Name: Prédiction en prestation de charges utiles Vivo à l’aide d’une barrière hémato-encéphalique tumeur dans un plat (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Découvrez comment créer un modèle in vitro de la barrière hémato-encéphalique tumorale avec des cellules murines et humaines. Cette méthode permet de quantifier et visualiser le passage des médicaments avant les tests précliniques.

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Cette recherche a été financée par des subventions accordées par les organisations du Cancer finlandais, Jane & Aatos Erkko Foundation et Sigrid Juselius Foundation (P.L. et V.L.J.), la Swiss National Science Foundation (Postdoc.Mobility Advanced grant no : P300PB_164732, à S. K.), la fondation de recherche Orion (à S.K.), le Maud Kuistila Memorial Foundation (à S.K.) et l’Académie de Finlande (TERVA 2017, accorder no : 314 498). L’unité d’imagerie Biomedicum (Helsinki) est reconnue pour fournir la microscopie imagerie installation principale.

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’émergence de la notion de variabilité interpatient tumeur rajeuni la recherche sur le cancer personnalisé médecine21. Cette variabilité est également une caractéristique des tumeurs du système nerveux central. En raison de l’imprévisibilité de la tumeur, réponse à la chimiothérapie ajoute à l’effet d’abri du BBB pour administration de médicaments et au total constitue des défis majeurs dans les soins aux patients,22. Afin de développer des traitements plus efficaces, il est souvent nécessaire de grandes bibliothèques écran de nouvelles molécules. Pour évaluer l’efficacité antitumorale et la capacité des nouvelles pistes thérapeutiques à atteindre le site de la tumeur, la meilleure option est de l’étude préclinique sur des cellules dérivées de patient implanté en vivo dans avatars patients murines. En raison de la pratique (ressources financières, de temps, l’homme et centre) et des raisons éthiques (le principe 3Rs lors de l’utilisation des animaux de laboratoire), l’élaboration d’une telle plate-forme de dépistage in vivo à grande échelle n’est souvent pas possible et par conséquent, les tests basés sur les cellules reste un modèle de choix23. La raison principale de sélection créé des lignées de cellules et éviter les cellules primaires est pour faciliter la reproductibilité et réduire l’utilisation des animaux de laboratoire, qui sont la principale source d’isolement et de mise en place de cultures primaires de murins. Les méthodes présente ici, fermement respectant les 3R, pourraient jeter efficacement des nanoparticules d’une étude préclinique plus loin sur le criterium de leur incapacité à traverser le modèle BBTB. Comme une preuve de principe, nous décrivons les résultats obtenus au cours de l’élaboration et la validation de la BBTB. Nous avons été en mesure de confirmer les résultats in vitro in vivo, par exemple, pour mesurer la diffusion passive d’un 376 Da sodium-fluorescéine.
Le protocole décrit dans le présent document décrit la préparation de cellules endothéliales co-cultivées avec des astrocytes pour former une interface de type tumeur-barrière hémato-encéphalique dans une configuration in vitro. Une fois établi un contact physique entre ces deux types de cellules, la couche de cellules endothéliales présente des similitudes avec le BBB (par exemple, une cellule expression en surface des protéines des jonctions serrées et relativement faible perméabilité). Fait intéressant, l’imitateur BBTB murin semblait fournir des valeurs de perméabilité Na-Fl particulièrement semblables à ceux obtenus avec la souris in vivo BBB perméabilité mensurations24. Par conséquent, les performances de l’imite BBTB vont être directement liée au choix de cellules utilisées pour former la barrière. Les cellules endothéliales bEND3 proviennent du cerveau et sont connus pour être réussie dans la formation de barrières lorsque co-cultivées avec des astrocytes25. Cependant, nous avons utilisé l’immortalisées HIFko astrocytes26 pour générer l’imitateur BBTB. En raison de leur manque de facteurs inductibles par l’hypoxie, ne produisent pas de ces astrocytes VEGF-A, qui est par excellence dans la stabilisation de l’imitateur BBTB décrite ici. Les astrocytes ont été identifiés en tant que modulateurs de la perméabilité BBB, par exemple par le biais de la libération de VEGF-A à la suite de la neuro-inflammation27. Activation des récepteurs de facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGFRs) est un important régulateur de la perméabilité endothéliale/vasculaire en vitro28 et in vivo29. Par conséquent, les suppléments de VEGF-A dans le milieu activent le VEGFR2 sur les cellules endothéliales, qui induit la phosphorylation des protéines des jonctions adherens comme la VE-cadhérine30. La perte de contacts de cellules endothéliales génère la grande perméabilité des vaisseaux sanguins. De même, forte propriété mitogène tant la composition inconnue du fœtale bovine sera utilisé dans les essais de culture de cellules entraînent des problèmes majeurs dans la reproductibilité de stabilisation et de dosage de barrière.
Les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) sont parfois utilisés pour former le BBB dans vitro31; Cependant, ils diffèrent sensiblement des cellules endothéliales microvasculaires du cerveau, telles que la cellule hCMEC/D3 la ligne32, sur le plan de l’expression génique et formant barrière propriétés. Cependant, la perméabilité relativement plus élevée, les valeurs obtenues avec les cellules de HuAR2T cultivés seuls par rapport à la bEND3 ont été considérablement réduits par leur coculturing avec les astrocytes humains primaires. Bien que les cellules endothéliales sont nécessaires pour former la paroi cellulaire, il est clair que les astrocytes ont un rôle tout aussi important à jouer pour la formation de BBTB et la stabilisation.
