Name: Mesure directe de lengagement cible de KDM1A à laide dimmunossays à base de chemoprobe (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Découvrez la mesure directe de l'engagement cible de KDM1A par immunoassays à base de chemoprobe. Cette technique permet d'évaluer la pharmacodynamie des inhibiteurs de KDM1A dans les maladies oncologiques du système nerveux central.

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Cette étude a été financée par Oryzon Genomics. S.A., Hoffman-La Roche, et partiellement appuyé par le programme de collaboration CIIP-20152001 et RETOS RTC-2015-3332-1.

<ol><li>Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylation+mediated+by+the+nuclear+amine+oxidase+homolog+LSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1.</a> Cell. 119 (7), 941-953 (2004).</li>
<li>Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSD1%3A+biologic+roles+and+therapeutic+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenomics%22%5BJournal%5D)">LSD1: biologic roles and therapeutic targeting.</a> Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).</li>
<li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORY-1001%2C+a+Potent+and+Selective+Covalent+KDM1A+Inhibitor%2C+for+the+Treatment+of+Acute+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia.</a> Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).</li>
<li>Sugino, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+LSD1+inhibitor+NCD38+ameliorates+MDS-related+leukemia+with+complex+karyotype+by+attenuating+leukemia+programs+via+activating+super-enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers.</a> Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).</li>
<li>Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine-Specific+Histone+Demethylase%2C+LSD1%2C+%28KDM1A%29+As+a+Novel+Therapeutic+Target+in+Myeloproliferative+Neoplasms%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms.</a> Blood. 126, 601(2015).</li>
<li>Jutzi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSD1+Inhibition+Prolongs+Survival+in+Mouse+Models+of+MPN+by+Selectively+Targeting+the+Disease+Clone%5BTitle%5D)+AND+%22HemaSphere%22%5BJournal%5D)">LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone.</a> HemaSphere. 2 (3), 54(2018).</li>
<li>Mohammad, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Hypomethylation+Signature+Predicts+Antitumor+Activity+of+LSD1+Inhibitors+in+SCLC%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC.</a> Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).</li>
<li>Rivers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RN-1%2C+a+potent+and+selective+lysine-specific+demethylase+1+inhibitor%2C+increases+%CE%B3-globin+expression%2C+F+reticulocytes%2C+and+F+cells+in+a+sickle+cell+disease+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases γ-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model.</a> Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).</li>
<li>Rivers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+administration+of+the+LSD1+inhibitor+ORY-3001+increases+fetal+hemoglobin+in+sickle+cell+mice+and+baboons%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons.</a> Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).</li>
<li>Buesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dual+LSD1%2FMAO-B+inhibitor+ORY-2001+prevents+the+development+of+the+memory+deficit+in+samp8+mice+through+induction+of+neuronal+plasticity+and+reduction+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%E2%80%99s+%26+Dementia%22%5BJournal%5D)">The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation.</a> Alzheimer’s & Dementia. 11 (7), P905(2015).</li>
<li>Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-2-Phenylcyclopropylamine+is+a+mechanism-based+inactivator+of+the+histone+demethylase+LSD1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1.</a> Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).</li>
<li>Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+histone+demethylase+LSD1+reads+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human histone demethylase LSD1 reads the histone code.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).</li>
<li>Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor. , WO2017158136 (2016).</li>
<li>Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoprobe-based+assays+of+histone+lysine+demethylase+1A+target+occupation+enable+in+vivo+pharmacokinetics+and+-dynamics+studies+of+KDM1A+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. , In Press (2019).</li>
<li>Rodriguez-Suarez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Homogeneous+Nonradioactive+Methyltransferase+and+Demethylase+Assays+Targeting+Histone+H3+Lysine+4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).</li>
<li>Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD86+expression+as+a+surrogate+cellular+biomarker+for+pharmacological+inhibition+of+the+histone+demethylase+lysine-specific+demethylase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).</li>
<li>Schulz-Fincke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+studies+on+N-Substituted+tranylcypromine+derivatives+lead+to+selective+inhibitors+of+lysine+specific+demethylase+1+%28LSD1%29+and+potent+inducers+of+leukemic+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation.</a> European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).</li>
<li>Ishii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CETSA+quantitatively+verifies+in+vivo+target+engagement+of+novel+RIPK1+inhibitors+in+various+biospecimens%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Report%22%5BJournal%5D)">CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens.</a> Scientific Report. 7, 13000(2017).</li>
<li>Maes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORY-2001%3A+An+Epigenetic+drug+for+the+treatment+of+cognition+defects+in+Alzheimer%E2%80%99s+disease+and+other+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%E2%80%99s+%26+Dementia%22%5BJournal%5D)">ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer’s disease and other neurodegenerative disorders.</a> Alzheimer’s & Dementia. 12 (7), P1192(2017).</li>
</ol>

