Isolement des fibroblastes papillaires et réticulaires de la peau humaine par tri cellulaire activé par fluorescence

Ce protocole facilite l’isolement des sous-ensembles fibroblastes fonctionnellement distincts de la peau humaine par le tri fac basé sur l’expression du marqueur de surface cellulaire. Pour la première fois, les fibroblastes papillaires et réticulaires peuvent être isolés directement de la peau sans manipulation in vitro. Il s’agit d’un énorme progrès par rapport aux méthodes d’isolement précédemment établies en utilisant des cultures d’explantation.

Les sous-ensembles de fibroblaste cutatéal abritent des fonctions distinctes dans des conditions homéostatiques. Avec cet outil, il est possible d’étudier les différences fonctionnelles dans les pathologies cutanées, y compris le cancer ou les maladies inflammatoires de la peau. Puisque la manipulation du tissu humain exige une certaine pratique pour atteindre des rendements cellulaires satisfaisants, nous aimerions fournir une démonstration visuelle pour faciliter et accélérer ce processus.

Pour préparer le derme de pleine épaisseur, placez un morceau de peau humaine sur un papier filtre épais avec l’épiderme orienté vers le bas. Tenez l’épiderme fermement avec des forceps, et grattez la couche de graisse sous-cutanée avec un scalpel. Ensuite, couper le tissu en lanières de cinq millimètres de large avant de les mettre dans une boîte de Pétri.

Pour sectionner le derme en couches papillaires et réticulaires, placez un morceau de peau sur un papier filtre épais avec l’épiderme orienté vers le haut. Tenez la peau fermement sur ses bords avec des forceps, et découpez une section de 300 micromètres d’épaisseur avec un dermamatome électrique. Transférer la première couche composée d’épiderme et de derme papillaire dans une boîte de Pétri.

Ensuite, procéder immédiatement à séparer l’épiderme et le derme, ou ajouter 1x PBS pour empêcher le tissu de sécher. Ensuite, réglez le dermamatome à une épaisseur de coupe de 700 micromètres, et tranchez le derme restant. Placer la tranche supérieure, qui est définie comme le derme réticulaire supérieur, dans une boîte de Pétri séparée.

Par la suite, raclez la couche de graisse sous-cutanée avec un scalpel de la couche cutanée réticulaire inférieure résiduelle, et jetez-la. Recueillir le derme réticulaire inférieur dans une autre boîte de Petri. Procédez immédiatement à la procédure de digestion enzymatique, ou ajoutez 1x PBS pour empêcher le tissu de sécher dehors.

Pour effectuer la digestion enzymatique, placez les lanières de peau de cinq millimètres ou le derme épiderme/papillaire avec l’épiderme orienté vers le haut dans une boîte de Petri avec 10 millilitres de la solution enzymatique dissociante. Ensuite, incubez la boîte de Pétri à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après l’incubation, transférer l’épiderme/derme papillaire sur le couvercle de la boîte de Pétri.

Séparez l’épiderme du derme supérieur avec deux forceps, chacun tenant le bord du derme. Par la suite, hacher chaque couche cutanée aussi soigneusement que possible. Plus les morceaux sont petits, meilleure est la digestion des tissus.

Ensuite, préparer le mélange de digestion. Transférer le tissu haché avec 10 millimètres du mélange de digestion préparé dans un tube de 50 millimètres. Incuber le tissu à 37 degrés Celsius pendant une heure sous agitation.

Inverser le tube plusieurs fois pendant la digestion. Pour préparer une suspension à cellule unique, arrêtez la digestion des tissus enzymatiques en ajoutant 10 millilitres de milieu fibroblaste au tissu digéré sur la glace. Ensuite, versez le contenu de chaque tube à travers une passoire de thé inoxydable stérile régulière, et de recueillir la suspension cellulaire dans une boîte de Pétri propre.