Lorsque les sphères gliome dérivé de patient ont été ajoutés à cette équation, l’imitateur BBTB souris récapitule certaines des caractéristiques des xénogreffes murines, tels que la diffusion de la drogue par le biais de la vascularisation cérébrale et le ciblage de cellules de tumeur. L’imite BBTB discuté ici ont, par exemple, réussi à miroir du comportement in vivo, quand nous avons projeté plusieurs nanoparticules avec différents diamètres. Pour illustrer le parallélisme entre les modèles in vitro et in vivo, nous avons utilisé le décrit précédemment mésoporeux silicate nanoparticules33 avec pénétration cellulaire propriétés34 conjugué au peptide ciblage tumoral CooP sur leur surface20. Les maisons des CooP-ciblage du peptide aux cellules de tumeur invasive à la liaison spécifique à l’inhibiteur de croissance mammaire dérivés (BOLOBELE). Plusieurs types de cancers, y compris les gliomes, sont surexprimant BOLOBELE par rapport au tissu normal35, qui rend la cage une portion de ciblage de tumeurs très efficace capable d’augmenter la fourniture d’une charge utile de20. Les nanoparticules utilisées ici ont démontré antérieurement à diffuser dans le parenchyme du cerveau (27547955), et lorsque fonctionnalisés avec Taxol, ces nano-cargos ont réussi à réduire la croissance de gliome dans les modèles précliniques,36. L’ajout de résidus de polyéthylène glycol (PEG) à la surface des nanoparticules ont également maintenu leur charge statique à des valeurs positives (autour de + 4 mV), permettant la meilleure interaction avec les d’unité neurovasculaire37 et aussi d’augmenter leur stabilité en circulation. Dans les données présentées, 3 kDa de PEG est conjugué aux NP110s, tandis que les NP350s ont été recouverts de 10 kDa de PEG. Cependant, a augmenté-molecular-weight PEG a aussi entraîné une augmentation significative du diamètre de la nanoparticule, d'où leurs capacités physiques pour traverser la BHE. Par conséquent, nous avons vérifié si les dimensions physiques des particules ont empêché leur passage à travers la BBTB et savoir si ces observations pourraient être mis en miroir in vivo.
Selon les observations déjà publiées, nous avons observé que NP110s extravasé au moyen de la BBTB in vitro et le BBB des souris porteuses de tumeurs intracrâniennes, tout en NP350s conservé du côté luminal de l’imitateur BBTB et dans les vaisseaux sanguins de la souris. Ces mêmes résultats suggèrent fortement que le modèle BBTB prédit la capacité in vivo des nanoparticules pour traverser la BHE et atteindre le cerveau.
La pertinence des modèles cellulaires de la BHE est souvent discutée, même pour l’administration centrale de nanoparticules38. Nous montrons ici que primaires astrocytes et les cellules endothéliales, tous deux considérés comme les plus importants outils in vitro, peuvent être remplacés par des cellules immortalisées et/ou commercialement disponibles, assurant reproductibilité et une plus grande extensibilité. La prochaine génération de l’imite BBB in vitro pourrait être développée en intégrant les dispositifs microfluidiques, permettant aux unités neurovasculaires magnifiquement formé qui ressemblent structurellement les réelles BBB12,14. Cependant, ces modèles ne conviennent pas actuellement pour le criblage à haut débit de molécules livré à gliomes, en raison de limitations techniques dans le cadre du suivi de la livraison de14. C’est en effet difficile de saisir la complexité physiologique de la BHE dans un plat, et l’éventuelle absence de certains récepteurs/protéines, connues pour être exprimées par le BBB, pourrait compromettre l’interprétation des résultats. Un autre argument concerne la grande variabilité dans l’expression des gènes entre les conditions in vivo et in vitro, ainsi que de la ligne d’une cellule à l’autre, surtout si l'on considère les cellules endothéliales. Toutefois, on pourrait aussi affirmer que l’unité neurovasculaire n’est pas une entité homogène au sein du cerveau39. Recherche scientifique en biologie a atteint une ère sans cruauté où le bien-être des animaux, responsabilité éthique et le coût d’utilisation des vies animales sont toujours considérés avant de concevoir une expérience. Par conséquent, pour prendre en charge le remplacement des animaux, un nombre croissant d’études récentes montre que la prise de conscience des limites des modèles et une sélection rigoureuse des modèles cellulaires d’établir la barrière — en mettant l’accent sur les astrocytes — justifient une correspondance entre les résultats obtenus dans un plat et dans les animaux modèles40. Avec la méthode décrite ici, nous avons un peu plus de la réduction du nombre d’animaux de laboratoire utilisés pour fins de BBB transcytose potentiel thérapeutique de la présélection.

L’unité neurovasculaire est composée de neurones, les astrocytes et le BBB, formé par des liens complexes entre la membrane basale associée formant le cerveau système microvasculaire1, cellules endothéliales, péricytes et astrocytes. Cette paroi cellulaire serrée formée par navires continues, nonfenestrated finement réglemente la circulation des ions et molécules (y compris les hormones, substances nutritives ou médicaments), mais également des cellules1en circulation. La transcytose faible notamment à travers la BHE de molécules de poids moléculaire élevé, comme anticorps thérapeutiques, médicaments conjugués ou nanocompounds, limite considérablement les progrès dans la découverte de médicaments pour des maladies neurologiques, notamment malignes 2de gliomes. En effet, les chimiothérapies par voie orale ou intraveineuse livrés atteint le parenchyme du cerveau souvent en mal de faibles concentrations d’induire un effet antitumoral ou sont tout simplement incapables de franchir la BBTB pour atteindre les cellules néoplasiques3. Plusieurs études précliniques et cliniques n’ont pas traité de la question de pénétration BBTB mais ont tenté de perturber la BBTB transitoirement, par exemple en utilisant des ultrasons focalisé4,5, ou pour contourner par le direct sur place livraison de médicaments6. Cependant, aucune de ces techniques ont été en mesure de contrer l’expansion inévitable de tumeur ou de rechute. Donc, lors de l’élaboration de nouveaux traitements antiglioma, la diffusion à travers le BBTB devrait être considérée comme un des aspects essentiels pour la réalisation des agents thérapeutiques7.