L'auteure Tamara Maes est directrice exécutive et actionnaire, et les auteurs Cristina Mascaro et Raquel Ruiz Rodriguez sont des employés d'Oryzon Genomics S.A. Oryzon Genomics S.A. qui développe des inhibiteurs KDM1A et détient des brevets couvrant les composés et les méthodes utilisés dans cet article.

Le protocole présenté ici a été développé pour mesurer directement l'engagement cible De KDM1A à l'aide d'un nouveau ELISA basé sur la capture de chimioprobe KDM1A. La méthode a été validée sur des lignées cellulaires humaines cultivées et des échantillons ex vivo de l'homme, du rat et de la souris et du babouin (y compris les PBMC, les poumons, le cerveau, la peau, les tumeurs), mais peut être facilement appliquée à d'autres espèces dans lesquelles l'anticorps KDM1A cible épitopes et catalytique centre sont conservés. C...

Lysine spécifique deméthylase 1 (KDM1A)1 est une deméthylase impliquée dans le contrôle de la transcription génique. Cette protéine est apparue comme une cible pharmacologique candidate2 en oncologie; y compris la leucémie myéloïde aigue3 (LAM), le syndrome de myélodie (SMD)4, myélofibrose (MF)5,6, Cancer du poumon à petites cellules (SCLC)7; dans la maladie des cellules de Sickle (SCD)8,9, et dans les maladies du système nerveux central, y compris la maladie d'Alzheimer (MA), la sclérose en plaques (SEP); et dans l'agression10.
La plupart des composés inhibiteurs du KDM1A dans le développement clinique sont des dérivés de cyclopropylamine et inhibent la protéine par liaison covalente à son dinucleotide d'adénine de flavine (FAD) cofacteur11. L'inhibition de KDM1A induit des changements d'expression génique, mais ces changements varient énormément selon les tissus, les types de cellules ou les cas de maladie. L'inhibition de KDM1A change également histone marques12, mais ces changements sont généralement produites localement à un site spécifique dans le génome, et sont à nouveau, fortement tissu et cellulaire spécifique.
Le protocole a été développé pour mesurer directement l'engagement cible de KDM1A dans des échantillons biologiques et a été optimisé pour l'utilisation avec des inhibiteurs dérivés de la cyclopropylamine. L'essai est basé sur la technologie ELISA et analyse, en parallèle, Total et Free (c'est-à-dire non lié par l'inhibiteur) KDM1A dans un extrait de protéine indigène d'un échantillon biologique dans une phase d'analyse solide. Dans un premier temps, l'échantillon biologique est lysé en présence de la chimioprobe sélective KDM1A biotinylated OG-88113,14, dérivée de l'inhibiteur sélectif KDM1A ORY-1001 (iadademstat), un inhibiteur puissant de KDM1A en clinique développement pour le traitement des maladies oncologiques. La chimioprobe a un IC50 pour KDM1A de 120 nM et comprend une moiety de liaison FAD liée à un polyéthylène glycol biotinylated (PEG)-queue. La chimioprobe se lie exclusivement au KDM1A libre, mais pas au KDM1A lié par l'inhibiteur dans l'échantillon. Après la liaison de chemoprobe, les complexes de KDM1A contenant dans l'échantillon sont capturés sur des plaques de microtiter avec la surface enduite de streptavidin pour déterminer KDM1A libre, ou sur des plaques enduites d'un anticorps de capture anti-KDM1A monoclonal pour déterminer kDM1A total. Après le lavage, les deux plaques sont incubées avec un anticorps anti-KDM1A de détection, lavées encore, et incubées avec un anticorps anti-lapin d'igG d'âne HRP-conjugué secondaire pour la détection utilisant un substrat luminescent et la quantification en mesurant le relatif d'unités légères (RLU) dans un luminomètre (Figure 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59390/59390fig1.jpg"> Figure 1. Schema of ELISA Enzyme linked chemoprobe immunoabsorbent as for KDM1A target engagement: A) Determination of total KDM1A using sandwich ELISA and B) Determination of free KDM1A using chemoprobe ELISA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59390/59390fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Une courbe standard est incluse dans les deux plaques ELISA pour vérifier la linéarité de chaque analyse. La détermination de l'engagement cible de KDM1A dans chaque échantillon est ensuite calculée comme valeur relative à l'échantillon pré-dose ou véhicule traité.

