Name: Analyse des analogues de lacide iophénoxique chez la petite mangouste indienne (Herpestes Auropunctatus) Sera pour utilisation comme marqueur biologique de vaccination contre la rage buccale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Découvrez une méthode LC-MS/MS pour détecter l'acide iophénoxique dans le sérum de mangouste Herpestes auropunctatus. Cette technique simple de précipitation protéique permet une quantification sensible au niveau des parties par milliard.

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Cette recherche a été soutenue en partie par le programme de recherche intra-muros du Us Department of Agriculture, Animal and Plant Health Inspection Service, Wildlife Services, National Rabies Management Program et IDT Biologika (Dessau-Rosslau, Allemagne).

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux du Centre national de recherche sur la faune de l'USDA dans le cadre du protocole de recherche approuvé QA-2597.
REMARQUE : Le protocole suivant décrit la procédure d'analyse pour détecter l'acide méthyl-iophénoxique dans le sérum de mangouste. Cette méthode est la version finale d'un processus itératif qui a commencé par l'analyse de l'acide éthylo-iophenoxique dans le sérum de mangouste. Au cours de l'évaluation initiale des modifications mineures d'acide éthylo-iophénoxique ont été faites aux méthodes, ayant pour résultat le protocole final présenté ci-dessous. Les résultats représentatifs comprennent ceux obtenus au cours des deux itérations.
1. Préparation de solutions et de normes
<ol><li>Achetez-moi-IPA et-IPA.</li>
	<li>Pour la phase A mobile, préparer 1 L de 0,1 % (v/v) d'acide formique dans l'eau en combinant 1 ml d'acide formique avec 1 L d'eau ultrapure (18 M'). Pour la phase B mobile, préparer 1 L de 0,1% (v/v) d'acide formique dans l'acétonitrile (ACN) en combinant 1 ml d'acide formique avec 1 L d'ACN.</li>
	<li>Pour le diluant, préparer 200 mL de 0,5 % (v/v) acide trifluroacétique (AGT) en ACN en combinant 1 ml de TFA avec 200 mL d'ACN.</li>
	<li>Préparer des solutions de stock IPA concentrées de me-IPA et et-IPA dans ACN à des concentrations d'environ 1 000 g/mL.<ol>
<li>Peser environ 10 mg de moi-IPA sur un microéquilibre et enregistrer la masse à 0,0001 mg. Transférer quantitativement le me-IPA à un flacon volumétrique de classe A de 10 mL à l'aide de 45 mL ACN. Sonicate 1 min pour dissoudre tous les solides, puis apporter au volume avec ACN.</li>
		<li>Transférer 8 ml de chaque bouillon dans des flacons de verre ambre de 8 ml avec des bouchons doublés de polytétrafluoroéthylène (PTFE). Conserver à température ambiante (RT). Transférer le reste du stock dans les déchets dangereux.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour le stock 25x-7 me-IPA (tableau 1), préparer un stock de me-IPA dans ACN à environ 200 'g/mL. Exemple : Transférer 1 mL du stock concentré me-IPA de l'étape 1.4.2 à un flacon volumétrique de classe A de 5 mL à l'aide d'une seringue en verre de 1 000 l. Diluer au volume avec ACN. Transférer le bouillon dans une fiole de verre ambre de 8 ml avec un bouchon doublé PTFE. Magasin à RT.</li>
	<li>Préparer les six actions 25x me-IPA supplémentaires décrites dans le tableau 1. Pour chaque bouillon, combiner les volumes indiqués à l'aide d'un pipettor à répétition dans un flacon de verre ambre de 8 ml avec un bouchon doublé PTFE. Stockez chaque stock chez RT.</li>
	<li>Pour le stock de substitution 25x, préparer un stock de substitution de me-IPA dans ACN à environ 10 g/mL à partir du stock concentré préparé à l'étape 1.4.2. Transférer 0,100 ml du stock concentré de me-IPA dans un flacon volumétrique de classe A de 10 ml à l'aide d'une seringue en verre de 100 l, puis diluer en volume avec ACN.<ol>
<li>Transférer 8 ml dans un flacon de verre ambre de 8 ml avec bouchon doublé PTFE. Entreposer à RT. Transférer le reste du stock aux déchets dangereux.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer des stocks de 4x contenant les deux analytes dans des flacons d'autosampler en verre à vis de 2 ml tels que décrits dans le tableau 2.<ol>