En raison de la nature très complexe des interactions cellulaires dans le BBTB, études in vivo chez les animaux de laboratoire semblent être le choix évident lorsque l'on étudie le passage de molécules du sang au cerveau. Cependant, les méthodes in vivo de grande échelle sont relativement complexes à mettre en place et, par conséquent, ne permettent pas le criblage à haut débit de molécules dans un délai raisonnable à un coût raisonnable. Plus important encore, expérimentation animale doit suivre les directives éthiques 3R défini comme i) affiner, réduire les ii) et, de pertinence dans le contexte actuel, iii) remplacer par d’autres protocoles (par exemple, dans les méthodes in vitro/in silico). Par conséquent, recréant la BBTB in vitro apparaît comme une possibilité intéressante et attrayante, mais elle constitue aussi une tâche complexe, contestée par diverses limitations. Beaucoup tente de recréer ce milieu complex avec les cellules primaires ou de lignées cellulaires de canine, porcin, origine murine et même humain ont été publiées (évaluée par Rahman et coll.8 et9de la loi Helms et al.). Ces modèles incluent microfluidique en trois dimensions des systèmes10, BBB-on-a-chip11,12, et une multitude de variantes basées sur les cultures de co classiques en insère des systèmes. Néanmoins, les systèmes actuels de microfluidique et puce sont pas adapté aux drogues-validation rapide et à haut débit études13,14 ou sont actuellement incompatible avec les études de la délivrance de médicaments à des tumeurs au cerveau. En outre, l’examen des 155 modèles publiés à l’aide de cellules primaires, les cellules souches pluripotentes inductible (iPSC) ou lignées de cellules commerciales toutes les insertions ont cultivées sur affichait une tendance de divergence interstudy dans leurs mesures et/ou conclusions8. Ce manque de reproductibilité interlaboratoire pourrait être corrélé avec les conditions de culture i) non normalisée, par exemple avec le revêtement facultatif avec les protéines de la membrane basale matrice dans le récipient de culture cellulaire, ii) un nombre accru de sous-culture et son utilisation sérum contenant des médias, les deux principaux moteurs des modifications génétiques et phénotypiques des cellules lignes15, ou iii) la difficulté de façon reproductible recréer le juste équilibre entre les astroglials et les composants endothéliales dans un plat. Bien que l’utilisation de cellules immortalisées ou cellule commerciale de lignes pour établir un modèle in vitro de BBB manque quelques-unes des propriétés par rapport à des modèles similaires qui utilisent uniquement les cellules primaires, dans la méthode décrite, nous montrons que la bonne combinaison de cellules expositions une très des performances comparables à des études publiées dans d’autres modèles de référence16,17. Finalement, l’absence d’un modèle fiable et reproductible pour étudier le passage de composés thérapeutiques ciblant les tumeurs au cerveau par le biais de la BBTB motivés à développer les méthodes décrites ici.
Puisque l’objectif était d’utiliser le modèle pour prévoir la livraison in vivo des nanoparticules dans les modèles animaux précliniques, nous avons tout d’abord validé le modèle BBTB en utilisant des encarts contenant des cellules endothéliales murines en contact avec les astrocytes murines. En plus de cela, nous avons également optimisé le modèle pour utiliser certaines lignées cellulaires humaines. Une fois stabilisée, les barrières de la cellule sont transférés aux cultures avec glioblastome dérivé de patient sphères ou lignées de cellules de gliome commerciale. Par la suite, la transcytose de nanoparticules et ciblant les cellules tumorales peut être visualisée par microscopie confocale et quantifiée par le prélèvement d’échantillons au fil du temps. Ce qui est important, résultats obtenus à l’aide de l’imite BBTB pourraient prédire de façon fiable le comportement des nanoparticules in vivo, soutenant l’utilisation de l’autorisation de reproduire BBTB la validation préclinique.

<table><tbody><tr><td>Cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bEND3</td><td>ATCC</td><td>CRL-2299</td><td>Cultivé dans : DMEM (1 g/L de glucose) complété par 10 % de FBS, 5 mL de L-glutamine et 5 mL de pénicilline/streptomycine</td></tr><tr><td>HIFko astrocytes de souris</td><td>immortalisés isolés dans le laboratoire du Dr Gabriele Bergers</td><td>https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6</td><td>Cultivé dans : BME-1 supplémenté avec 5 % de FBS, 5 mL 1 M HEPES, 5 mL 100 mM de pyruvate de sodium, 3 g de D-glucose et 5 mL de pénicilline/streptomycine</td></tr><tr><td>HuAR2T</td><td>Isolé dans le laboratoire du Dr Dagmar Wirth</td><td>https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184</td><td>Cultivé dans : EBM-2 avec SupplementMix</td></tr><tr><td>astrocytes primaires humains normaux</td><td>Lonza</td><td>CC-2565</td><td>Cultivé dans : ABM avec SingleQuots</td></tr><tr><td>Matériel et réactifs</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boîte de 100 mm x 17 mm, Nunclon Delta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique de 10 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>170361</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubes à centrifuger coniques stériles en polypropylène</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>ABM Milieu basal, 500 mL</td><td>Lonza</td><td>CC-3187</td><td>Pour les astrocytes humains primaires. ABM+ : contient tous les additifs du mélange de suppléments. ABM- :tous les additifs à l’exception de rhEGF et FBS</td></tr><tr><td>Accutase Cell Detachment Solution</td><td>Corning</td><td>25-058-CI</td><td></td></tr><tr><td>AGM SingleQuots Suppléments et facteurs de croissance</td><td>Lonza</td><td>CC-4123</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplément</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>pour GBM + et - moyen</td></tr><tr><td>Basal moyen Eagle</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21010046</td><td>BME-1</td></tr><tr><td>Corning Costar Plaques 6 puits traitées TC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3506</td><td></td></tr><tr><td>Corning Inserts de culture cellulaire à membrane polyester Transwell</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3452</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td> se <td>dissoudre dans 50 mL de BME-1 et un filtre stérile avant d’être ajouté au milieu</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient F-12 Ham</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td>Spécifique à la culture des sphères dérivées du patient isolées dans notre laboratoire, peut varier pour d’autres lignées cellulaires de gliome</td></tr><tr><td>Croissance du milieu EBM-2 SupplementMix</td><td>PromoCell</td><td>c-39216</td><td>EBM+ : contient tous les additifs du mélange de suppléments. EBM- :tous