Nouveau protocole pour la génération de cellules dendritiques immunogéniques physiologiques

Les cellules physiologiques présentant des antigènes dendritiques, appelés PhDC, sont les commutateurs immunitaires qui initient l’immunité et la tolérance des cellules T spécifiques aux antigènes. Cet article délimite une méthode efficace pour la production de PhDC. L’utilisation clinique des cellules dendritiques est entravée par les méthodes de cytokine non physiologiques utilisées pour les produire.

Notre méthode surmonte ce problème grâce à une signalisation plaquettquettique efficace de la conversion monocyte-à-DC chez l’homme et la souris. Ces PhDC ne dépendent pas des conditions de cytokine indisponibles in vivo, ainsi elles peuvent générer des réponses cliniques puissantes de cellule T d’antitumoral chez les humains et les souris avec les cancers établis. L’initiation de plaquettes indépendantes des espèces de la maturation monocyte-à-PhDC a une grande applicabilité expérimentale.

PhDC permet la dissection de la physiologie cellulaire dendritique, facilite l’induction de l’immunité thérapeutique anticancéreuse aux cancers immunogènes, et offre la promesse pour la vaccination antimicrobienne personnalisée. Ce système expérimental est nouveau, et de multiples aspects de celui-ci tels que le revêtement de la chambre en plastique, le traitement des cellules tumorales avec 8-MOP / UVA, les conditions d’écoulement, et la libération de monocytes sont mieux représentés visuellement. Eve Robinson, technicienne de mon laboratoire, démontrera la procédure.

Pour recueillir les cellules mononucléaires périphériques de sang, installez d’abord un tube de 15 millilitres avec quatre millilitres de milieu d’isolement de lymphocyte par cinq à 10 souris saignées. Puis couchez lentement le sang prélevé sur des souris tumorales sur le dessus du milieu. Faites tourner les cellules à 1000 à 1500 fois G pendant 20 minutes pour séparer les PBMCs des globules rouges.

À la fin de la centrifugation, recueillir la couche plasmatique supérieure, laissant 0,5 millilitres restant au-dessus de la couche buffy, et stocker à quatre degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Ensuite, recueillir la couche de pelage buffy dans un tube propre de 15 millilitres rempli de PBS à 15 millilitres, et tourner à 250 fois-G dans une centrifugeuse standard de culture tissulaire pendant 10 minutes pour recueillir le PBMC. À la fin de la centrifugation, retirer soigneusement le supernatant et faire glisser le tube pour résuspendre la pastille.

Ajouter ensuite deux millilitres de tampon de lyse de globule rouge ACK au tube pour éliminer les globules rouges restants du PBMC. Incuber le PBMC sur la glace pendant 10 minutes. Remplissez le tube de PBS à 15 millilitres, et tournez vers le bas à 250 fois-G dans une centrifugeuse standard de culture tissulaire pendant 10 minutes pour recueillir le PBMC.

Retirer délicatement le supernatant et faire glisser le tube pour desserrer la pastille. Resuspendez la pastille en 300 microlitres de FBS. Pour préparer yumm1.7 cellules de tumeur par groupe de traitement, dépensez d’abord la pastille de cellules de tumeur dans FBS à 2.5 millions de cellules par 300 microlitres.

Avec les lumières de capot de culture de tissu éteintes, ajoutez 8-methoxypsoralen pour une concentration finale de 100 nanogrammes par millilitre à la suspension de cellules de tumeur de YUMM1.7. Ensuite, mélangez les cellules, enveloppez le récipient cellulaire dans du papier d’aluminium et incubez à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Pour pré-enrober une plaque de culture tissulaire de 12 puits, ajouter un millilitre de FBS à un puits pour chaque groupe de traitement de cinq souris, et réfrigérer l’assiette à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.