<li>Par exemple, pour préparer le stock 4x-7, à un flacon de 2 ml, ajouter 0,20 mL du stock 25x-7 me-IPA à partir de l'étape 1.5 à l'aide d'un tuyautteur de répétition avec pointe de capacité de 0,5 mL. Ajouter 0,20 ml du stock de substitution et ipA 25x à partir de l'étape 1.7 à l'aide d'un pipettor à répétition avec une pointe de capacité de 0,5 ml.</li>
		<li>Ajouter 0,85 ml d'ACN à l'aide d'un pipettor à répétition avec une pointe de capacité de 1 ml. Capuchon le flacon en toute sécurité et inverser 5x à mélanger.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer la courbe standard dans des flacons d'autosampler à vis de 2 ml tels que décrits dans le tableau 3.<ol>
<li>Par exemple, pour préparer la norme 7 (Std 7), à un flacon de 2 ml, ajouter 0,20 ml du stock 4x-7 à partir de l'étape 1.8.2 à l'aide d'un tuyautteur de répétition avec une pointe de capacité de 0,5 ml. Ajouter 0,60 ml d'eau DI ultrapure à l'aide d'un pipettor à répétition avec une pointe de capacité de 1 ml. Capuchon le flacon en toute sécurité et inverser 5x à mélanger.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Préparation de l'échantillon
CAUTION : Le personnel qui effectue cette procédure doit avoir reçu toute la série de prophylaxie pré-exposition de la rage et avoir un dispositif d'anticorps antirabique documenté au-dessus de 0,5 UI d'un établissement médical désigné de la santé au travail fédérale. Le personnel doit porter des blouses de laboratoire et une protection oculaire en tout temps pendant l'extraction. CAUTION : Effectuez les étapes 2,3 à 2,6 dans un coffret de biosécurité de classe II.
<ol><li>Pour chaque échantillon, préparer un tube microcentrifuge de 1,5 ml contenant 200 à 300 mg de NaCl.Arrangez les tubes dans un support en plastique de 80 positions. Réserver pour une utilisation à l'étape 2.6. REMARQUE : Une micro-pelle (ou un autre petit appareil de mesure) est recommandée pour un grand nombre d'échantillons.</li>
	<li>Pour chaque échantillon, étiquetez deux tubes microcentrifuges de 1,5 ml : l'un comme « A » et l'autre comme « B ». Disposer les tubes dans un support en plastique de 80 positions.</li>
	<li>Placez les matériaux et l'équipement suivants nécessaires à l'extraction du sérum dans un coffret de biosécurité de classe II : tubes de microcentrifuge (en racks) préparés en étapes 2.1 et 2.2, mélangeur de vortex, tuyautre de répétition avec des pointes de capacité de 0,5 ml et 5 ml, déplacement d'air de 100 à 1 000 l pipette avec 1 000 pointes de L, conteneurs d'environ 100 ml chacun d'eau DI diluante et ultrapure, et un contenant de déchets biorisques.</li>
	<li>Retirer les échantillons de sérum de l'entreposage congelé et réchauffer à RT dans l'armoire de biosécurité. Vortex mélange chaque échantillon de sérum avant l'échantillonnage.</li>
	<li>À l'aide d'un pipettor répétitif avec une pointe de capacité de 0,5 ml, distribuer 0,050 ml de sérum de mangouste dans le tube "A" et ajouter 0,050 ml de stock de substitution 25x. Ajouter ensuite 0,950 ml de diluant au tube "A" à l'aide d'un pipettor à répétition avec une pointe de capacité de 5 ml. Capuchon solidement et mélange de vortex pour 10 à 15 s.</li>
	<li>Distribuez le NaCl pré-pesé de l'étape 2.1 dans le tube "A" et le mélange de vortex 3x pour 8-12 s. Essuyez les surfaces extérieures du support de flacon contenant le tube "A" en utilisant 70% (v/v) isopropanol. REMARQUE : Le support d'échantillons peut maintenant être retiré de l'armoire de biosécurité de classe II.</li>
	<li>Tube centrifugeur "A" à 12 000 x g pendant 1 min pour séparer les phases aqueuse et ACN. Pipette 0,80 ml de la phase supérieure de l'ACN pour tube " B " à l'aide d'une pipette de déplacement d'air de 100 à 1 000 l. Transférer la solution restante dans le tube "A" aux déchets dangereux et jeter le tube vide dans un conteneur de déchets biodangereux.</li>
	<li>Retirez l'ACN et le TFA du tube B avec un flux doux de gaz N2 dans un bain d'eau de 45 oC.</li>
	<li>Ajouter 0,250 ml d'ACN au tube « B » à l'aide d'un pipettor à répétition, d'un mélange de vortex pendant 4 à 5 s, puis une centrifugeuse brièvement (2 à 4 s) à 12 000 x g pour recueillir le liquide au fond du tube.</li>