les additifs à l’exception de VEGF-A et FBS</td></tr><tr><td>Endothelial Basal Medium 2 (EBM-2)</td><td>PromoCell</td><td>c-22211</td><td>EBM+ : contient tous les additifs du mélange de suppléments. EBM- :tous les additifs à l’exception du sérum fœtal bovin VEGF-A et FBS</td></tr><tr><td>(FBS), qualifié, inactivé thermiquement, approuvé par l’UE, origine Amérique du Sud</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10500056</td><td></td></tr><tr><td>Sel de sodium de fluorescéine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td></td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96 plaques de puits</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Greiner 655090</td><td>puits en polystyrène noir à fond plat (avec fond micro-transparent)</td></tr><tr><td>Menzel-Gl&auml ; ser 0,9 cm rond borosilicate Cover Slips</td><td>Thermo Scientific</td><td>10313573</td><td></td></tr><tr><td>comprimés PBS</td><td>Medicago</td><td>09-9400-100</td><td>un comprimé par litre de dH2O, puis stériliser la solution par autoclave</td></tr> de <tr><td>bromhydrate de poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>EGF humain recombinant</td><td>Peprotech</td><td>GMP100-15</td><td>pour GBM+ moyen</td></tr><tr><td>FGF humain recombinant (154 a.a.)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>pour GBM+ moyen</td></tr><tr><td><fort>Immunofluorescence</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>24 mm x 60 mm Verre de protection de lame de microscope</td><td>ORSAtec</td><td>0224601-D</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaires AlexaFluor 488 et 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>dilution : 1/500</td></tr><tr><td>Anticorps anti-Claudin-5</td><td>Abcam</td><td>ab15106</td><td>dilution : 1/150</td></tr><tr><td>Clone d’anticorps anti-GFAP GF5</td><td>Abcam</td><td>ab10062</td><td>dilution : 1/150</td></tr><tr><td>Anti-souris CD31&nbsp ; Clone d’anticorps MEC 13.3</td><td>BD Biosciences</td><td>Dilution</td><td>550274 1/800</td></tr><tr><td>Anticorps anti-antigène T anti-SV40</td><td>Abcam</td><td>ab16879</td><td>dilution : 1/150</td></tr><tr><td>Anti-Zonula Occludens-1</td><td>Abcam</td><td>ab96587</td><td>dilution : 1/200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>TOCRIS</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount Milieu d’enrobage aqueux&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Rouge DND-99</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>Procédures animales</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm Ciseaux de dissection incurvés</td><td>World Precision Instruments</td><td>14394</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 25 G aiguilles</td><td>Becton Dickinson</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>Pince fine (12,5 cm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>503283</td><td>pour la dissociation tissulaire</td></tr><tr><td>Intramedic Tube en polyéthylène PE20</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>Ketaminol vet 50 mg/mL</td><td>Intervet</td><td>Vnr511485</td><td>Kétamine</td></tr><tr><td>Mains Powered microdrill</td><td>World Precision Instruments</td><td>503599</td><td></td></tr><tr><td>Menzel-Gl&auml ; ser 0,5 cm rond borosilicate Cover Slips</td><td>Thermo Scientific</td><td>11888372</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bulldog</td><td>clamp World Precision Instruments</td><td>14119</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline physiologique</td><td>Mustela</td><td>Flacons unidoses stériles 20 x 5 mL / 40 x 5 mL - Classe</td><td></td>de dispositif médical</tr><tr><td>Pince Rochester-Oschner</td><td>World Precision Instruments</td><td>501709</td><td></td></tr><tr><td>Rompun vet 20 mg/mL</td><td>Intervet</td><td>Vnr148999</td><td>Xylazine</td></tr><tr><td>Adaptateur stéréotaxique</td><td>World Precision Instruments</td><td>502063</td><td></td></tr><tr><td>Sugi Sponge Points</td><td>Kettenbach</td><td>31603</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Zoom.V16 microscope à zoom stéréo de fluorescence&nbsp ;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega lecteur de microplaques</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 caméra numérique sCMOS</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Universal 320 centrifugeuse de table&nbsp ;</td><td>Hettich</td><td>Cat. N° 1401</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS LSM 880 avec microscope confocal Airyscan</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

prédiction en prestation de charges utiles vivo à l’aide d’une barrière hémato-encéphalique tumeur dans un plat

Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

Hautement sélective par nature, la barrière sang - encéphalique (BHE) est essentielle pour l’homéostasie du cerveau dans des conditions physiologiques. Toutefois, dans le cadre des tumeurs cérébrales, la sélectivité moléculaire de BBB protège également les cellules néoplasiques en bloquant la livraison des chimiothérapies périphériquement administrées. Le développement de nouveaux médicaments (y compris des nanoparticules) ciblant les tumeurs cérébrales malignes idéalement nécessite l’utilisation de modèles animaux précliniques pour étudier la transcytose et l’efficacité antitumorale du médicament. Afin de respecter le principe des 3R (affiner, réduire et remplacer) pour réduire le nombre d’animaux de laboratoire en montage expérimental et effectuer le criblage à haut débit d’une grande bibliothèque d’agents antitumoraux, nous avons développé un humain in vitro reproductible et murine imitateur de l’hémato-encéphalique tumeur-barrière (BBTB) à l’aide de cultures de trois couches de cellules endothéliales, astrocytes et sphères de glioblastome dérivé de patient. Pour plus d’évolutivité et de reproductibilité, lignées de cellules commerciales ou cellules immortalisées ont été utilisés dans des conditions adaptées pour permettre la formation d’une barrière qui ressemble à la BHE réelle. Nous décrivons ici un protocole afin d’obtenir un imitateur BBTB en cultivant des cellules endothéliales en contact avec les astrocytes à la densité des cellules spécifiques sur les inserts. Cet imitateur BBTB peut être utilisé, par exemple, pour la quantification et l’imagerie confocale du passage nanoparticule à travers les barrières endothéliales et astrocytes, en plus d’évaluer le ciblage de cellules de tumeur dans la même épreuve. En outre, nous montrons que les données obtenues permet de prédire le comportement des nanoparticules dans les modèles animaux précliniques. Dans une perspective plus large, ce modèle in vitro pourrait être adapté à d’autres maladies neurodégénératives, pour la détermination de l’adoption de nouvelles molécules thérapeutiques à travers la BHE et/ou être additionné de cerveau organoïdes d’évaluer directement l’efficacité de médicaments.

