomate ou de soja, disséquez les cotyléons, les feuilles, et les racines de la plante.Maintenez les hypocotyles de la plante sous le microscope stéréo, et utilisez des forceps pour disséquer davantage les feuilles et les primordies foliiques couvrant les mésentèmes apiques de pousse végétative. Pipette 50 microlitres de solution d’iodure de propidium dans une boîte de Pétri propre et vide. Tremper l’ensemble de l’apex de pousse disséqué dans le colorant pendant deux minutes.Pendant le processus de coloration, immerger l’ensemble de l’inflorescence tirer meristem apical ou végétatif pousse meristem apical dans la solution iodure propidium pour atteindre la coloration uniforme. Rincer le sommet de la pousse tachée deux fois dans de l’eau stérile et déionisée. Maintenant, percer un trou au centre d’un plat d’imagerie préparé à l’aide de forceps, et coller la pousse tachée apex droit dans le milieu.Remplissez le plat d’imagerie d’eau stérile et déionisée pour immerger complètement l’échantillon. Visualisez l’échantillon au microscope stéréo. Pipette de haut en bas pour enlever les bulles d’air emprisonnées autour du meristem.Ensuite, ajustez l’angle de la tige dans l’agar pour vous assurer que le meristem apical de pousse est entièrement visible d’en haut. Maintenant, placez le plat d’imagerie sur l’étape de l’échantillon du microscope confocal. Abaissez la lentille qui plonge l’eau et soulevez le stade de l’échantillon du microscope pour laisser la pointe de la lentille plonger dans l’eau.Ouvrez le logiciel de microscope confocal, et utilisez les oculaires pour localiser et se concentrer sur le meristem apique de pousse dans le champ lumineux. Exploitez la fonction Acquisition dans le logiciel de microscope confocal. Démarrez le mode live pour afficher l’échantillon à partir de l’écran de l’ordinateur, et configurez tous les paramètres de l’expérience de balayage laser.Lors de l’ajustement des paramètres, utilisez la fonction Indicateur de plage pour définir si le signal est saturé ou non. Le même logiciel qui a été utilisé pour l’acquisition d’imagerie peut être utilisé pour visualiser une projection transparente tridimensionnelle. Ouvrez le fichier confocal d’origine, cliquez sur le menu 3D et sélectionnez Transparent pour générer une vue de projection 3D.En option, sélectionnez Transparence pour ajuster trois paramètres de la projection, y compris Threshold, Ramp et Maximum pour la transparence de l’image 3D. Maintenant, sélectionnez Lumière pour ajuster la luminosité de l’image 3D. Exportez les images projetées et enregistrez-les sous forme de fichiers TIFF.Pour visualiser la vue de codage en profondeur des images 3D, utilisez le même logiciel. Encore une fois, cliquez sur le menu 3D et sélectionnez Apparence. Sélectionnez Spécial et sélectionnez Codage de profondeur.Exportez les images projetées et enregistrez-les sous forme de fichiers TIFF. Cette image de la section orthogonale au milieu de l’Arabidopsis tirer meristem apical montre que les murs horizontaux sont tachés d’iodure de propidium dans presque toutes les cellules à plusieurs couches cellulaires. Une vue d’une section transversale à travers le corpus de l’inflorescence tirer meristem apical montre que les cellules du plan XY sont également clairement image.La vue de projection 3D révèle que le meristem d’inflorescence forme une structure en forme de dôme et est entouré par la primordia de fleur en développement. Cette image de la section orthogonale au milieu du meristem apique de pousse de tomate montre également que les murs horizontaux sont souillés avec l’iodure de propidium à plusieurs couches cellulaires, bien que le signal d’iodure de propidium de la région intérieure profonde soit légèrement inférieur. Une image d’une section transversale à travers les couches profondes du meristem apical de pousse végétative révèle les cellules des plans XY et la frontière formée entre le meristem végétatif et la primordia de feuille.La vue de projection 3D peut en outre fournir une vue complète de la forme et de l’organisation du meristem végétatif de la tomate. Montré ici est une vue orthogonale à travers le milieu de la pousse de soja meristem apical et une projection 3D de la même pousse meristem apical. Le meristem végétatif en forme de dôme et sa nouvelle primordia de feuilles dérivées sont également observables.L’iodure de propidium peut facilement tacher les cellules endommagées ou mortes, ce qui influencera considérablement la qualité des images, il est donc important d’éviter tout dommage physique lors de la préparation de tirer des échantillons de mésoïsme apical.

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