	<li>Ajouter 0,750 ml d'eau DI ultrapure au tube " B " à l'aide d'un pipettor à répétition avec une pointe de capacité de 5 ml, mélange de vortex pour 4 à 5 s, puis centrifugeuse pendant 1 min à 12 000 x g pour clarifier l'échantillon.</li>
	<li>Transférer 0,75 ml du supernatant sur un flacon d'autosampler à l'aide d'une pipette de déplacement d'air de 1 000 l. Jeter les pointes de pipette dans le récipient de déchets de biorisque.</li>
	<li>Cap autosampler flacons en toute sécurité et d'analyse par LC-MS/ MS (section 4). Transférer la solution restante dans le tube « B » aux déchets dangereux et jeter le tube vide dans un contenant de déchets biodangereux. Éliminer tous les déchets biodangereux par autoclacage ou incinération.</li>
</ol>3. Échantillons de contrôle de la qualité
CAUTION : Suivez les mises en garde décrites à la section 2.
REMARQUE : La procédure suivante décrit le nombre minimal d'échantillons de contrôle de la qualité (QC) requis pour une analyse. Des répliques à chaque niveau sont recommandées si un sérum de mangouste témoin suffisant est disponible.
<ol><li>Préparer quatre tubes microcentrifuges de 1,5 ml contenant 200 à 300 mg de NaCl. Disposer les tubes dans un support en plastique de 80 positions.</li>
	<li>Pour chaque échantillon qc, étiquetez deux tubes microcentrifuges de 1,5 ml : l'un comme « A » et l'autre comme « B ». Disposer les tubes dans un support en plastique de 80 positions.</li>
	<li>Répétez l'étape 2.3.</li>
	<li>Retirez le sérum de mangouste de commande du stockage congelé et réchauffez-le à RT dans l'armoire de biosécurité. Vortex mélanger le sérum témoin avant l'échantillonnage.</li>
	<li>Distribuer 0,050 ml de sérum de mangouste de contrôle dans les quatre tubes «A» de 1,5 ml à l'aide d'un tuyauttede à répétition avec une pointe de capacité de 0,5 ml.</li>
	<li>Fortifier chacun des quatre échantillons de QC tels que spécifiés dans le tableau 4 à l'aide d'un tuyauttede de répétition avec une pointe de capacité de 0,5 ml. Capuchon chaque échantillon de QC en toute sécurité et mélange de vortex pour 10 à 15 s.</li>
	<li>Effectuer la procédure d'extraction décrite dans les étapes 2.6-2.12.</li>
</ol>4. Analyse LC-MS/MS
<ol><li>Configurer le LC-MS/MS avec tous les paramètres décrits dans le tableau 5. Puissance sur le LC-MS/MS et permettre à la colonne d'atteindre 70 oC avant de fixer le débit à 0,800 ml/min.</li>
	<li>Configurez une séquence dans le logiciel d'acquisition de données (Table of Materials) pour injecter la courbe standard avant et après chaque lot composé d'échantillons de contrôle de la qualité et d'échantillons inconnus.</li>
	<li>Injecter toutes les normes et les échantillons et acquérir des chromatogrammes d'ion MRM à l'aide de paramètres énumérés dans le tableau 5.</li>
	<li>Après l'achèvement de la séquence, éteignez le LC-MS/MS et jetez tous les flacons d'autosampler comme déchets dangereux.</li>
</ol>5. Quantification
<ol><li>Utilisez le logiciel d'analyse de données pour générer une courbe d'étalonnage des réponses relatives par rapport aux concentrations relatives pour moi-IPA en utilisant et-IPA comme norme interne. Calculez les réponses relatives de la transition de MRM quantificateur pour moi-IPA (556,6 ' 428,7) divisée par la transition MRM pour et-IPA (570,7 ' 442,7). Construire une courbe d'étalonnage à 7 niveaux à l'aide d'une fonction quadratique de deuxième ordre qui est pondérée 1/x et ignore l'origine.</li>
	<li>Calculer la concentration desérum (sérum C ) de moi-IPA en utilisant l'équation suivante: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59373/59373eq1.jpg" style="opacity: 0.9;"> où l'instrument c est la concentration déterminée par l'instrument à partir de la courbe <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59373/59373eq2.jpg" style="opacity: 0.9;"> d'étalonnage dans des unités de 'g/mL, 1.25 est le facteur de dilution, Vfinal est le volume final de l'échantillon (1.0 mL), et lesérum V est le volume de sérum en mL ( 0,050 ml nominal).</li>
</ol>