Imagerie confocale de l’imitateur BBTB murin présente l’expression et la localisation cellulaire de la jonction serrée protéines zonula occludens-1 (ZO-1) et claudin-5 bEND3. Contacts entre les cellules endothéliales et les astrocytes induit clairement la délocalisation de la ZO-1 et claudin-5 pour les contacts de cellules endothéliales par rapport à la monoculture de la bEND3 (Figure 1). À l’aide d’immunofluorescence souillant pour visualiser les astrocytes exprimant l’accord-cadre sur le cerveau-côté de la membrane, il est possible d’observer et d’étudier les processus astrocytaires et fin-pieds communiquant avec les cellules endothéliales à travers la membrane (Figure 1E ). Les contacts de l’astrocyte-endothélial sont connus pour promouvoir et stabiliser le resserrement de la barrière cellulaire et sont associées à des valeurs plus faibles de la perméabilité de la BBB19. Conformément à cela, nous avons observé une diminution substantielle de la perméabilité de l’imitateur BBTB de souris de la Na-Fl de 27,63 (± 3,45) x 10-6 cm/s en cas de monoculture à 6,74 (± 3.01) x 10-6 cm/s lorsque cultivées conjointement avec inductibles par l’hypoxie facteur assommer les astrocytes (HIFko) (tableau 1). Le HuAR2T immortalisées forment des barrières cellulaires hautement perméables (104.92 ± 27,1 x 10-6 cm/s tableau 1). Semblable au modèle murin, nous avons mesuré la perméabilité significativement plus faible de la BBTB Na-FL, nommément 47,4 (± 14.32) x 10-6 cm/s, quand les cellules HuAR2T ont été conjointement cultivés avec les astrocytes humains primaires (tableau 1).
Dans mimics BBTB murins et humains, la présence des sphères dérivé de patient glioblastome induit une légère augmentation des valeurs de perméabilité par rapport aux cellule endothéliale-astrocyte de co-cultures seul (tableau 1). Ce phénomène est observé avec plusieurs, mais pas tous le patient gliome sphère modèles. Ceci peut être dû le VEGF-A qui est sécrétée par certaines de ces cellules dérivées de patient.
Pour comparer les valeurs de perméabilité de l’imite BBTB in vitro avec la BHE in vivo, nous avons photographié la diffusion en temps réel de la Na-Fl à travers une fenêtre crânienne implantée chez la souris nude. À l’aide d’un stéréomicroscope de fluorescence, diffusion de Na-Fl des vaisseaux sanguins capillaires dérivant des pie-mère principal des vaisseaux sanguins a été enregistrée avant, pendant et après l’injection systémique de la sonde (Figure 2). Mesures des valeurs différentielles de fluorescence de la circulation sang et le cerveau du parenchyme cortical au fil du temps nous a permis de calculer les valeurs approximatives de la perméabilité de la souris nue's BBB de Na-Fl (5,57 ± 2,19 x 10-6 cm/s, Tableau 1).
Pour illustrer comment cet imitateur BBTB peut être utilisée pour la visualisation du passage des composés à partir du côté de sang sur le côté du cerveau, nous avons comparé la transcytose d’ø 110 nm (NP110) et ø 350 nm (NP350) nanoparticules ciblant glioblastome dérivé de patient. Résultats obtient in vitro ont ensuite été comparées à la transcytose in vivo. Dans l’exemple présenté, les nanoparticules étaient enduits à la surface avec le peptide de ciblage tumoral CooP20 et chargement avec le colorant fluorescent (FITC) pour faciliter la visualisation. Nous avons marqué les cellules à l’aide de la teinture lysosomale et eosine avec DAPI 24h après l’addition de nanoparticules FITC sur le sang-côté de la BBTB imiter et microscopie confocale à différents niveaux (par exemple, du côté du sang, la membrane, du côté du cerveau, a acquis et les sphères de glioblastome patient) (Figure 3 a). Le signal fluorescent NP110-associated colocalisé avec les lysosomes dans les cellules endothéliales, les astrocytes et les cellules tumorales. En outre, NP110s ont été détecté entre-deux les cellules endothéliales et les astrocytes, en passant par les pores de la membrane de l’insert (Figure 3 a).
Le passage de NP110s a été quantifié par la mesure de la fluorescence provenant d’échantillons prélevés dans le sang et le cerveau de côté. Ces valeurs de perméabilité ont été comparées à celles déterminées pour les nanoparticules de ø 350 nm (NP350). Les résultats montrent que seulement NP110 a réussi à traverser l’imite BBTB (Figure 3 b). NP350 est resté sur le sang-côté de l’imitateur BBTB, qui a abouti à des valeurs plus faibles de la perméabilité de ces nanoparticules.
Afin de souligner la pertinence de l’imite BBTB par rapport aux modèles in vivo, les souris nues ont été injectés par voie intraveineuse avec NP110 ou NP350 de nanoparticules enduits avec le peptide de ciblage tumoral CooP et conjugué avec un colorant fluorescent rouge (TRITC) pour la détection. Les tissus prélevés à plusieurs points dans le temps a révélé qu’après 8 h, nanoparticules BBB-perméable ont extravasé dans le parenchyme du cerveau, tandis que les imperméables, ceux qui sont restés dans la circulation ont été principalement éliminé de la circulation systémique in vivo. C’est pourquoi, nous avons récolté les cerveaux et quantifié le nombre de nanoparticules par millimètre carré post-injection de 8 h. Selon les résultats in vitro, NP110, mais pas NP350, extravasé avec succès dans le parenchyme du cerveau (Figure 3). Imagerie à fort grossissement de l’emplacement de nanoparticules dans le cerveau ont montré que NP110 a été distribuée de façon homogène dans le parenchyme du cerveau en dehors des capillaires sanguins et hébergés avec succès vers les cellules de glioblastome implanté (Figure 3D). Malgré présentant la tumeur même ciblage portion (CooP), NP350 ne put extravasate dans le parenchyme du cerveau et a été détecté seulement au sein du côté luminal de vaisseaux cerveau (Figure 3E), semblables aux résultats obtenus in vitro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig1.jpg"> Figure 1 : Description du modèle hémato-encéphalique tumeur-barrière (BBTB). (A) représentation schématique de l’emplacement des différents types de cellules. (B) Illustration du placement sur le couvercle de la plaque 6 puits et la technique de semis pour les astrocytes du côté du cerveau de l’insert'insert membrane s. (C) Illustration de l’emplacement de la plaque 6 puits permettant l’adhérence astrocyte. (D) les micrographies Immunofluorescence