<table><tbody><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA (1X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>#25300-062</td><td></td></tr><tr><td>10 X Comprimés Inhibiteurs de Protéase</td><td>Roche</td><td>#11836153001</td><td></td></tr><tr><td>96 bloc de stockage de puits profonds</td><td>VWR</td><td>#734-1679</td><td></td></tr><tr><td>Plaques ELISA 96 puits</td><td>Nunc</td><td>#436110</td><td></td></tr><tr><td>Adhésif film noir</td><td>Perkin Elmer</td><td>#6050173</td><td></td></tr><tr><td>Adhésif Film transparent</td><td>VWR</td><td>#60941-062</td><td></td></tr><tr><td>Sonde KDM1A biotinylée OG-881</td><td>Oryzon Genomics S.A.</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma</td><td># 3117057001</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine Standard</td><td>Thermo Scientific</td><td>#23208)</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Protein Assay</td><td>BioRad</td><td>#500-0001</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse cellulaire 10X</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>#9803</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse pour plaques à 96 puits</td><td>Hettich</td><td>Rotina 420R</td><td></td></tr><tr><td>Flacon</td><td>Thermo Scientific</td><td>#156499</td><td></td></tr><tr><td>Humain recombinant LSD1 / KDM1A pleine longueur, enzymatiquement actif</td><td>Motif</td><td>#31426</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism 5 Project</td><td>GraphPad Software</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Luminol-Enhacer et solution de peroxyde (substrat chimiluminescent)</td><td>Thermo Scientific</td><td>#37074</td><td></td></tr><tr><td>Micro centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5415 R Lecteur</td><td></td></tr><tr><td>de microplaques Infinite 200-Tecan</td><td>Tecan</td><td>Infinite 200</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps de capture monoclonale de souris Anti-KDM1A (épitope N-terminal)</td><td>Abcam</td><td>#ab53269</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille G18 gauge blunt</td><td>BD</td><td>#303129</td><td></td></tr><tr><td>ORY-1001 (iadademstat)</td><td>Oryzon Genomics S.A.</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>Tubes de séparation PBMC 10 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>#163288</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de séparation PBMC 50 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>#227288</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Sigma</td><td>#D8537</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur de plaques</td><td>Heidolph Instruments</td><td>Rotamax 120</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbate 20</td><td>Sigma</td><td>#P7949</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps de détection monoclonale de lapin Anti-KDM1A (épitope C-terminal)</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>#672184BF-100</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire Donne conjugué à la peroxydase Anti-lapin IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>#31458</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre cuvette 1.5</td><td>Deltalab</td><td>#302100</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre pour cuvette</td><td>GE Healthcare</td><td>GeneQuant 1300</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Promega</td><td>#Z704A</td><td></td></tr><tr><td>Seringue</td><td>BD</td><td>#303172</td><td></td></tr><tr><td>Type 1 eau ultrapure</td><td>Millipore</td><td>Milli-Q Advantage A10</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur à ultrasons</td><td>VWR</td><td>USC200T</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure directe de l'engagement cible de kdm1a à l'aide d'immunossays à base de chemoprobe

Direct Measurement of KDM1A Target Engagement Using Chemoprobe-based Immunoassays