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<li>Jones, C., Moller, H., Hamilton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+potential+techniques+for+identifying+individual+stoats+%28Mustela+erminea%29+visiting+control+or+monitoring+stations%5BTitle%5D)+AND+%22New+Zealand+Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">A review of potential techniques for identifying individual stoats (Mustela erminea) visiting control or monitoring stations.</a> New Zealand Journal of Zoology. 31 (3), 193-203 (2004).</li>
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</ol>

Les auteurs AV et SO sont des employés à temps plein d'un fabricant d'appâts vaccinaux antirabiques oraux.

La méthode LC-MS/MS développée pour les études a utilisé la sélectivité de la surveillance des réactions multiples pour quantifier avec précision l'IpA et l'IPA dans le sérum de mangouste. La sélectivité de la détection de la SP/MS a également permis un protocole de nettoyage simple qui repose uniquement sur l'acétonitrile pour précipiter les protéines du sérum avant l'analyse.
Les acides iophénoxiques sont solubles dans l'ACN mais sont pratiquement insolubles dans l'eau. Pour exclure l'eau de...

Le virus de la rage (RABV) est un lyssavirus échoué unique de sens négatif, et circule parmi diverses espèces de réservoir satifieux dans les ordres Carnivora et Chiroptera. Plusieurs espèces de mangouste sont des réservoirs de RABV, et la petite mangouste indienne (Herpestes auropunctatus) est le seul réservoir à Porto Rico et d'autres îles des Caraïbes dans l'hémisphère occidental1,2,3 . Le contrôle de la circulation du RABV dans les réservoirs fauniques est généralement réalisé grâce à une stratégie de vaccination antirabique orale (VVA). Aux États-Unis, cette activité de gestion est coordonnée par l'USDA/APHIS/Wildlife Services National Rabies Management Program (NRMP)4. À l'heure actuelle, il n'existe aucun programme ORV sur la faune à Porto Rico. Des recherches sur les vaccins antirabiques et divers types d'appâts pour les mangoustes ont été menées avec des résultats prometteurs suggérant qu'un programme de VVA pour les mangoustes est possible5,6,7,8.
La surveillance de l'impact de la VCO repose sur l'estimation de l'étude des appâts par les espèces cibles, ce qui implique généralement l'évaluation d'un changement dans la séroprévalence des anticorps RV. Cependant, cette stratégie peut être difficile dans les zones où les programmes de vRO de la faune sont actifs ou dans les zones où les niveaux de RV sont enzootiques et où les niveaux de fond des anticorps neutralisants RABV (RVNA) sont présents chez les espèces réservoirs. Dans de telles situations, un biomarqueur inclus dans l'appât ou la matrice externe d'appât peut être utile.
Divers marqueurs biologiques ont été utilisés pour surveiller l'utilisation des appâts chez de nombreuses espèces, y compris les ratons laveurs (Procyon lotor)9,10, stoats (Mustela ermine)11,12, blaireaux européens ( Meles Meles) 13, sangliers (Sus scrofa)14, petites mangoustes indiennes15 et chiens de prairie (Cynomysludovicianus)16,17, entre autres. Aux États-Unis, les appâts OPÉRATIONNELS de l'ORV comprennent souvent un biomarqueur de tétracycline de 1 % dans la matrice d'appâts pour surveiller l'accumulation d'appâts18,19. Cependant, les inconvénients de l'utilisation de la tétracycline comprennent une préoccupation croissante au sujet de la distribution d'antibiotiques dans l'environnement et que la détection de la tétracycline est généralement invasive, nécessitant l'extraction dentaire ou la destruction de l'animal pour obtenir des os échantillons20. Rhodamine B a été évalué comme marqueur dans une variété de tissus et peut être détecté à l'aide de la lumière ultraviolette (UV) et la fluorescence dans les cheveux et les moustaches10,21.
L'acide iophénoxique (API) est une poudre blanche et cristalline qui a été utilisée pour évaluer la consommation d'appâts chez les coyotes (Canis latrans)22, renard arctique (Vulpes lagopus)23, renard roux (Vulpes vulpes)24, ratons laveurs 9 (en) , 25, sanglier14, cerf rouge (Cervus elaphus scoticus)26, blaireaux européens12 et furets (M. furo)27, parmi plusieurs autres espèces de mammifères. Les temps de rétention de l'API varient selon les espèces de moins de deux semaines dans certains marsupiaux28,29, à au moins 26 semaines en ongulés26 et plus de 52 semaines chez les chiens domestiques (Canis lupus familiaris)30. Les temps de rétention peuvent également dépendre de la dose31. L'acide iophénoxique se lie fortement à l'albumine de sérum et a été historiquement détecté en mesurant des niveaux d'iode de sang32. Cette approche indirecte a été supplantée par des méthodes