de la jonction serrée protéines zonula occludens-1 (rouge, ZO-1, le haut rang) et claudin-5 (rangée inférieure, verte). L’expression de la protéine est comparée aux cerveau murin cellules endothéliales microvasculaires (bEND3) cultivées sur le côté de sang de la BBTB seul comme une monoculture (colonne de gauche) ou avec murin immortalisées HIFko astrocytes (colonne de droite). Noyaux cellulaires sont eosine au DAPI (bleu). (E) à balayage Immunofluorescence montrant la protéine fibrillaire acide gliale (GFAP, rouge) dans les HIFko astrocytes cultivés sur le côté du cerveau de la BBTB. L’image de fort grossissement montre processus astrocyte et fin-pieds (flèches) en communiquant avec les cellules endothéliales à travers la membrane des pores (panneau de droite). L’identité de l’HIFko astrocytes a été vérifiée par immunofluorescence souillant de l’antigène de T gros virus Simien 40 (SV40 grand T, vert) utilisé pour l’immortalisation des cellules. Les cellules endothéliales expriment ni celui-ci, ni le grand T de SV40 et, par conséquent, peuvent être partiellement observées à travers le transparent, en face du côté de la membrane de cellules colorées au DAPI seule (lignes pointillées). Noyaux cellulaires sont eosine au DAPI (bleu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig2.jpg"> Figure 2 : Intravitale dosage direct de la souris la perméabilité BBB. (A) préparation du cathéter implantable veine caudale. (1) outils et l’équipement sont les suivants : (a) un PE20 tube polyéthylène (b) deux 25 G aiguilles (c) Rochester-Ochsner forceps et (d) un petit bouledogue pince. (2) A 25 G aiguille est enlevé par plusieurs torsions à l’aide de la pincette et (3) soigneusement inséré dans le tube. (4), l’autre côté du tube est connecté à un autre aiguille 25 G. (B) conseils pour l’implantation du cathéter et le positionnement d’infuser la solution de sodium-fluorescéine dans la veine de la queue d’une souris. La zone encerclée indique la zone où une goutte de colle cyanoacrylate est placée pour fixer le cathéter. La pince bulldog est utilisée pour gérer le cathéter et retirée une fois le cathéter est fixé. (C) représentative d’imagerie et de quantification méthode pour déterminer les valeurs de perméabilité sodique-fluorescéine. Avant l’injection de fluorescéine sodique (colonne de gauche), l’autofluorescence/blank est mesuré dans une région d’intérêt (ROI) placée sur le cerveau (rectangle du panneau supérieur, blanc) et les zones de vaisseaux sanguins (rectangle de panneau, rouge de fond). Au cours de la perfusion de sodium-fluorescéine (colonne de droite), l’intensité de la fluorescence est mesurée dans les deux ROIs, ce qui permet le calcul de la perméabilité BBB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig3.jpg"> Figure 3 : prédiction de la transcytose intracérébrale de nanoparticules par BBB in vivo par le modèle in vitro de BBTB. (A) représentation graphique de l’essai BBTB avec représentant images confocales obtenus aux différents niveaux du modèle murin BBTB indiquées. Nanoparticules de 110 nm de diamètre (NP110) et conjugué à l’ITCF (vert) ont été ajoutés au sang côté des cellules BBTB ont été marquées avec la sonde lysosomale (LT-99, rouge).  (1), endothéliales de cellules, (2), endothéliales transcytose des nanoparticules à travers les pores de la membrane (ligne pointillée blanche), les astrocytes (3), et (4) patient glioblastome sphères sont identifiés sur le graphique et microscopie confocale correspondant (à droite). Encapsulation lysosomale des nanoparticules (flèches) suggère active transcytose à travers les couches endothéliales et astrocytes de la BBTB. (B) Quantification de la perméabilité de la nanoparticule indiquée par le biais de la BBTB in vitro (n = 6). Sections de Quantification (C) de la densité de nanoparticules indiquée dans le tissu cérébral, 8 h après la perfusion de la veine caudale des souris Nudes (n = 3). Microscopie confocale (D) montrant la répartition de l’ø 110 nm nanoparticules (NP110, rouge) dans les sections de tissu de cerveau murin étiqueté avec anticorps anti-souris CD31 (vert). La flèche met en évidence la transcytose nanoparticule (panneau de gauche). Nanoparticules accumulent autour des cellules de tumeur de cerveau (tumeur, panneau de droite) en raison de la peptide ciblage CooP présenté sur leur surface. Aucune domiciliation significative n’est observée dans le tissu cérébral (cerveau). Microscopie confocale (E) montrent la distribution de l’ø 350 nm nanoparticules (NP350, rouge) dans des sections de tissu de cerveau murin étiquetées avec anticorps anti-souris CD31 (vert). Point de pointes de flèches pour les NP350s qui ont été retenus dans la lumière du vaisseau sanguin et qui n’ont pas pu traverser la BHE, probablement en raison de leur plus grand diamètre par rapport au noyau de la cellule NP110s. sont colorées au DAPI (bleu). P &lt; 0,01. P-valeurs ont été calculées à l’aide d’un test U de Mann-Whitney bilatérale, non paramétrique. Les barres d’erreur représentent l’écart-type. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>murine imitateur BBTB</td>
			<td>bEND3</td>
			<td>bEND3 + HIFko comme</td>
			<td>bEND3 + Go</td>
			<td>bEND3 + HIFko comme + Go</td>
			<td>In vivo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Perméabilité (10-6 cm/s)</td>
			<td>27,63</td>
			<td>6,74</td>
			<td>26,8</td>
			<td>10,83</td>
			<td>5.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6 cm/s)</td>
			<td>3.45</td>
			<td>3.01</td>
			<td>7.99</td>
			<td>2.65</td>
			<td>2.19</td>
		</tr>
<tr>
<td>humain imitateur BBTB</td>
			<td>HuAR2T</td>
			<td>HuAR2T + hIAs</td>
			<td>HuAR2T + Go</td>
			<td>HuAR2T + hIAs + Go</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Perméabilité (10-6 cm/s)</td>
			<td>104.92</td>
			<td>47,4</td>
			<td>89,08</td>
			<td>48.24</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6 cm/s)</td>
			<td>27.1</td>
			<td>14.32</td>
			<td>10.21</td>
			<td>13.07</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : valeurs de la perméabilité de sodium-fluorescéine (Na-Fl) (en centimètres par seconde), déterminé en vitro dans les systèmes de co-culture indiquée et in vivo chez la souris nude NMRI. Données d’une expérience représentative (n = 3 souris).

