Name: Opsonophagocytic meurtre dosage pour évaluer les réponses immunologiques contre les bactéries pathogènes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Apprenez le dosage d'opsonophagocytose pour évaluer l'efficacité des anticorps contre Streptococcus pneumoniae. Cette méthode standard mesure l'activité phagocytaire des cellules immunitaires et valide les stratégies immunothérapeutiques.

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Nous remercions m. Moon Nahm (Université de l’Alabama, Birmingham) pour son aide précieuse dans l’établissement de tests OPKA dans notre laboratoire. Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de santé Grant 1R01AI123383-01 a 1 à FYA.

1. culture, différenciation et la Validation des cellules HL-60

<ol><li>Préparation des milieux de culture de cellules HL-60 composée de 500 mL RPMI avec la L-glutamine et 50 mL inactivés par la chaleur sérum de veau fœtal. N’ajoutez pas d’antibiotiques car cela peut affecter la différenciation des cellules HL-60.</li>
	<li>Pour propagation/maintenance des cellules HL-60, la culture 5 x 106 cellules dans 10 mL de milieux de culture cellulaire HL-60 à 75 cm2 ventilés flacons à 37 ° C et 5 % de CO2. Le passage des cellules tous les jours 3−4 pour maintenir la concentration cellulaire optimal. Remarque : La concentration cellulaire ne devrait pas dépasser 5 x 106/ml.</li>
	<li>Produire des stocks de travail des cellules HL-60 par aliquotage environ 1 x 106 cellules/mL dans les milieux de culture HL60 avec 10 % de diméthyl sulfoxide (DMSO) dans des tubes cryogéniques de 1 mL. Remarque : Les stocks de travail peuvent être conservés à-80 ° C. Le stock principal doit être conservé à-120 ° C.</li>
	<li>Différencier les cellules HL-60 par culture 1,5 x 107 cellules dans 15 mL de milieux de culture cellulaire HL-60 avec 0,6 % N, N-diméthylformamide (DMF) à 37 ° C et 5 % de CO2 dans des flacons stériles diablotin filtre 75 cm2 pendant 3 jours avant OPKA.</li>
	<li>Valider que les cellules HL-60 ont été différenciés avec succès et sont appropriés pour une utilisation dans l’essai OPKA par des tests de viabilité et marqueurs de surface cellulaire selon débit établi cytometry protocoles16,17, 18,19. Après différenciation, récolter les cellules HL-60 et tache environ 1 x 104 cellules avec anticorps/taches conjugué fluorescent pour CD71, CD35, annexin V et l’iodure de propidium. Remarque : Les cellules différenciées devraient être ≥65 viable, ≥55 % CD35+et ≤ 20 % CD71+ tel que déterminé par mis en place de protocoles de validation14 (Figure 1).</li>
</ol>
2. Elaboration d’OPKA tampons et réactifs

<ol><li>Préparer 50 mL de tampon stérile opsonisation B (OBB) en mélangeant 42,5 mL stérile 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec Ca2 +/Mg2 +5 mL de sérum de veau fœtal inactivés par la chaleur et 2,5 mL de 0,1 % de gélatine stérile. Conserver à 4 ° C.</li>
	<li>Obtenir le lapin bébé complément et conserver à-80 ° C.</li>
	<li>Obtenir ou préparer des plats de culture bactérienne (c.-à-d., 15 x 100 mm2 5 % brebis géloses au sang).</li>
</ol>
3. préparation des échantillons de Stock bactériennes