de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) pour mesurer directement les concentrations d'acide iophénoxique avec détection UV33, et éventuellement avec la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse (LCMS) 34,35. Pour cette étude, une chromatographie liquide très sensible et sélective avec spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) méthode a été développée qui utilise la surveillance de réaction multiple (MRM) pour quantifier deux analogues de l'acide iophenoxique. Notre objectif était d'utiliser cette méthode LC-MS/MS pour évaluer la capacité de marquage de l'acide propanoïque 2-(3-hydroxy-2,4,6-triiodobenzyl) (méthyl-IPA ou moi-IPA) et 2-(3-hydroxy-2,4,6-triiodobenzyl)l'acide butanoïque (éthyl-IPA ou et-IPA) et lorsqu'il est livré dans un ORV appât pour les mangoustes en captivité.
Les mangoustes ont été capturées vivantes dans des pièges à cages appâtés avec des saucisses fumées et de l'huile de poisson disponibles dans le commerce. Les mangoustes étaient logées dans des cages individuelles de 60 cm x 60 cm x 40 cm en acier inoxydable et nourrissaient une ration quotidienne de 50 g d'aliments commerciaux secs pour chats, complétées deux fois par semaine par une cuisse de poulet disponible dans le commerce. L'eau était disponible ad libitum. Nous avons livré deux dérivés de l'IPA, l'éthyle-IPA et le méthyle-IPA, aux mangoustes captives dans les appâts ORV placebo. Tous les appâts étaient composés d'un blister de 28 mm x 20 mm x 9 mm avec un revêtement externe (ci-après « matrice d'appâts ») contenant de l'œuf de poulet en poudre et de la gélatine (Tableaudes matériaux). Les appâts contenaient 0,7 ml d'eau ou de dérivés de l'API et pesaient environ 3 g, dont 2 g étaient la matrice externe de l'appât.
Nous avons offert 16 mangoustes captives et-IPA en trois concentrations : 0,14 % (2,8 mg et-IPA dans une matrice d'appâts de 2 g; 3 mâles [m], 3 femelles [f]), 0,4 % (2,8 mg et IPA en volume blister de 0,7 mL; 3 ml, 3f) et 1,0 % (7,0 mg d'éthyl-IPA en volume de 0,7 mL; , 2f). La dose globale de 2,8 mg correspond à un taux de dose de 5 mg/kg27,36 et est basée sur un poids moyen de mangouste de 560 g à Porto Rico. Nous avons choisi 1% comme la concentration la plus élevée que la recherche suggère l'aversion du goût à certains biomarqueurs peuvent se produire à des concentrations de 'gt;1% chez certaines espèces37. Nous avons seulement offert la dose de 1% dans le paquet de blister car la flocculation a empêché le soluté de se dissoudre dans le solvant suffisamment pour être uniformément incorporé dans la matrice d'appât. Un groupe témoin (2m, 1f) a reçu des appâts remplis d'eau stérile et pas d'IPA. Nous avons offert des appâts aux mangoustes le matin (8 heures du matin) pendant ou avant l'alimentation de leur ration d'entretien quotidien. Les restes d'appâts ont été enlevés après environ 24 heures. Nous avons prélevé des échantillons de sang avant le traitement, un jour après le traitement, puis chaque semaine jusqu'à 8 semaines après le traitement. Nous avons anesthésié les mangoustes par inhalation de gaz isoflurane et recueillijusqu'à 1,0 ml de sang entier par venipuncture du cava de véa crânienne comme décrit pour les furets38. Nous avons centrifugé des échantillons de sang entier, transféré le sérum aux cryovials et les avons stockés à -80 oC jusqu'à l'analyse. Tous les animaux n'ont pas été échantillonnés pendant toutes les périodes afin de minimiser les impacts des prélèvements répétés de sang sur la santé des animaux. Les animaux témoins ont été échantillonnés le jour 0, puis hebdomadaires pendant jusqu'à 8 semaines après le traitement.
Nous m'avons livré l'IPA en trois concentrations : 0,035 % (0,7 mg), 0,07 % (1,4 mg) et 0,14 % (2,8 mg), tous incorporés dans la matrice d'appâts, avec 2 mâles et 2 femelles par groupe de traitement. Deux mâles et deux femelles ont reçu des appâts remplis d'eau stérile et pas d'IPA. Les heures d'offrande d'appât et l'anesthésie de mangouste sont décrites ci-dessus. Nous avons prélevé des échantillons de sang avant le traitement le jour 1, puis chaque semaine jusqu'à 4 semaines après le traitement.
Nous avons testé des données de concentration de sérum pour la normalité et les moyens estimés pour des concentrations d'IPA de sérum de différents groupes de traitement. Nous avons utilisé un modèle mixte linéaire pour comparer les concentrations moyennes de sérum et d'IPA mises en commun entre les individus. Le type d'appât (matrice/blister pack) était un effet fixe en plus de la journée expérimentale, tandis que l'iD animal était un effet aléatoire. Toutes les procédures ont été exécutés à l'aide d'un logiciel statistique commun (tableaudes matériaux)et l'importance a été évaluée à 0,05 euro.