Médicament ciblant les tumeurs du système nerveux central est un défi majeur. Nous décrivons ici un protocole pour produire un imitateur in vitro de la tumeur-barrière hémato-encéphalique à l’aide de cellules murines ou humaines et discuter de leur pertinence pour la prévisibilité du système nerveux central ciblant les tumeurs in vivo.

Prédiction en prestation de charges utiles Vivo à l’aide d’une barrière hémato-encéphalique tumeur dans un plat

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

Afin de développer de nouveaux médicaments et composés qui ciblent les tumeurs dans le système nerveux central, l’accessibilité et le passage à travers la barrière céphalo-cérébrale est très important. Bien que la cytotoxicité des composés peut facilement être mesurée en incubant les cellules avec les molécules thérapeutiques, il ne dit pas vraiment quoi que ce soit sur la livraison réelle au site tumoral dans le cerveau. Pour résoudre ce problème, nous avons développé le protocole suivant qui décrit comment recréer la barrière tumorale sang-cerveau in vitro sur un plat.L’utilisation de cellules immortalisées d’origine murine ou humaine rend cet essai très flexible. Il peut également être facilement mis à l’échelle jusqu’à l’écran des dizaines de composés avec une reproduisabilité élevée. En outre, cette méthode permet à la fois la quantification et la visualisation du passage et la capacité de ciblage des composés avant de procéder à des modèles précliniques.Par conséquent, notre méthode remplace partiellement les modèles animaux en utilisant les lignées cellulaires préé établies. L’inclusion des cellules de tumeur de cerveau patient-dérivées analyse l’hétérogénéité patiente, alors que l’utilisation des cellules immortalisées pour établir la barrière hé cerveau-encéphalique assure la reproductibilité des résultats. Au total, ce modèle de barrière céphalo-encéphalique offre un outil vraiment intéressant pour faire le point sur la diffusion des médicaments ou la livraison de véhicules de drogue.La démonstration visuelle de la méthode est essentielle parce que l’ensemencement des cellules de l’autre côté de l’insert nécessite une manipulation qui n’est pas souvent décrite dans d’autres protocoles à l’aide d’une configuration similaire. Par exemple, l’obtention de l’adhérence des astrocytes lorsque l’insert est placé à l’envers bénéficie fortement de la représentation visuelle. Sous un capot stérile de culture cellulaire, lavez soigneusement les astrocytes cultivés avec cinq millilitres de PBS stérile.Utilisez une pompe à vide pour jeter doucement le PBS, et ajouter deux millilitres de réaccente de dissociation cellulaire pendant cinq minutes pour détacher les cellules. Ensuite, ajouter 10 millilitres de milieu stérile de culture cellulaire complète des astrocytes au vaisseau pour inhiber l’activité du réaccente de dissociation cellulaire. Utilisez une pipette sérologique stérile pour transférer les cellules détachées du vaisseau vers un tube stérile de 15 millilitres.Centrifugeuse à 250 fois g pendant trois minutes à température ambiante. Pendant ce temps, définissez les inserts. Utilisez des forceps stériles pour placer les inserts avec le côté cérébral vers le haut sur le couvercle d’une plaque stérile de six puits.Lorsque la centrifugation est terminée, jetez soigneusement le supernatant de la suspension cellulaire, et resuspendez la pastille d’astrocyte dans un millilitre d’ABM-plus en pipetting doucement la pastille sur le mur du tube jusqu’à cinq fois. Ensuite, comptez les cellules, et ajustez la densité de suspension cellulaire à 150 000 cellules dans 400 microlitres d’ABM-plus par insert. Placez la suspension cellulaire au milieu du côté cérébral de la membrane de l’insert, et étalez-la soigneusement à l’aide d’une force capillaire avec une pointe stérile de pipette.Avec le côté cerveau des inserts encore en place, placez la plaque de six puits sur les inserts. Placez la plaque et les inserts, avec le côté cerveau vers le haut, dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pour permettre l’adhérence cellulaire. Après cela, revenir la plaque de six puits de retour à sa position régulière, avec les inserts maintenant côté sang vers le haut.Ajouter moyen, et continuer l’incubation comme décrit dans le protocole de texte. Sous un capot stérile de culture cellulaire, lavez soigneusement les cellules endothéliales de culture avec cinq millilitres de PBS stérile. Utilisez une pompe à vide pour jeter doucement le PBS, et ajouter deux millilitres de réaccente de dissociation cellulaire pendant cinq minutes pour détacher les cellules.Ensuite, ajoutez 10 millilitres de milieu stérile complet de culture cellulaire endothéliale au vaisseau pour inhiber l’activité du réaccente de dissociation cellulaire. Utilisez une pipette sérologique stérile pour transférer les cellules détachées du vaisseau vers un tube stérile de 15 millilitres. Centrifugeuse à 250 fois g pendant trois minutes à température ambiante.Après cela, jetez le supernatant, et resuspendez la pastille de cellules endothéliales dans un millilitre d’EBM-plus en pipetting lentement la suspension de cellules sur le mur du tube jusqu’à cinq fois. Comptez les cellules, et ajustez la densité de suspension cellulaire à 200 000 cellules dans 2,5 millilitres de culture cellulaire endothéliale dépourvue de sérum et de facteur de croissance endothéliale vasculaire A par insert. Récupérer la plaque contenant les inserts.Jetez soigneusement le milieu du côté sanguin et remplacez-le par les 2,5 millilitres de suspension cellulaire endothéliale. Ensuite, retournez la plaque à l’incubateur et laissez-la toute la nuit pour permettre aux cellules endothéliales d’adhérer à la membrane. Le lendemain, préparez une assiette de six puits en transférant trois millilitres d’ABM-moins préchauffé à chaque puits.À l’aide de forceps stériles, manipuler les inserts pour jeter soigneusement le milieu complet endothélial du côté sanguin, et placer l’insert dans la nouvelle plaque contenant ABM-moins. Ajouter ensuite 2,5 millilitres d’EBM-moins. Laissez les inserts dans l’incubateur avec un minimum de perturbation physique ou de variation de température pendant cinq jours.Le jour du transfert, remplacer le support. Pour l’imagerie par immunofluorescence, placez jusqu’à quatre couvertures stériles rondes de borosilicate dans chaque puits d’une plaque de six puits contenant deux millilitres de poly-D-lysine. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes.Pendant ce temps, utilisez une pipette sérologique stérile pour transférer soigneusement les sphères tumorales du vaisseau de culture cellulaire à un tube stérile de 15 millilitres. Centrifugeuse les sphères tumorales à 250 fois g pendant trois minutes. Jetez le supernatant et resuspendez doucement les sphères en un millilitre de GBM-moins.Comptez les cellules, et ajustez la densité cellulaire à environ 10 000 sphères ou 100 000 cellules par millilitre de GBM-moins. Ensuite, jetez la poly-D-lysine des puits et rincez les puits trois fois avec du PBS stérile. Ensemencer chaque puits de la plaque avec trois millilitres de la suspension sphéroïde tumorale, et transférer les inserts avec l’imitation BBTB sur la suspension cellulaire tumorale.Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pour permettre aux côtés du sang et des tumeurs cérébrales de l’essai d’atteindre l’équilibre. Le lendemain, remplacez les médias du côté sanguin par des EBM-moins complétés par les molécules, les médicaments ou les nanoparticules d’intérêt. Recueillir les échantillons au fil du temps pour une quantification directe comme décrit précédemment.Tout d’abord, recueillir 100 microlitres du milieu à la fois du sang et les côtés du cerveau de la BBTB imiter, et transférer chacun à un fond plat séparé, noir, plaque de 96 puits pour les mesures de fluorescence ultérieures. Ensuite, préparez une solution de 50 micromolaires de fluorescéine de sodium dans EBM-moins, en vous assurant de préparer 2,5 millilitres par puits. Préchauffer cette solution à 37 degrés Celsius, et remplacer les médias du côté sanguin des inserts par des supports contenant cette solution de fluorescéine de sodium.Démarrez une insurrateur dès que le support est remplacé. Recueillir soigneusement 100 microlitres de médias à la fois du sang et du cerveau des inserts à cinq minutes, 30 minutes, 60 minutes et 120 minutes. Transférer chaque échantillon dans des puits séparés de la plaque noire appropriée de 96 puits.Utilisez un lecteur de plaques pour quantifier la fluorescence des échantillons prélevés. Tout d’abord, diluer le colorant fluorescent lysosome à la concentration de travail appropriée dans le milieu préchauffé. Ajoutez ceci aux cellules, et incubez à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 45 minutes.Rincez ensuite les cellules trois fois avec du PBS glacé. Jetez le PBS et ajoutez trois millilitres de paraformaldéhyde glacé de 4 % aux puits et de 2,5 millilitres à l’insert. Incuber sur la glace pendant 10 minutes.Après cela, jeter le paraformaldéhyde, et rincer les cellules trois fois avec PBS. Retirez le PBS et contre-entacher les noyaux cellulaires à l’aide d’une solution DAPI à une concentration finale d’un microgramme par millilitre dans de l’eau distillée. Incuber à température ambiante pendant sept minutes.Ensuite, retirez le DAPI et lavez les membranes trois fois avec de l’eau distillée. Coupez soigneusement la membrane, retirez l’eau distillée et placez-la sur une goutte de milieu de montage sur une lame de microscope en verre. Ajouter une autre goutte de milieu de montage de l’autre côté de la membrane, et le couvrir soigneusement avec un verre de couverture borosilicate.Dans cette étude, les cellules endothéliales ont été co-cultivés avec des astrocytes pour former une interface de barrière-comme de tumeur de sang-cerveau dans une configuration in vitro. L’imagerie confocale de l’imitation de BBTB murine montre l’expression et la localisation cellulaire des protéines de jonction serrées zonula occludens-1 et claudin-5 dans bEND3. Les contacts entre les cellules endothéliales et les astrocytes induit clairement la relocalisation de ces deux protéines vers les contacts endothéliales cellule à cellule par rapport aux monocultures bEND3.À l’aide de taches d’immunofluorescence pour visualiser les astrocytes exprimant le GFAP du côté cérébral de la membrane, il est possible d’observer et d’étudier les processus astrocytiques et les pieds finaux en contactant les cellules endothéliales à travers la membrane. Pour comparer les valeurs de perméabilité du BBTB in vitro imite avec la barrière in vitro de sang-cerveau, la diffusion en temps réel de fluorescéine de sodium est image par une fenêtre crânienne implantée chez les souris nues. À l’aide d’un microscope stéréo à fluorescence, la diffusion de fluorescéine de sodium à partir des capillaires des vaisseaux sanguins provenant des principaux vaisseaux sanguins piaux est enregistrée avant, pendant et après l’injection systémique de la sonde.La transcytose des nanoparticules qui ciblent les sphères de glioblastome d’origine patiente est ensuite comparée pour illustrer comment cette imitation BBTB peut être utilisée pour visualiser le passage des composés du côté sanguin vers le côté cérébral. Le signal fluorescent associé au NP110 se co-localise avec les lysosomes dans les cellules endothéliales, les astrocytes et les cellules tumorales. En outre, les NP110 sont détectés entre les cellules endothéliales et les astrocytes, en passant par les pores membranaires de l’insert.Le passage des NP110 est quantifié en mesurant la fluorescence à partir d’échantillons prélevés sur le sang et le cerveau, et ces valeurs sont comparées à celles des nanoparticules déterminées qui sont de 350 nanomètres. Comme on peut le voir, seuls les NP110 sont capables de croiser les imitations BBTB, tandis que NP350 est resté sur le côté sanguin, ce qui entraîne des valeurs de perméabilité plus faibles pour ces nanoparticules. Manipuler l’insert avec soin, et écarter prudemment la suspension cellulaire des astrocytes sur le côté cérébral de l’insert sans contact direct de la membrane.Tout dommage de la membrane entraînera une fuite. Cette méthode peut être adaptée pour répondre à la question de la livraison cérébrale de charges utiles administrées périphériquement. En utilisant différents inserts avec de plus grands pores membranaires, il est également possible d’étudier l’extravasation cellulaire.Cette technique peut être modifiée en utilisant différents types de cellules pour imiter d’autres barrières cellulaires. Il ouvre également la voie à une recherche plus responsable et éthique, visant à réduire le nombre d’animaux de laboratoire utilisés pour la validation des médicaments anticancéraux. S’il vous plaît rappelez-vous que le paraformaldéhyde est un produit chimique très toxique et doit être manipulé en conséquence.Aussi, soyez prudent tout en utilisant un scalpel pointu pour extraire les membranes des inserts.

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