Interroger les centres germinatifs autoréactifs individuels par Photoactivation dans un modèle mixte chimérique de l’auto-immunité

Ce modèle chimérique physiologiquement pertinent des centres germinaux autoréactifs spontanés permet de relier la localisation cellulaire in vivo aux analyses moléculaires en aval. Le principal avantage du modèle chimérique mixte des centres germinaux autoréactifs est sa nature polyvalente et marginale, permettant l’interrogation de pratiquement n’importe quel sous-ensemble cellulaire désiré ou voie moléculaire. La pertinence physiologique de ce modèle de développement auto-immune de la maladie permet de nouvelles idées qui peuvent aider à l’avancement de nouvelles thérapies.

Ce modèle de chimère de moelle osseuse peut être employé dans l’immunologie, l’immuno-oncologie, et la recherche de cellules souches. Le composant de photoactivation a une large utilisation, car il relie la localisation des tissus à l’analyse cellulaire en aval. La préparation et la reconstitution de la moelle osseuse et les étapes d’étiquetage in vivo et d’explantation des tissus sont toutes des procédures techniquement complexes qui se prêtent bien aux démonstrations visuelles.

Pour extraire le donneur 564Igi fémur de souris et tibia, enlever la peau d’un membre postérieur, et sortir les articulations du genou et de la cheville en tirant sur le pied avec force. Procéder à la rupture de l’articulation de la cheville. Puis, tirez le pied vers le corps tout en tenant sur le tibia, dépouillant ainsi les tendons et les muscles du tibia.

Casser l’articulation du genou pour libérer le tibia, et tirer l’os vers le corps tout en tenant le fémur pour dépouiller les tendons et les muscles du fémur. Ensuite, faire une incision à l’articulation de la hanche, et couper les tendons avant de tirer le fémur de la prise de la hanche. Après avoir enlevé les os contralatéraux des membres postérieurs d’une manière similaire, frottez soigneusement les os avec une serviette en papier grossier pour enlever tout muscle et tissu conjonctif restants, et rincez les os dépouillés dans le tampon de moelle osseuse glacée.

Ensuite, utilisez dumont numéro sept forceps pour transférer les os dans un récipient de tampon de moelle osseuse fraîche sur la glace. Pour extraire les cellules de moelle osseuse, rincer un mortier dans un tampon de moelle osseuse glacée et utiliser une pipette sérologique de 10 millilitres pour remplacer le tampon de lavage par 10 millilitres de tampon de moelle osseuse fraîche et glacée. Utilisez les forceps pour transférer les os au mortier, et utilisez un pilon pour écraser et moudre les os pour libérer la moelle osseuse.

Utilisez la pipette de 10 millilitres pour recueillir l’extrait de moelle osseuse avant de passer la solution de moelle osseuse à travers une passoire cellulaire de 70 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres sur la glace. Rincez ensuite le mortier avec 10 millilitres supplémentaires de tampon de moelle osseuse fraîche et glacée pour assurer une récupération complète des cellules. Pour préparer les suspensions du donneur, mélanger les volumes appropriés de GFP photoactivatable et de moelle donatrice 564Igi dans un tube conique de 50 millilitres, et pelleter les cellules par centrifugation.

Resuspendez la pastille à cellules mélangées à une concentration d’une fois 10 à huit cellules par millilitre de tampon de moelle osseuse glacée, et transférez les cellules dans un tube de microcentrifugeuse précoolé de 1,5 millilitre sur la glace. Ensuite, confirmez un manque de réponse au pincement des pieds chez la souris receveur anesthésiée cd45.1, et feuilletez le tube des cellules de moelle osseuse du donneur pour assurer une résuspension adéquate. Chargez 200 microlitres de moelle osseuse se mélangent en une seringue d’insuline de 0,3 millilitre et de calibre 30, et, avec le receveur sur le côté, étirez doucement la peau au-dessus et au-dessous de l’œil pour faire éclater légèrement l’œil.

Insérez soigneusement la pointe de la seringue à un angle d’environ 30 degrés à l’avant de la orbite, en prenant soin d’éviter l’œil et les tissus environnants. Lorsque le bout de l’aiguille touche l’os en soulignant la prise de l’œil, rétractez l’aiguille d’environ 0,5 millimètre avant d’utiliser une pression constante pour injecter lentement la moelle osseuse du donneur. Ensuite, retourner la souris dans sa cage avec de l’eau antibiotique ad libitum, avec surveillance jusqu’à la récupération complète.

Pour étiqueter le ganglion lymphatique popliteal, diluer deux microlitres d’anticorps cd169 de rat étiqueté phycoerythrine dans 18 microlitres de PBS, et ajouter deux gouttelettes de 10 microlitres de l’anticorps sur un morceau de film en plastique de paraffine. Chargez chaque gouttelette dans une seule seringue à insuline de 0,3 millilitre avec une aiguille de calibre 30 et injectez 10 microlitres d’anticorps dans le pied de l’animal receveur anesthésié. Avant de récolter le ganglion lymphatique, placez un coverslip carré sur une surface plane, et utilisez une seringue vide chargée de graisse de cinq millilitres pour tracer les bords du coverslip avec de la graisse d’environ un à deux millimètres de chaque bord.