<ol><li>Obtenir un stock de la souche bactérienne (s) à tester. Remarque : Pour ce protocole, sérotype 3 Streptococcus pneumoniae (automatismes WU2, généreusement fournis par Dr Moon Nahm) est utilisé.</li>
	<li>Cultiver la souche bactérienne dans un bouillon approprié (bouillon de Todd-Hewitt + 0,5 % d’extrait de levure pour cette souche automatismes WU2) pour environ 2−4 h à 37 ° C. Remarque : La densité optique à 600 nm (OD600) de la culture doit être comprise entre 0,6 et 0,8.</li>
	<li>Les bactéries de granule par centrifugation à 6 000 x g pendant 2 min et remettre en suspension les cellules de 10−30 mL de 15 % de glycérol dans le bouillon approprié. Aliquote la culture bactérienne (500 µL par aliquote) dans des tubes à centrifuger stérile de 1,5 mL et conserver à-80 ° C.</li>
	<li>Dégeler un flacon de stock bactérienne dans un bain-marie à 37 ° C. Les cellules bactériennes de granule et remettre en suspension dans 500 µL de OBB dans des conditions stériles.</li>
	<li>Préparer des dilutions différentes du stock bactérienne dans OBB (10 µL d’aucune dilution, 10 µL de 01:10, 10 µL de 1/100, etc..). Effectuez le test OPKA (art. 4-6, y compris co-culture HL-60/complément) tel que décrit ci-dessous à l’aide de diverses dilutions du stock bactérienne non traitée. Culture les plaques pendant la nuit à 30 ° C (pas de CO2). Remarque : La température de 30 ° C est spécifique pour les automatismes WU2 empêcher la prolifération ; autres souches/sérotypes peuvent croître optimale à 37 ° C.</li>
	<li>Compter les colonies pour chaque dilution du stock de bactérienne non traitée conjointement mis en culture avec complément et cellules HL-60. Déterminer quelle dilution des bactéries donne le nombre optimal de colonies dénombrables (environ 80−120 UFC pour les bactéries non traitées conjointement mis en culture avec cellules HL-60). Notez cette dilution pour les futurs OPKAs impliquant ce stock bactérien.</li>
</ol>
4. culture et traitement contre les bactéries

<ol><li>Décongeler un tube de stock bactérienne préparée à l’étape 3.3. Bactéries (6 000 x g pendant 2 min) de granule et resuspendre le culot dans OBB à une dilution optimale tel que déterminé à l’étape 3.6.</li>
	<li>Distribuer 10 µL de suspension bactérienne dilution / puits dans une plaque de culture de cellules de 96 puits fond rond.</li>
	<li>Ajouter 20 µL du traitement approprié d’anticorps ou de la drogue dans chaque puits expérimental en double exemplaire. Remarque : Dans le présent protocole, un anticorps spécifique au sérotype généré chez la souris est ajouté comme traitement X et une enzyme de glycoside hydrolase connue pour dégrader la capsule de polysaccharide 3 sérotypes est ajoutée comme traitement Y (Figure 2)4,20. Pour les puits de contrôle, utiliser 1 x PBS ou OBB, fonction de la mémoire tampon utilisée pour les puits de traitement.</li>
	<li>Secouez la plaque d’échantillon à environ 90 tr/min pendant 1 h à température ambiante. Réglez ces conditions selon la température optimale ou agitation des traitements à l’essai.</li>
</ol>
5. HL-60 co-culture bactérienne

<ol><li>Préparer les cellules HL-60 en récoltant les cellules HL-60 différenciés qui sont traités avec DMF trois jours avant (voir l’étape 1.4) dans des tubes coniques 15 mL. Les cellules (500 x g, 3 min) à pellets, éliminer le surnageant et laver au moins 10 ml de PBS 1 x.</li>
	<li>Les cellules lavées (500 x g, 3 min) à pellets, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules OBB (commencer avec 1 mL OBB et ajuster pour une concentration finale de 1 x 107/ml après comptage de cellules).</li>
	<li>Ajouter bébé lapin complément (sérum de lapin bébé stérile, non dilué, âge 3−4 semaines) à un volume final de 1:5. Remarque : La concentration finale du mélange HL-60-complément devrait être de 1 x 107/ml. Si test complément dépendance, on peut utiliser une seconde solution contenant des cellules actives de HL-60 avec complément inactivés par la chaleur (complément peut-être être inactivée par incubation dans un bain-marie à > 55 ° C pendant au moins 30 min).</li>
	<li>Après que 1 h culture bactérienne est complet (étape 4.4), diviser chaque échantillon (p. ex., 10 µL de chaque échantillon de 30 µL dans deux nouveaux puits) en puits dédoublés pour deux groupes (c.-à-d. utilisation seulement 20 µL de la co-culture 30 µL original pour tenir compte de l’erreur de pipettage) : un ensemble seront conjointement cultivé avec HL-60-complément et on comprendra seulement les bactéries. Ajouter 50 µL du mélange HL-60-complément (de l’étape 5.3) à chaque jeu expérimental de puits (délégué + HL-60) ; ajouter 50 µL de OBB seul dans les puits de bactéries seulement (déléguée -HL-60). Remarque : Pour cet exemple, environ 800 CFU bactériennes est utilisés pour la co-culture initiale avec cellules HL-60 de 5 x 10550 µL. Si cette multiplicité d’infection est trop élevée ou trop basse, comme indiqué par le nombre de colonies final, ajuster la dilution initiale bactérienne plutôt que le nombre de cellules HL-60.</li>
	<li>Secouer la plaque à 96 puits à 37 ° C pendant 1 h (pas de CO2).</li>
</ol>
6. l’échantillon électrodéposition et Incubation durant la nuit