L'évaluation de l'engagement cible, défini comme l'interaction d'un médicament avec la protéine pour laquelle il a été conçu, est une exigence fondamentale pour l'interprétation de l'activité biologique de tout composé dans le développement de médicaments ou dans les projets de recherche fondamentale. En épigénétique, l'engagement des cibles est le plus souvent évalué par l'analyse des marqueurs proxy au lieu de mesurer l'union du composé à la cible. Les résultats biologiques en aval qui ont été analysés comprennent la modulation de la marque histone ou les changements d'expression génique. KDM1A est une lysine demethylase qui élimine les groupes méthyliques du H3K4 mono et diméthylé, une modification associée au silence de l'expression génique. La modulation des marqueurs proxy dépend du type de cellule et de la fonction de la composition génétique des cellules étudiées, ce qui peut rendre l'interprétation et la comparaison entre les cas assez difficiles. Pour contourner ces problèmes, un protocole polyvalent est présenté pour évaluer les effets de dose et la dynamique de l'engagement cible direct de KDM1A. Le test décrit fait usage d'une chimioprobe KDM1A pour capturer et quantifier l'enzyme décomplexée, peut être largement appliqué aux cellules ou des échantillons de tissus sans avoir besoin de modification génétique, a une excellente fenêtre de détection, et peut être utilisé à la fois pour la recherche fondamentale et l'analyse d'échantillons cliniques.

La linéarité de la détermination De Total et Free KDM1A.
Une série standard a été préparée comme décrit dans l'étape 5.3.2., utilisant 0 à 2500 pg de l'enzyme recombinante humaine de KDM1A. Les valeurs RLU de Total et Free rKDM1A ont été évaluées pour vérifier la linéarité (figure 2A et 2B). Les données sont représentées comme moyen de 3 expériences avec 3 répliques...

Ici, nous présentons un protocole pour mesurer l'engagement cible de KDM1A dans une cellule humaine ou animale, des échantillons de tissu ou de sang traités avec des inhibiteurs de KDM1A. Le protocole emploie le marquage de chemoprobe de l'enzyme libre de KDM1A et la quantification directe de l'occupation cible utilisant des immuno-tests à base de chemoprobe et peuvent être employés dans des études précliniques et cliniques.

Mesure directe de l'engagement cible de KDM1A à l'aide d'immunossays à base de chemoprobe

The assessment of the target engagement, defined as the interaction of a drug with the protein it was designed for, is a basic requirement for the ...