Transférer la chambre sur une surface froide et plane et remplir la chambre de graisse sous vide d’un tampon de moelle osseuse glacée. Pour accéder aux ganglions lymphatiques popliteal, utilisez des ciseaux droits et fins pour faire une incision dans la peau juste en dessous de la fosse du genou de l’animal receveur euthanasié, et étendre la coupe vers le haut le long de la ligne des ischio-jambiers presque jusqu’à l’articulation de la hanche. En utilisant dumont numéro cinq ou numéro sept forceps, tirez chacun des volets exposés de la peau vers l’extérieur pour exposer le tissu dans le fossa popliteal, et utilisez les forceps pour entrer soigneusement dans la fossa juste médiale à la veine popliteal.

Ouvrez et fermez les forceps le long de l’axe de la jambe pour exposer le ganglion lymphatique popliteal sous-jacent avant d’utiliser le pouce et l’index pour pincer le muscle de quadriceps du côté avant proximal au genou, pour faire éclater le ganglion lymphatique hors de la fossa. Faites glisser les forceps sous le ganglion lymphatique pour libérer le nœud du tissu environnant et placez-le dans la chambre à graisse sous vide. Après que le deuxième ganglion lymphatique a été recueilli, placez un deuxième coverslip sur la jante de graisse de vide, et appuyez doucement vers le bas pour fermer la chambre, prenant soin d’extruder toutes les bulles d’air.

Pour identifier les centres germinaux dans les échantillons de tissu de rate récoltés, placez la chambre d’imagerie sur la scène d’un microscope fluorescent à deux photons et utilisez une pipette de transfert en plastique de 3,5 millilitres pour placer une goutte d’eau distillée sur le dessus de la couverture supérieure. Abaissez l’objectif jusqu’au point de contact et utilisez la lumière transmise pour vous concentrer sur le haut du tissu. Passez au mode sombre et à l’excitation à deux photons, et réglez le laser à 940 nanomètres.

Localiser les zones individuelles de pulpe blanche bordées par la coloration CD169 près de la surface du tissu, et identifier la gaine lymphoïde périartériole par la deuxième génération harmonique associée à l’artériole central. Dans la zone entre la gaine lymphoïde périartériole et la zone marginale, identifier la présence de macrophages à corps tingible hautement autofluorescent et activé et, à l’aide de ces repères, dessiner une région d’intérêt autour d’une seule zone centrale germinale. Ensuite, installez une pile Z d’environ 100 à 150 micromètres de profondeur, à partir de la surface du tissu et en utilisant une taille d’étape d’environ trois micromètres avant de passer à une longueur d’onde d’excitation de 830 nanomètres.

Éteignez ou assombriz tous les canaux pour éviter les photodamages aux détecteurs et imagez la pile. Ensuite, revenez à la longueur d’onde excitation de 940 nanomètres, et rouvrir les canaux, la numérisation à travers la pile pour confirmer une photoactivation efficace et une absence de photodamage dans toute la pile d’images. Le sérotypage des chimères mélangées de moelle indique les nombres normalisés de cellules de B à six semaines après reconstitution, avec une basse fréquence des cellules B circulant 9D11-positives dérivées du compartiment 564Igi.

Dans la porte totale de lymphocyte, il y avait une basse fréquence des cellules destinataire-dérivées résiduelles, environ 6%dont sont CD45.1-dérivées, indiquant un degré global de chimérisme d’environ 94%Il y avait un chimérisme pratiquement complet dans le compartiment de cellules B et une dominance des cellules B photoactivatables GFP-dérivées de moelle, une conséquence de la sélection négative lourde des cellules B 564Igi-dérivées. Comme on l’a observé, l’étiquetage in vivo avec CD169 facilite une visualisation robuste de la zone marginale. Le deuxième signal harmonique est apparent dans les éléments structurels collagène-contenants et les vaisseaux principaux, y compris l’artériole central de la gaine lymphoïde periarteriolar et les macrophages tingibles-corps fortement autofluorescents et activés liés à l’activité germinale de centre.

Prises dans leur ensemble, ces données permettent l’identification d’une région d’intérêt qui contient probablement un seul centre germinal photoactivatable. L’évaluation cytométrique de flux en aval confirme en outre la présence des nombres normalisés de compartiment de cellules de B, d’une population germinale spontanée de centre, et d’un sous-ensemble des cellules germinales photoactivées de centre B. Il est important de limiter à quatre à six heures le délai total d’exécution des étapes d’explantation, de photoactivation et de traitement des tissus afin d’assurer une viabilité cellulaire suffisante.

Les cellules photoactivées peuvent être triées sur le flux et soumises à un séquençage à cellule unique pour, par exemple, caractériser le répertoire des récepteurs cellulaires B d’un seul centre germinal. Le modèle mixte de chimère a permis l’exploration de la biologie germinale autoréactive du centre à une nouvelle profondeur, par exemple, donnant un aperçu de la façon dont le processus de propagation de l’épitope se déroule. Notez que la source de lumière pour la microscopie à deux photons sont des lasers pulsés très puissants de classe 4 qui peuvent endommager gravement les yeux.