<ol><li>Diluer chaque puits 1:5 avec OBB, afin que chaque échantillon a un volume d’au moins 50 µL.</li>
	<li>Distribuer 50 µL de chaque échantillon directement sur une zone désignée d’une plaque de culture bactérienne, assurer un espacement adéquat entre les échantillons. Pour 15 x 100 mm2 ronds plats d’agar, échantillons de pipette environ 4 sur une plaque.</li>
	<li>Couvrir et laisser sécher pendant environ 15 min à température ambiante, les échantillons.</li>
	<li>Inverser les plaques et la culture du jour au lendemain à 30 ° C (pas de CO2). Alternativement, la culture des plaques dans des bocaux anaérobies pour vérifier si des conditions anoxiques affectent la croissance bactérienne ou de contrôle pour la morphologie.</li>
	<li>Après une culture, compter les colonies dans chaque zone désignée. Analyser des données en comparant le nombre de cellules vivantes dans chaque série pour le contrôle correspondant et/ou des échantillons qui ne reçoivent pas de co-culture de cellules HL-60 (l’indicatif de la survie des cellules de 100 %, 0 % de cellules mise à mort).</li>
</ol>

<ol><li>Romero-Steiner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+an+opsonophagocytic+assay+for+the+measurement+of+functional+antibody+activity+against+Streptococcus+pneumoniae+using+differentiated+HL-60+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).</li>
<li>Nanra, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsular+polysaccharides+are+an+important+immune+evasion+mechanism+for+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+and+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).</li>
<li>Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+of+Pseudomonas+aeruginosa+pyelonephritis+in+neutropenic+mice+with+human+antilipopolysaccharide+monoclonal+antibody+and+cefsulodin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin.</a> Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).</li>
<li>Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Hydrolysis+of+Pneumococcal+Capsular+Polysaccharide+Renders+the+Bacterium+Vulnerable+to+Host+Defense%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense.</a> Infection and Immunity. , (2018).</li>
<li>Baker, C. J., Noya, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+use+of+intravenous+immune+globulin+for+group+B+streptococcal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection.</a> Reviews of Infectious Diseases. 12, Suppl 4 476-482 (1990).</li>
<li>Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+opsonic+and+nonopsonic+serotype+3+pneumococcal+capsular+polysaccharide-specific+monoclonal+antibodies+against+intranasal+challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice.</a> Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).</li>
<li>Parameswarappa, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Semi-synthetic+Oligosaccharide+Conjugate+Vaccine+Candidate+Confers+Protection+against+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+3+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection.</a> Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).</li>
<li>Jackson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+clinical+trial+of+a+single+versus+a+double+dose+of+13-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+adults+55+through+74+years+of+age+previously+vaccinated+with+23-valent+pneumococcal+polysaccharide+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine.</a> Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).</li>
<li>Cywes-Bentley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+to+a+conserved+antigenic+target+is+protective+against+diverse+prokaryotic+and+eukaryotic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).</li>
<li>Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+HL-60+cell+line+to+measure+opsonic+capacity+of+pneumococcal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).</li>
<li>Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+differentiation+of+human+promyelocytic+leukemia+cells+induced+by+dimethyl+sulfoxide+and+other+polar+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).</li>
<li>Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+novel+therapeutic+approach+to+treating+severe+pneumococcal+infection+using+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).</li>
<li>Dwyer, M., Gadjeva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsonophagocytic+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Opsonophagocytic assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).</li>
<li>Burton, R. L., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+fourfold+multiplexed+opsonophagocytosis+assay+for+pneumococcal+antibodies+against+additional+serotypes+and+discovery+of+serological+subtypes+in+Streptococcus+pneumoniae+serotype+20%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunololgy%22%5BJournal%5D)">Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20.</a> Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).</li>
<li>Clarke, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost%2C+high-throughput%2C+automated+counting+of+bacterial+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies.</a> Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).</li>
<li>Aanei, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Database-guided+Flow-cytometry+for+Evaluation+of+Bone+Marrow+Myeloid+Cell+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e57867(2018).</li>
<li>Hirz, T., Dumontet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Isolation+and+Analysis+to+Determine+their+Role+in+Lymphoma+Cell+Sensitivity+to+Therapeutic+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visulaized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents.</a> Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846(2016).</li>
<li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+annexin+V%2Fpropidium+iodide+apoptosis+assay+for+accurate+assessment+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2597(2011).</li>
<li>Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+HL-60+promyelocytic+leukemia+cells%3A+simultaneous+determination+of+phagocytic+activity+and+cell+cycle+distribution+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry.</a> Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).</li>
<li>Middleton, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+the+Streptococcus+pneumoniae+type+3+capsule-specific+glycoside+hydrolase+of+Paenibacillus+species+32352%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352.</a> Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