L’évaluation de l’engagement cible, c’est-à-dire l’interaction d’un médicament avec la protéine pour qui il a été conçu, est une exigence fondamentale pour l’interprétation de l’activité biologique de tout composé dans le développement de médicaments, ou dans des projets de recherche fondamentale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de mesurer directement l’effet de dose et la dynamique de l’engagement cible KDM1A, plutôt que des mesures des effets en aval tels que les marques d’histone et l’expression. Cette technique peut être appliquée dans la recherche fondamentale et aussi dans les essais cliniques, dans le SNC oncologique ou d’autres maladies soumises à un traitement avec inhibiteur de KDM1A pour étudier la pharmacodynamique.Cette technique est basée sur un chimioprobe développé pour étudier ORY-1001, iadademstat, mais peut être vraiment utilisé pour d’autres inhibiteurs KDM1A et la stratégie peut être appliquée à d’autres cibles. La procédure sera démontrée par Raquel Ruiz, directeur des opérations de la plate-forme de découverte PK/PD de mon laboratoire. Pendant le traitement cellulaire avec ORY-1001, le composé se lie à la protéine KDM1A présente dans le noyau.Pour commencer cette procédure, récupérez un aliquot à usage unique de 10 microlitres de la sonde biotinylée OG-881 de 20 millimolaires dans le réfrigérateur et laissez-le chauffer à température ambiante pendant 10 minutes. À l’aide d’un micropipet avec des pointes de filtre, diluer en série la solution de stock pour préparer la solution de travail deux micromolaires. Ensuite, dissoudre un comprimé d’inhibiteur de la protéase dans un millilitre de PBS dans un tube de microcentrifugeuse.Pour chaque millilitre du volume désiré de tampon de lyse de cellules 1x avec la chimioprobe, mélanger 100 microlitres de tampon de lyse de cellules 10x obtenus commercialement, 150 microlitres de l’inhibiteur de la protéase 10x, 12,5 microlitres des deux micromolaires OG-881 solution de travail et 737,5 microlitres d’eau distillée double de type 1. Les cellules sont lysées dans le tampon de lyse 1x en présence de la chimioprobe qui se lie à toute protéine KDM1A libre. Pour se préparer à partir de tissus, utilisez un mortier et un pilon qui sont refroidis sur la glace sèche pour pulvériser et homogénéiser un morceau cube de tissu congelé.Aliquot le tissu en flacons à usage unique, en s’assurant de transférer environ 40 milligrammes de poudre de tissu dans chaque flacon, tout en évitant la décongélation en tout temps. Conserver les échantillons à 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être traiter. Pour se préparer à partir de granulés cellulaires, résuspendez la pastille d’environ 10 millions de cellules dans 200 microlitres de tampon de lyse cellulaire 1x contenant 25 nanomolaires OG-881.Vortex chaque échantillon brièvement et les garder sur la glace pendant cinq minutes. À l’aide d’un sonicateur, sonifier les échantillons avec trois impulsions à 45 kilohertz d’une durée de 20 secondes chacune. Placez les échantillons sur la glace pendant 20 secondes entre les impulsions.Gardez les échantillons sur la glace pendant cinq minutes supplémentaires. Puis, vortex brièvement et centrifugeuse les échantillons à 14 000 fois G pendant 10 minutes dans une centrifugeuse qui est pré-réfrigérée à quatre degrés Celsius. À l’aide d’un micropipet d’un millilitre, transférer chaque supernatant dans un tube de microcentrifugeuse séparé de 1,5 millilitre.Laisser les tubes sur la glace pendant deux heures avant le traitement. Ensuite, quantifier la protéine indigène à l’aide de l’analyse bradford tel que décrit dans le protocole de texte. Une plaque totale est recouverte d’anticorps anti-KDM1A.La plaque libre est recouverte de streptavidine. Le lysate cellulaire est ensuite ajouté aux plaques et le complexe KDM1A est capturé directement ou par la chimioprobe. Les plaques sont lavées et incubées avec l’anticorps de détection anti-KDM1A et un anticorps secondaire couplé à la peroxyde de raifort.Enfin, le substrat luminescent est ajouté et le signal généré. Pour un total de KDM1A ELISA, préparez 10 millilitres d’anticorps de capture KDM1A dans PBS à une concentration finale de deux microgrammes par millilitre pour chaque plaque. Transférer 100 microlitres dans chaque puits de la plaque.Pour kDM1A ELISA gratuit, préparez 10 millilitres de streptavidine dans PBS comme une concentration de 10 microgrammes par millilitre pour chaque plaque. Transférer 100 microlitres dans chaque puits de la plaque. Ensuite, sceller chaque plaque avec un film adhésif et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius.Le lendemain, retirer les assiettes du réfrigérateur et laisser les équilibrer à température ambiante pendant environ 45 minutes. Lavez chaque assiette trois fois avec un tampon de lavage, en vous assurant de taper la plaque sur du papier absorbant après chaque étape de lavage pour enlever toute solution résiduelle. Ajouter 200 microlitres de tampon de blocage à chaque puits des deux plaques.Sceller les plaques avec du film adhésif et incuber à température ambiante pendant deux heures. Pendant ce temps, diluer les extraits de protéines indigènes précédemment obtenus avec PBS à