Visualisation des complexes mitophatonus endogènes in situ dans les cellules bêta pancréatiques humaines utilisant l'analyse de la ligation de proximité

Ce protocole nous permet de surveiller les complexes endogènes de mitophagie dans les tissus humains tels que les cellules bêta, facilitant la recherche sur la mitophagie dans les tissus pivots pertinents à la traduction. Un avantage de cette technique est sa capacité à visualiser d’importants complexes de mitophagy in vivo dans les tissus avec une disponibilité rare ou en petit nombre d’échantillons. Après isolement selon les protocoles standard, la culture quatre à six fois 10 à la troisième équivalente des îlots humains en 10 millilitres de milieu complet de l’îlot pancréatique pendant au moins une journée à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, utilisez un microscope à lumière dissection à trois fois grossissement pour compter les îlots humains individuels dans la culture. Choisissez 40 îlots par traitement ou condition d’intérêt dans des tubes de 1,5 millilitre de milieu d’îlot. Sédimenter les îlots par centrifugation et réutiliser la pastille en un millilitre de PBS complété par 50 micromolaires PR619.

Inverser le tube et recueillir les îlots par centrifugation pour un deuxième lavage en PBS frais plus inhibiteur de la deubiquitinase. Après la deuxième centrifugation, dissocier les îlots en cellules individuelles avec 125 microlitres de 0,25% trypsine plus inhibiteur pendant trois minutes à 37 degrés Celsius avec pipetting périodique douce. À la fin de l’incubation, arrêter la réaction avec un millilitre de 37 degrés Celsius chaud milieu de l’îlot pancréatique complété par PR619.

Recueillir les îlots par centrifugation pour deux lavages en PBS frais plus inhibiteur par lavage. Après le deuxième lavage, resuspendez les îlots dissociés dans 150 microlitres de PBS frais plus inhibiteur. Pour l’adhérence et la fixation des îlots individuels, cytospin la solution cellulaire sur les diapositives de microscope chargées givrés et décrire la zone cellulaire avec un stylo hydrophobe.

Puis fixer les cellules encerclées avec 4% de paraformaldéhyde et PBS pendant 15 minutes à température ambiante. Pour l’analyse immunohistochimique des échantillons d’îlots, lavez les cellules avec deux lavages de cinq minutes en PBS à température ambiante, suivis d’un blocage de liaison non spécifique avec sérum d’âne à 10% et PBS plus 0,3% détergent pendant une heure à température ambiante. À la fin de l’incubation de blocage, cocuber les cellules avec l’anticorps primaire de souris contre la peptidase ubiquitine-spécifique 8, l’anticorps primaire de lapin contre la protéine de dégradation de récepteur de neuregulin-1, et un marqueur spécifique pour l’identification de cellules bêta qui n’a pas été soulevé dans la souris ou le lapin afin de ne pas interférer avec le signal d’essai de ligature de proximité pendant la nuit à quatre degrés Celsius.

Le lendemain matin, lavez les échantillons avec deux lavages de cinq minutes en PBS sur un rocker. Ajouter l’anticorps secondaire anti-chèvre Cy5 à une solution d’analyse de ligature de proximité fraîchement préparée. Après le deuxième lavage, étiquetez chaque échantillon d’îlot avec 20 microlitres de solution de sonde et récupérez les glissières avec du film plastique pour une incubation d’une heure à 37 degrés Celsius.

À la fin de l’incubation, laver les cellules avec deux lavages de cinq minutes dans le tampon A sur un rocker suivi de l’incubation avec 20 microlitres de solution de ligature fraîchement préparée complétée par 0,25 unités par microlitre de ligase par diapositive pour une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de la ligature, laver les cellules deux fois avec le tampon A pendant deux minutes par lavage. Couvrir chaque échantillon de 20 microlitres de solutions d’amplification complétées par de la polymése pour une incubation de 100 à 120 minutes à 37 degrés Celsius.

Pour préparer les cellules à l’imagerie, lavez les échantillons deux fois dans le tampon A frais pendant 10 minutes par lavage sur un rocker suivi d’un lavage en tampon B de 0,1 x pendant deux minutes sur le rocker. Après le dernier lavage, monter les diapositives avec une goutte de milieu de montage contenant DAPI et placer soigneusement un coverslip sur chaque échantillon à l’aide d’un scalpel pour presser toutes les bulles. Ensuite, sceller les coverslips avec du vernis à ongles clair sur les bords.

Pour l’image des échantillons, placez une diapositive sur la scène d’un microscope capable de capturer plusieurs plans focaux et sélectionnez le grossissement 100 fois. Réglez la hauteur de la pile Z à environ 0,45 micromètre et les paramètres appropriés d’excitation et d’émission des signaux cellulaires, des contre-taches et des cellules vivantes. Obtenez au moins neuf images de plan focal différentes.

Pour s’assurer que les signaux de fond d’image de fluorescence et la lumière parasite sont réduits au minimum, traitez les images utilisant un algorithme voisin bidimensionnel de déconvolution le plus proche utilisant un logiciel standard de traitement d’image de choix. Pour quantifier les interactions d’analyse de ligature de proximité, ouvrez ImageJ et ouvrez l’image d’analyse de ligature de proximité. À partir de la première image fortement mise au point, cliquez sur Image et sélectionnez Ajuster et Seuil.

Ajustez le seuil pour supprimer tout le signal d’analyse de ligature de proximité non spécifique et notez l’ajustement du seuil pour essayer de garder le signal cohérent tout au long de l’analyse. Cliquez sur Processus et sélectionnez Binaire et Faire binaire. Confirmez que la taille est définie à zéro à l’infini, circularité est définie à zéro à un, Afficher est défini sur les contours et vérifier les résultats d’affichage et effacer les boîtes de résultats.

Notez le nombre de particules analysées dans une feuille de calcul désignant l’échantillon et la position de la pile Z. Cliquez ensuite analyser et analyser les particules pour mesurer les particules. Lorsque toutes les piles Z de l’échantillon ont été analysées, envoyez le nombre total de particules pour l’échantillon dans la feuille de calcul pour quantifier le nombre total d’interactions.

Les anticorps utilisés dans l’analyse de proximité sont spécifiques pour les ligands et ne démontrent aucun chevauchement. Comme nous l’avons observé, le protocole de dispersion est très efficace pour obtenir des cellules individuelles dans le champ de vision du microscope pour l’analyse en aval et la coloration des cellules bêta est conservée à la suite de taches d’analyse de ligature de proximité dans les îlots humains primaires. En utilisant les techniques démontrées, on pourrait déterminer que l’interaction de la protéine de dégradation des récepteurs de la neuréguline-1 et de la peptidase 8 spécifique à l’ubiquitine est diminuée après une exposition de 48 heures au palmitate, soulignant la faisabilité de cet essai pour évaluer les principaux facteurs de mitophagie endogène suivant les stimuli diabétogéniques.

La dispersion efficace et douce des îlots humains est essentielle pour assurer la quantification des populations cellulaires correctes en aval. L’APL permet l’évaluation d’importants complexes de mitophagie dans des échantillons d’îlots humains permettant l’analyse de la mitophagie et d’échantillons de patients humains d’importance biologique qui déplacent le domaine de la recherche sur le diabète vers l’avant.