OPKAs servir un rôle essentiel dans l’évaluation de médiation immunitaire d’anticorps induits par les vaccins6,8. La signification fondamentale de ce OPKA simplifiée est la capacité d’adaptation dans les conditions à tester (anticorps, traitements enzymatiques, etc..). En ce sens, bien que ce test peut être utilisé pour tester la contribution des opsonines (c.-à-d., anticorps) dans la phagocytose, également utilisable pour évaluer les moyens de surmonter les fact...

L’opsonophagocytic tuant assay (OPKA) est un outil essentiel permettant de relier des altérations de la structure bactérienne ou une fonction aux modifications ultérieures dans la réponse immunitaire et la fonction. À ce titre, il sert souvent une analyse complémentaire afin de déterminer l’efficacité immunitaire basé sur des traitements d’anticorps, vaccins expérimentaux, optimisation de l’enzyme, etc.. Alors que les essais in vivo sont nécessaires pour déterminer la clairance apparente ou protection dans un modèle d’infection bactérienne, le OPKA peut être utilisé pour évaluer la contribution immunisée à la mort de la cellule bactérienne composants à la base : les bactéries, les cellules immunitaires et expérimentale traitements. Des études antérieures ont montré que OPKAs peuvent être modifiées et utilisés pour une variété de bactéries et sérotypes, dont Streptococcus pneumoniae1, Staphylococcus aureus,2,3de la Pseudomonas aeruginosa. En outre, ces dosages optimisés peuvent servir à évaluer différents traitements expérimentaux, y compris la capacité d’une enzyme pour faciliter l’accès aux cellules immunitaires médiée par le complément4 anticorps traitements et pour améliorer la bactérie opsonisation5. Classiquement, le dosage OPKA a été utilisée avec succès dans la recherche fondamentale et clinique paramètres comme un puissant indicateur de protection induite par des anticorps spécifiques6,7,8,9 .
Différents types de cellules immunitaires peuvent servir pour l’évaluation de l’assassinat d’opsonophagocytic. Une population phagocytaire couramment utilisée est la ligne de cellules leucémiques humaines HL-60. Cette lignée cellulaire peut être gardée comme promyélocytes inactivé en culture ; Toutefois, ils peuvent être différenciés dans divers États activés par l’intermédiaire de différents médicaments traitements10,11. Traitement des HL60 avec N, N-diméthylformamide différencie de la lignée cellulaire en neutrophiles activés avec forte activité phagocytaire11. Tandis que les cellules HL-60 ont été optimisés et sont fréquemment utilisés pour ces essais de phagocytose10, autres leucocytes polymorphonucléaires primaires peuvent être utilisés comme le bras immunitaire de l' expérience12.
En outre, ces tests peuvent être simplifiées13 ou multiplexés14 à regarder de nombreuses souches résistantes aux antibiotiques des bactéries à tester. La méthode multiplexée ont été réalisée en plus faisable grâce à l’élaboration d’un logiciel qui peut compter efficacement la colonie bactérienne formant des unités (UFC) par endroit sur une plaque de gélose15. Nous décrivons ici une méthode simplifiée utilisant une souche bactérienne, les cellules HL-60, complément de bébé lapin et géloses au sang. Avec cette méthode, plusieurs traitements peuvent être évalués rapidement pour répondre à des questions de recherche spécifiques sur la façon dont la réponse immunitaire innée à l’infection bactérienne peut être modulée.