Après 20 minutes, sous un capot de culture tissulaire, retirer FBS des puits, et ajouter 300 microlitres de cellules tumorales exposées au méthoxypsoralène par puits. Exposez ensuite la plaque contenant des cellules à l’ultraviolet préchauffé Une source de lumière pour une irradiation totale de quatre joules par centimètre carré. Pour recueillir les cellules tumorales traitées à 8 méthoxypsoralen/UVA de chaque puits, faites pivoter soigneusement la plaque et la pipette pour assurer une récupération complète des cellules.

Pour effectuer le passage de plaque de transimmunisation pour chaque groupe de traitement de cinq souris, combinez 300 microlitres du PBMC approprié et 300 microlitres des cellules tumorales 8-methoxypsoralen/UVA-traitées dans un tube conique de 1,5 millilitre et mélangez les cellules. Ensuite, ouvrez les pinces de tubes d’entrée et de sortie de la plaque TI. Utilisez une seringue de 10 millilitres pour remplir le tube TI avec FBS, fermant les pinces pendant que le tube est rempli pour retenir FBS à l’intérieur du tube.

Déconnectez la seringue. Placez une pointe de pipette P1000 solidement dans la prise de plaque TI. Tenez la plaque à un angle de 45 degrés et remplissez la plaque lentement avec PBMC et mélange de cellules tumorales, en évitant les bulles.

Retirez la pointe pipette de l’admission avant de libérer le piston pipette. Retourner les cellules restantes dans le tube conique de 1,5 millilitre. Incubez le tube rempli de FBS, la plaque TI remplie de cellules et le tube conique de 1,5 millilitre contenant les cellules restantes dans l’incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Après l’incubation, relâchez les pinces et videz le tube TI par gravité. Puis insérez une pointe de pipette P1000 avec le piston déprimé dans le port de plaque pour enlever les cellules de la plaque TI. Tenez la plaque à un angle de 45 degrés et remplissez la pointe de pipette P1000.

Remettre les cellules dans leur tube conique original de 1,5 millilitre. Pour faire fonctionner la plaque TI, connectez le tube de sortie à la plaque et fixez la plaque TI dans le système de fonctionnement des plaques. Ensuite, à l’aide d’une seringue d’un millilitre, dessinez ces 600 microlitres de PBMC et le mélange de cellules tumorales à partir du tube conique de 1,5 millilitre.

Fixez la seringue au tube d’entrée avec la pince ouverte, et remplissez lentement jusqu’à ce que le liquide atteigne l’extrémité du tube. Fixez l’extrémité libre du tube d’entrée à la plaque TI et continuez à charger doucement le volume restant. Fermez la pince d’entrée une fois terminée.

Détachez la seringue d’un millilitre et connectez le tube d’entrée à la pompe à seringues. Fixez le tube de sortie sur un tube conique propre de 1,5 millilitre pour la collecte cellulaire. Réglez le débit de la pompe à seringues à 0,09 millilitres par minute.

Inclinez la plaque TI à environ 30 degrés vers le côté de la pompe à seringues à l’aide d’une plate-forme de course de plaque TI. Relâchez soigneusement la pince sur le tube d’entrée. Démarrez la pompe à seringues, en observant attentivement comment la plaque TI se remplit.

Une fois que la plaque TI est complètement remplie, inclinez-la d’environ 30 degrés dans la direction opposée au fur et à mesure qu’elle se vide. Lorsque toutes les cellules du liquide se trouvent dans le tube de collecte conique de 1,5 millilitre, arrêtez la pompe. Pour laver la plaque TI, déconnectez le tube d’entrée de la pompe à seringues et connectez-le à une seringue d’un millilitre remplie de 600 microlitres de FBS.

Remplir jusqu’à ce que FBS soit complètement chargé. Déconnectez ensuite la seringue et fixez le tube à la pompe à seringues. Réglez le débit de la pompe à seringues à 0,49 millilitres par minute.

Relâchez la pince d’entrée et exécutez la plaque TI, en recueillant le lavage dans le même tube conique de 1,5 millilitre. Feuilletez ou appuyez doucement sur la plaque TI pendant tout le temps pour aider à détacher et à élucider les cellules adhérentes au fur et à mesure que la plaque se vide. Déconnectez le tube conique de 1,5 millilitre de la configuration de la plaque TI.