<table><tbody><tr><td>Acétonitrile, grade Optima</td><td>Fisher</td><td>A996</td><td></td></tr><tr><td>Balance analytique</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS204</td><td></td></tr><tr><td>C18 colonne, 2,1 x 50 mm, 2,5 & micro ; m taille des particules</td><td>Waters Corp.</td><td></td><td></td>186003085</tr><tr><td>ESI Source</td><td>Agilent&nbsp ;</td><td>G1958-65138</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthyl-iophénoxique, 97 %</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>N/A</td><td>Lot MKBP5399V</td></tr><tr><td>Acide formique, grade LC/MS</td><td>Fisher</td><td>A117</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel LCMS</td><td>Agilent</td><td>MassHunter Acquisition de données et analyse</td><td></td>quantitative</tr><tr><td>Acide méthyl-iophénoxique, 97 % (p/p)</td><td>PR EuroChem Ltd.</td><td>N/A</td><td>Lot PR0709514717</td></tr><tr><td>Balance microanalytique</td><td>Mettler Toledo</td><td>XP6U</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5415C</td><td></td></tr><tr><td>MS/MS</td><td>Agilent</td><td>G6470A</td><td></td></tr><tr><td>N-Evap</td><td>Organomation</td><td>115</td><td></td></tr><tr><td>Appâts oraux pour vaccins contre la rage</td><td>IDT Biologika, Dessau Rossleau, Allemagne</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Acide propyl-iophénoxique, 99 % (p/p)</td><td>PR EuroChem Ltd.</td><td>N/A</td><td>Lot PR100612108RR</td></tr><tr><td>pipette à répétition</td><td>Eppendorf</td><td>M4</td><td></td></tr><tr><td>Bouchons de flacons d’échantillonneur automatique à vis, doublés de PTFE</td><td>Agilent</td><td>5190-7024</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium, certifié ACS grade</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Statistical Software Package</td><td>SAS Institute, Cary, Caroline du Nord, États-Unis N</td><td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique, 99 %</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06374</td><td></td></tr><tr><td>UPLC</td><td>Agilent</td><td>1290 Series</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Glas-Col</td><td>099A PV6</td><td></td></tr><tr><td>0,2 mL pointes de pipette</td><td>Eppendorf</td><td>30089.413</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette de 0,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30089.421</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL</td><td>Fisher</td><td>14-666-325</td><td></td></tr><tr><td>1250-& micro; Pointes de pipette d’une capacité L</td><td>Pointes</td> de pipette GeneMate <td>P-1233-1250</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette de 1 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30089.43</td><td></td></tr><tr><td>Flacons ambrés de 2 mL à vis</td><td>Agilent</td><td>5182-0716</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette de 5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30089.456</td><td></td></tr><tr><td>Porte-tubes de microcentrifugation à 80 positions</td><td>Fisher</td><td>05-541-2</td><td></td></tr><tr><td>Flacons ambrés de 8 mL avec Capuchons doublés de PTFE</td><td>Wheaton</td><td>224754</td><td></td></tr><tr><td>70 % (v/v) isopropanol</td><td>Fisher</td><td>A459</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 &micro ; Pipette à déplacement d’air L</td><td>Eppendorf</td><td>ES-100</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse des analogues de l'acide iophénoxique chez la petite mangouste indienne (herpestes auropunctatus) sera pour utilisation comme marqueur biologique de vaccination contre la rage buccale

Analysis of Iophenoxic Acid Analogues in Small Indian Mongoose (Herpestes Auropunctatus) Sera for Use as an Oral Rabies Vaccination Biological Marker