<table><tbody><tr><td>Annexine V (conjuguée APC)</td><td>BioLegend</td><td>640919</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD35, humain (conjugué au PE)</td><td>BioLegend</td><td>333405</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD71, humain (conjugué au PE)</td><td>BioLegend</td><td>334105</td><td></td></tr><tr><td>souche bactérienne à utiliser (c’est-à-dire Streptococcus pneumoniae, WU2)</td><td>Laboratoire de référence respiratoire bactérienne (Dr. Moon Nahm)&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plaques de gélose sanguine</td><td>Hardy Diagnostic</td><td>A10</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Clone sérum</td><td>HyClone</td><td>SH30080.03</td><td></td></tr><tr><td>glycérol</td><td>Sigma</td><td>G9012-1L</td><td></td></tr><tr><td>HL-60 cellules</td><td>ATCC</td><td>CCL-240</td><td></td></tr><tr><td>IgG Isotype Control (PE conjugué)</td><td>BioLegend</td><td>400907</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diméthylformamide (DMF)</td><td>Fisher Produit chimique</td><td>UN2265</td><td></td></tr><tr><td>iodure de propidium</td><td>Sigma</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>RPMI média avec L-glutamine</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

opsonophagocytic meurtre dosage pour évaluer les réponses immunologiques contre les bactéries pathogènes

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Un aspect clé de la réponse immunitaire à une colonisation bactérienne de l’hôte est la phagocytose. Un test de mise à mort d’opsonophagocytic (OPKA) est une procédure expérimentale dans laquelle les cellules phagocytaires sont conjointement cultivés avec unités bactériennes. Les cellules immunitaires vont phagocyter et tuer les cultures bactériennes d’une manière dépendante du complément. L’efficacité de l’assassinat de cellule immunitaire dépend de plusieurs facteurs et peut être utilisée pour déterminer comment les différentes bactéries comparer les cultures en ce qui concerne la résistance à la mort cellulaire. De cette façon, l’efficacité du potentiel immunitaire base thérapeutique peut être évaluée contre les souches bactériennes spécifiques et/ou des sérotypes. Dans ce protocole, nous décrivons une OPKA simplifiée qui utilise des conditions de culture de base et de la cellule de comptage pour déterminer la viabilité cellulaire bactérienne après co-culture avec des conditions de traitement et HL-60 cellules immunitaires. Cette méthode a été utilisée avec succès avec un certain nombre de différents sérotypes pneumococciques, capsulaires et capsulée souches et d’autres espèces bactériennes. Les avantages du présent protocole OPKA sont sa simplicité, polyvalence (comme ce test n’est pas limité aux traitements d’anticorps comme opsonines) et la minimisation du temps et de réactifs pour évaluer les groupes expérimentaux de base.

Validation de la différenciation de la HL-60 doit être exécutée avant de commencer le OPKA. Ceci peut être accompli à l’aide de cytométrie de flux pour déterminer l’expression extracellulaire de CD11b, CD35, CD71 et l’annexin V (Figure 1). L’iodure de Propidium peut aussi servir comme un marqueur de viabilité. Après avoir été traités avec DMF pendant 3 jours, l’expression du CD35 devrait être augmentée (≥55 % de toutes les cellules) et expression du CD71 devrait être diminuée (≤ 20 % de tout...

Ce test de mise à mort d’opsonophagocytic est utilisé pour comparer la capacité des cellules immunitaires phagocytaires de répondre à et de tuer les bactéries issus des différents traitements et/ou des conditions. Classiquement, ce test sert de l’étalon-or pour évaluer les fonctions effectrices des anticorps contre une bactérie comme opsonine.