Lavez la passoire avec du milieu et écrasez les morceaux de tissu non digérés avec le bord d’un piston à seringues. Ensuite, pipette la suspension cellulaire collectée à travers une passoire à cellules de 70 micromètres dans un tube de 50 millilitres. Rincer la passoire cellulaire à l’aide d’un milieu et recueillir le débit à travers le même tube.

Ensuite, centrifugez le tube à 500 fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirez le supernatant et lavez la pastille cellulaire avec cinq millilitres de milieu fibreux. Répétez l’étape de centrifugation.

Par la suite, retirez le supernatant et resuspendez la pastille dans un millilitre de tampon de lyse érythrocyte ACK. Laissez les cellules dans le tampon de lyse pendant environ une minute à température ambiante. Ensuite, arrêtez la lyse en ajoutant neuf millilitres de 1x PBS avec 10%FCS.

Centrifugez le tube à nouveau à 500 fois g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes, et jetez le supernatant par la suite. Une fois que les cellules ont été tachées pour le tri d’AEC suivant des protocoles standard, triez trois sous-populations de fibroblaste dans des tubes distincts de microcentrifugeuse remplis avec 350 microlitres de tampon de lyse pour l’isolement d’ARN ou 350 microlitres du milieu de croissance de fibroblaste pour la culture cellulaire. Inverser immédiatement les tubes et mettre les tubes tampons de lyse dans de l’azote liquide, soit mettre les tubes moyens de croissance fibroblaste sur la glace.

Après le FACS, faites tourner les cellules à 500 fois g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, plaquez une quantité égale de cellules dans le milieu de croissance de fibroblaste dans un plat de culture cellulaire de 24 puits, et laissez-les se développer jusqu’à ce qu’elles atteignent 70% de confluence. Ensuite, remplacez le milieu cellulaire cultivé par un milieu de différenciation des adipocytes, et laissez les cellules se différencier pendant 14 jours.

Au jour de différenciation 14, fixer les cellules avec 4%PFA pendant 20 minutes. Lavez les puits avec 60% d’isopropanol, et laissez-le s’évaporer complètement. Ensuite, tacher les cellules avec cinq millimolaires d’huile filtrée Red O pendant 20 minutes.

Après 20 minutes, laver les cellules tachées quatre fois avec de l’eau distillée. Image les cellules immergées dans l’eau avec un microscope inversé à 10x grossissement avec la lumière transmise. Ce protocole permet l’identification de trois populations de fibroblastes dans la peau humaine, qui se présente avec différentes localisations intradermiques, profils d’expression génétique, et les fonctions.

Fap-positif CD90-négatif sont enrichis dans le derme papillaire, tandis que FAP-positif CD90-positif et FAP-négatif CD90-positif sont plus abondants dans le derme réticulaire. Les trois sous-populations triées affichent une morphologie fibroblastique typique sur la culture pendant sept jours. Fait intéressant, ils se comportent différemment dans un essai d’adipogenèse.

Après 14 jours dans la culture, FAP-positif CD90-négatif ne se différencient pas en adipocytes, alors que FAP-positif CD90-positif et FAP-négatif CD90-positif subissent facilement l’adipogenesis. Le profilage d’expression génique montre que les cellules CD90 négatives positives par FAP expriment des niveaux élevés de marqueurs communément attribués aux fibroblastes papillaires, tels que le CD26, le NTN et le PDPN, tandis que les cellules CD90 positives expriment les marqueurs réticulaires connus, tels que le CD36, l’actine musculaire lisse et le PPAR-gamma à des niveaux élevés. Nous concluons que les cellules CD90-négatives FAP-positives appartiennent aux cellules papillaires et CD90-positives appartiennent à la lignée réticulaire.

La digestion fonctionne mieux si les morceaux dermiques sont soigneusement hachés et incubés dans une quantité suffisante de milieu de digestion. Les sous-ensembles de fibroblaste cutatéal sont fonctionnellement divers. L’exploration de leur fonction dans le contexte de la pathogénie de la maladie ouvrira la voie à de nouvelles interventions diagnostiques et thérapeutiques.