La petite mangouste indienne (Herpestes auropunctatus) est un réservoir de virus de la rage (RABV) à Porto Rico et comprend plus de 70% des cas de rage animale signalés chaque année. Le contrôle de la circulation du RABV dans les réservoirs fauniques est généralement réalisé par une stratégie de vaccination antirabique orale (VVA). À l'heure actuelle, il n'existe aucun programme ORV sur la faune à Porto Rico. Des recherches sur les vaccins antirabiques oraux et divers types d'appâts pour les mangoustes ont été menées avec des résultats prometteurs. La surveillance du succès de l'ORV repose sur l'estimation de l'étude des appâts par les espèces cibles, ce qui implique généralement l'évaluation d'un changement dans les anticorps neutralisants RABV (RVNA) après la vaccination. Cette stratégie peut être difficile à interpréter dans les zones ayant un programme actif de VRO pour la faune ou dans les zones où le RABV est enzootique et où les niveaux de fond de l'ARV sont présents chez les espèces réservoirs. Dans de telles situations, un biomarqueur incorporé avec le vaccin ou la matrice d'appâtpeut-nous peut être utile. Nous avons offert 16 appâts ORV placebo de mangouste captifs contenant de l'acide éthylo-iophenoxique (et-IPA) dans des concentrations de 0,4 % et 1 % à l'intérieur de l'appât et de 0,14 % dans la matrice externe de l'appât. Nous avons également offert 12 appâts ORV en captivité contenant de l'acide méthyl-iophénoxique (me-IPA) dans des concentrations de 0,035%, 0,07% et 0,14% dans la matrice d'appâts externes. Nous avons recueilli un échantillon de sérum avant l'offre d'appâts, puis hebdomadaire pour un jusqu'à huit semaines après l'offre. Nous avons extrait des acides iophenoxic de sérum dans l'acétonitrile et quantifiés utilisant la chromatographie liquide/spectrométrie de masse. Nous avons analysé le sérum pour et-IPA ou moi-IPA par spectrométrie liquide de chromatographie-masse. Nous avons trouvé la capacité de marquage adéquate pendant au moins huit et quatre semaines pour et- et- et moi-IPA, respectivement. Les deux dérivés de l'API pourraient convenir à l'évaluation sur le terrain de l'utilisation des appâts ORV chez les mangoustes. En raison de la longévité du marqueur dans le sérum de mangouste, il faut veiller à ne pas confondre les résultats en utilisant le même dérivé DE l'API lors d'évaluations consécutives.

Les chromatogrammes ioniques représentatifs d'une analyse me-IPA sont présentés à la figure 1. Le sérum de mangouste de contrôle (figure 1A) illustre le temps de rétention de et-IPA (analyte de substitution) et l'absence de me-IPA au moment de rétention indiqué. L'échantillon de contrôle de la qualité (figure 1B) illustre la séparation de base de l'API-et-IPA ainsi que les transitions de quantificate...

Nous avons offert aux mangoustes captives des appâts vaccinales contre la rage buccale placebo avec de l'acide éthylique ou méthyle iophenoxique comme biomarqueur et vérifié l'utilisation d'appâts à l'aide d'une nouvelle chromatographie liquide avec la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS).

Analyse des analogues de l'acide iophénoxique chez la petite mangouste indienne (Herpestes Auropunctatus) Sera pour utilisation comme marqueur biologique de vaccination contre la rage buccale

The small Indian mongoose (Herpestes auropunctatus) is a reservoir of rabies virus (RABV) in Puerto Rico and comprises over 70% of animal rabies cases ...

Nous avons décrit une procédure pour détecter et quantifier l’acide iophenoxic dans le sérum de mangouste. Les résultats suggèrent que l’acide iophénoxique peut être utilisé comme marqueur biologique pour vérifier l’absorption bêta chez l’espèce. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle permet la quantification des analogues de l’acide iophénoxique à des parties par milliard de niveaux, en utilisant une technique simple de précipitation protéique.Pour la phase A mobile, combiner un millilitre d’acide formique avec un litre d’eau ultra pure. Pour la phase B mobile, combiner un millilitre d’acide formique avec un litre d’acétylonitrile. Pour le diluant, mélanger un millilitre d’acide trifluoroacétique avec 200 millilitres d’acétyltrile.Ensuite, pesez environ 10 milligrammes de méthyle-IPA sur le microbalance, et enregistrez la masse à plus ou moins 0001 milligrammes. Transférer quantitativement le méthyle-IPA dans un flacon volumétrique de classe A de 10 millilitres, à l’aide de quatre à cinq millilitres d’acétyltrile. Sonicate pendant une minute pour dissoudre tous les solides, puis mettre en volume avec de l’acétyltrile.Transférer environ huit millilitres de chaque bouill

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo démontre la coloration immunohistochimique pour la détection de l’antigène du virus de la rage dans les tissus cérébraux de souris infectés. Le processus comprend la déparaffinisation et le traitement à l’alcool, suivis d’un traitement protéolytique pour améliorer l’accessibilité de l’antigène. La coloration immunohistochimique révèle des précipités rouges, confirmant la présence d’antigènes de la rage dans la coupe tissulaire.

Une coloration immunohistochimique pour la détection des antigènes du virus de la rage

Le test immunohistochimique rapide direct (DRIT) offre une alternative reconnue par l'Organisation mondiale de la santé animale et de l'Organisation mondiale de la santé (OIE/OMS) au test direct d'anticorps fluorescents (DFA) pour le diagnostic de la rage. Ce test permet des applications sur le terrain qui peuvent être effectuées en environ 1 h sur les impressions cérébrales à l'aide de la microscopie légère.