Faire tourner le tube de collecte dans le microfuge benchtop à 250 fois-G pendant huit minutes et jeter le surnatant. Pour effectuer la co-incubation du jour au lendemain de PBMC avec l’antigène, résuspendez d’abord le PBMC et la pastille de cellules de tumeur dans deux millilitres de RPMI clair complété avec le sérum autologue de souris de 15%. Puis plaquez les cellules dans un plat stérile traité non tissulaire de 35 millimètres et incubez pendant la nuit dans des conditions standard de culture tissulaire.

Le lendemain, détachez soigneusement les cellules adhérentes du fond du plat à l’aide d’un grattoir de culture tissulaire. Faire pivoter le plat tout en grattant pour assurer une collecte cellulaire même. Recueillir les cellules dans un tube de 15 millilitres.

Ajouter deux millilitres de PBS au plat, et répéter l’étape de grattage, la collecte des cellules dans le même tube. Rincer le plat de 35 millimètres avec un millilitre de PBS et ajouter le rinçage au même tube. Tournez à 250 fois-G dans une centrifugeuse standard de culture tissulaire pendant 10 minutes pour recueillir les cellules.

Retirer délicatement le supernatant, puis feuilleter le tube pour réutiliser la pastille. La thérapie a montré la réduction de la croissance de tumeur de YUMM1.7 dans plus de 100 souris traitées contre témoins, comme observé dans les données cumulatives de croissance de tumeur de neuf expériences indépendantes menées sur deux ans. Les courbes représentatives de croissance tumorale pour les animaux individuels au sein d’une expérience fournissent un sentiment de variabilité dans le système.

Lorsque les monocytes ou les plaquettes sont épuisés de la fraction PBMC, ou lorsque le passage de la plaque est omis, l’effet thérapeutique n’est plus observé. Le traitement est inefficace en l’absence des cellules immunitaires ou d’une source d’antigène, ou en présence d’un antigène dépareillé, tel que les tumeurs YUMM1.7 traitées utilisant des cellules mc38 de carcinome de deux points. Pour un résultat immunisant, il est également essentiel d’éviter l’exposition de PBMC au 8-methoxypsoralen.

L’analyse facs du changement des marqueurs indiqués des contrôles IgG correspondants dans les cellules humaines CD11c+, soit parmi les PBMC fraîchement isolés, le PBMC traité par TI, le PBMC traité par TI sans passage de plaque, les plaquettes épuisées avant le passage de la plaque, ou les deux ci-dessus, a montré que l’activation du DC dépend de la présence de plaquettes dans le PBMC et du passage de la plaque TI. Les CD humains activés par TI peuvent traiter et inter-présenter efficacement des antigènes peptidiques, ou des antigènes de cellules tumorales humaines entières exposées à 8 méthoxypsoralène pour activer les lignées de cellules T spécifiques aux antigènes humains dans des analyses in vitro d’une manière dépendante du TI et du plaquette. La spécificité des réponses des cellules T dépend de la source des antigènes traités.

Lors de l’induction de l’immunité anticancéreuse, l’apoptose de chaque lignée de cellules cancéreuses doit être titrée pour maximiser l’immunogénicité. Puisque l’immunité induite sera spécifique aux antigènes immunisants, la dissection détaillée de chaque système sera possible. Chaque cancer expérimental ou clinique, et chaque réponse antimicrobienne, sera particulièrement instructif.

Chaque cancer humain a sa propre gamme d’antigènes spécifiques à la tumeur. Le PhDC effectue le tri et la présentation nécessaires des antigènes tumoraux, sans nécessiter leur identification préalable en laboratoire. S’il vous plaît garder à l’esprit que la lumière 8-MOP et UVA sont cancérigènes.

Utilisez l’équipement de protection approprié et suivez les procédures de sécurité lors de la manipulation 8-MOP et lorsque vous travaillez avec des sources de lumière UVA.