la concentration appropriée et exposer la plaque pour préparer une courbe standard en utilisant rKDM1A humain tel que décrit dans le protocole de texte. Après l’incubation de deux heures est terminée, jeter le tampon de blocage et laver les plaques avec tampon de lavage, en s’assurant de taper la plaque sur des serviettes en papier après chaque étape de lavage pour enlever toute solution résiduelle.Transférez les échantillons dilués appropriés dans un bloc d’entreposage réfrigéré de 96 puits profonds suivant la distribution des plaques trouvée dans le tableau deux du protocole textuel. Gardez ce bloc sur la glace tout en pipetting 100 microlitres par puits dans le total et libre plaques ELISA suivant la distribution des plaques trouvées dans le tableau trois du protocole de texte. Incuber à température ambiante pendant une heure, puis jeter les échantillons et laver les assiettes cinq fois avec un tampon de lavage.Préparez 20 millilitres d’anticorps de détection anti-KDM1A de lapin en bloquant le tampon à une concentration de 0,125 microgramme par millilitre. Ajouter 100 microlitres de la solution d’anticorps de détection à chaque puits des deux plaques, à l’exception de ceux correspondant aux contrôles négatifs. Sceller les assiettes avec du film adhésif et incuber à température ambiante pendant une heure.Après cela, jetez la solution d’anticorps de détection et lavez les plaques six fois avec le tampon de lavage. Préparez 25 millilitres d’anticorps secondaire anti-lapin de chèvre, HRP, à une dilution de 1 à 5000 dans le tampon bloquant. Ajouter 100 microlitres de la solution d’anticorps secondaire à chaque puits des plaques de microtiter et incuber à température ambiante pendant une heure.30 minutes avant la fin de cette incubation, mélanger des parties égales d’exhausteur de luminol et de solution de peroxyde dans une bouteille d’ambre dans des conditions de lumière douce. Laissez ce mélange à température ambiante. Lorsque l’incubation d’une heure est terminée, jetez la solution d’anticorps secondaire et lavez les assiettes six fois avec un tampon de lavage.Ensuite, pipet 100 microlitres de la solution de travail luminol à chaque puits des plaques, en s’assurant de pipet très lentement pour éviter la formation de bulles. Utilisez une interminable pour contrôler le temps entre l’ajout de la solution et la mesure de luminescence des plaques et garder ce temps constant pour obtenir une bonne reproductibilité inter-analyse. Sceller les plaques avec un film adhésif et une centrifugeuse à 500 fois G et à température ambiante pendant 45 secondes pour éliminer les bulles restantes.Incuber les assiettes sur un shaker à 100 rpm pendant une minute. Ensuite, retirez le film adhésif et insérez la plaque dans un lecteur de microplaque et laissez-la pendant trois minutes pour stabiliser la température à 25 degrés Celsius. Lisez les unités de luminescence relative de chaque analyse de plaque ELISA.Enregistrez et copiez les valeurs RLU brutes à partir des fichiers de feuilles de calcul de données brutes pour une analyse plus approfondie. Dans cette étude, une nouvelle ELISA basée sur la capture de chimioprobe KDM1A est utilisée pour mesurer directement l’engagement cible de KDM1A dans les cellules et les échantillons de tissus. Les valeurs RLU de rKDM1A total et gratuit sont évaluées pour vérifier la linéarité.Les valeurs RLU de KDM1A total et libre détectées chez les PBMCs humains de trois volontaires indépendants sont ensuite superposées à la courbe standard. Les cellules de la LAM sont cultivés selon les recommandations du fournisseur et sont traitées avec un véhicule ou un ORY-1001 à différentes concentrations. L’extrait de protéine indigène sont obtenus en présence de 25 millimolaires OG-881 chemoprobe et 0,5 microgramme de protéines totales est utilisé pour effectuer l’analyse de l’engagement cible.Le KDM1A total et gratuit est alors déterminé et les pourcentages d’engagement cible d’ORY-1001 à KDM1A sont calculés par rapport au véhicule. L’engagement cible KDM1A dose-sensible dans les PBMCs et dans le traitement de poumon des rats avec ORY-1001 par gavage oral, parent calculé le groupe de véhicule est montré ici. L’incubation ex vivo avec 25 nanomolaires ORY-1001 d’extraits de protéines pulmonaires du véhicule traités animaux, donne te complet, encore, mais n’augmente pas davantage TE dans les échantillons de rats traités pendant quatre jours avec 30 microgrammes par kilogramme ORY-1001, confirmant KDM1A était déjà entièrement inhibé in vivo.Ce protocole évalue l’engagement cible de KDM1A en mesurant la KDM1A gratuite et totale. Rappelez-vous qu’il nécessite l’extraction de protéines indigènes. Cette technique peut être utilisée sur des échantillons de différentes espèces pour évaluer un inhibiteur spécifique, également pour dépister de nouveaux inhibiteurs.La chimioprobe utilisée dans cette étude peut également être appliquée à la chimioprotéomique pour étudier l’interactum KDM1A. N’oubliez pas de travailler en toute sécurité et de respecter en tout temps les mesures préventives lors de la manipulation d’échantillons biologiques et de composés bioactifs comme l’inhibiteur du KDM1A.

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