Surveillance accrue de la rage à l'aide d'un test immunohistochimique rapide direct

Une réaction en chaîne de polymérase de transcription inverse imbriquée de Pan-lyssavirus a été développée pour détecter spécifiquement tous les lyssavirus connus. La validation à l’aide d’échantillons de cerveau de la rage de différentes espèces animales a montré que cette méthode a une sensibilité et une spécificité équivalentes au test d’anticorps fluorescent étalon-or et pourrait être utilisée pour le diagnostic systématique de la rage.

Évaluation d’une réaction en chaîne de polymérase de transcription inverse imbriquée universelle pour la détection des lyssavirus

L'objectif de ce protocole est de démontrer des techniques d'autopsie sûres chez les petits et grands animaux afin d'obtenir des échantillons de tissus satisfaisants pour les tests de dépistage de la rage.

Techniques d'autopsie de la rage chez les grands et les petits animaux

Ici, nous décrivons une immunocapture indirecte de sandwich d’ELISA pour déterminer le contenu immunogénique de glycoprotéine dans les vaccins de rage. Ce test utilise un anticorps monoclonal neutralisant (mAb-D1) reconnaissant les garnitures de glycoprotéine. Il s’agit d’une alternative au test in vivo NIH pour suivre la cohérence de la puissance vaccinale pendant la production.

Test ELISA in Vitro pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage

Nous présentons un protocole complet pour le diagnostic post mortem de la rage animale dans des conditions de terrain utilisant un essai immunochromagraphic rapide de diagnostic (RIDT), de l’échantillonnage de biopsie de cerveau à l’interprétation finale. Nous décrivons également d’autres applications utilisant le dispositif pour l’analyse moléculaire et le génotypage viral.

Test de diagnostic immunochromatographique rapide sur le terrain postmortem pour les paramètres limités par les ressources avec d’autres applications moléculaires

Ce protocole présente une approche basée sur qRT-PCR pour déterminer le numéro de copie de gène de nucléoprotéine de virus de rage (N) dans diverses structures anatomiques de cerveau bovin utilisant la transcription in vitro.

Quantitation du virus de la rage dans diverses structures cérébrales bovines

Cette méthode décrit l’encapsulation de l’antigène rabique dans des microparticules polymères biodégradables ayant des propriétés structurelles et matérielles qui permettent une libération pulsatile après un délai prédéterminé. L’évaluation par dosage immunoenzymatique (ELISA) de l’antigène extrait du noyau de particules confirme la présence intacte de glycoprotéine trimérique du virus de la rage par fabrication de particules.

Fabrication de microparticules polymères pulsatiles encapsulant l’antigène antirabique

Nous présentons ici un flux de travail rapide et rentable pour caractériser les génomes du virus de la rage (RABV) à l’aide de la technologie nanopore. Le flux de travail vise à soutenir la surveillance fondée sur la génomique à l’échelle locale, en fournissant des informations sur les lignées de RABV en circulation et leur placement dans les phylogénies régionales afin d’orienter les mesures de lutte contre la rage.

Séquençage du génome entier pour la caractérisation rapide du virus de la rage à l’aide de la technologie des nanopores

L’objectif de ce manuscrit est d’examiner l’utilisation du test d’anticorps fluorescents indirects contre la rage pour la détection des anticorps IgG et IgM spécifiques de la rage.

Détection des anticorps antirabiques IgG et IgM à l’aide du test d’anticorps fluorescents indirects contre la rage

Ce protocole fait la démonstration de l’essai RT-PCR (transcription inverse en chaîne par polymérase en temps réel du pan-lyssavirus LN34), de la collecte de tissus à l’interprétation des résultats, y compris les mises à jour des séquences d’amorces et des formulations afin d’améliorer les performances des tests pour certains lyssavirus et lagomorphes non enragés. Nous démontrons également la configuration de l’essai pour un format LN34 multiplexé à puits unique (LN34M).

Diagnostic post-mortem de la rage chez les animaux par le test actualisé et multiplexé LN34 Real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

Découvrez une méthode LC-MS/MS pour détecter l'acide iophénoxique dans le sérum de mangouste Herpestes auropunctatus. Cette technique simple de précipitation protéique permet une quantification sensible au niveau des parties par milliard.

Analyse des analogues de lacide iophénoxique chez la petite mangouste indienne (Herpestes Auropunctatus) Sera pour utilisation comme marqueur biologique de vaccination contre la rage buccale (Vidéo) | JoVE Journal

Analyse des analogues de l'acide iophénoxique chez la petite mangouste indienne (Herpestes Auropunctatus) Sera pour utilisation comme marqueur biologique de vaccination contre la rage buccale

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