Opsonophagocytic meurtre dosage pour évaluer les réponses immunologiques contre les bactéries pathogènes

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Cet essai lie la modulation de la structure bactérienne et de la fonction à l’activité antibactérienne à base de cellules immunitaires. En tant que tel, un immunothérapeutique clé d’un traitement potentiel peut être évalué en déterminant la probabilité d’une meilleure dégagement bactérien. L’analyse opsonophagocytique de mise à mort sert traditionnellement d’étalon-or pour évaluer les fonctions efficaces des anticorps soulevés contre la bactérie comme obsonnants.Ce protocole offre simplicité et polyvalence par rapport aux analyses standardisées à haut débit existantes. Dans ce protocole, nous étudions les effets d’un traitement médicamenteux sur la pneumonie streptocoque et comment ces effets se traduisent par une phagocytose améliorée de la bactérie. Ici, nous appliquons l’OPKA aux cellules de pneumonie streptocoque.Cependant ce protocole peut être adopté pour évaluer le meurtre phagocytique d’autres agents pathogènes par les cellules immunitaires. Consacrez du temps à optimiser les stocks bactériens et à vous assurer que les CFC finaux à compter se trouvent dans la plage optimale. Nous recommandons fortement d’utiliser la cytométrie du débit pour nous assurer que les cellules HL60 sont viables et actives et d’essayer différentes conditions de culture pour assurer des cellules fonctionnellement actives.La démonstration visuelle permettra de mieux comprendre comment l’échantillon doit être plaqué et comment obtenir des échantillons dénombrés. Pour commencer, préparez des supports de culture cellulaire HL60 composés de 500 millilitres RPMI complétés par de la L-glutamine et de 15 millilitres de sérum bovin fœtal inactivé. Pour la propagation et le maintien des cellules HL60, la culture de cinq millions de cellules dans 10 millilitres de HL60 corps de culture cellulaire dans 75 centimètres carrés ventilés flacons à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone.Pour générer des stocks de travail de cellules HL60, ajouter environ un million de cellules par millilitre dans les médias de culture HL60 complétées par du sulfure de diméthyle de 10 % en tubes cryogéniques d’un millilitre. Pour différencier les cellules HL60, la culture 1,5 fois 10 aux sept cellules dans 15 millilitres de HL60 médias de culture cellulaire complétée par 0,6%DMF dans le filtre stérile plafonné 75 flacons centimètre carré à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant trois jours avant OPKA. Pour préparer les échantillons de bouillon bactérien, faire pousser la souche bactérienne WU2 dans un bouillon approprié pendant environ deux à quatre heures à 37 degrés Celsius.Ensuite, pelleter les bactéries par centrifugation à six mille fois G pendant deux minutes et resuspendre les cellules en 10 à 30 millilitres de 15% glycérol dans le bouillon approprié. Aliquot la culture des bactéries dans stériles 1,5 millilitres tubes centrifugeuses et stocker à 80 degrés Celsius. Ensuite, décongelez un flacon de bouillon bactérien dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius.Pelleter les cellules bactériennes et les résuser dans 500 microlitres d’OBB dans des conditions stériles. Les dilutions des plaques du stock bactérien non traité sur les plaques d’agar sanguin et la culture des plaques pendant la nuit à 30 degrés Celsius. Après l’étape d’incubation, compter les colonies pour chaque dilution du stock bactérien non traité co-cultivé avec les cellules HL60.Enregistrez quelle dilution des bactéries donne le nombre optimal de colonies dénombrées pour les futurs OPCA avec ce stock bactérien. Décongeler un tube de bouillon bactérien. Bactéries granulés à six mille fois G pendant deux minutes et de résuspendre la pastille cellulaire dans OBB à la dilution optimale obtenue dans l’étape précédente.Pipette 10 microlitres de la dilution bactérienne résuspendue par puits dans une plaque ronde de culture de cellules de 96 puits. Ensuite, ajoutez 20 microlitres d’un anticorps approprié ou d’un traitement médicamenteux à chaque puits expérimental en double. Pour les puits de contrôle, utilisez 1XPBS ou OBB selon le tampon utilisé pour les puits de traitement.Agiter la plaque d’échantillon à environ 90 rpm à température ambiante pendant une heure. Pour récolter les cellules différenciées HL60 qui sont traitées avec DMF trois jours avant, pelleter les cellules à 500 fois G pendant trois minutes. Jetez le supernatant et lavez la pastille avec au moins 10 millilitres de 1XPBS.Pelleter les cellules lavées à 500 fois G pendant trois minutes. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules dans OBB. Ajouter le sérum stérile non dilué de lapin de bébé à un à cinq volume final.Après une culture bactérienne d’une heure, diviser chaque échantillon en puits en double pour deux groupes. Ensuite, ajoutez 50 microlitres du mélange HL60 complément à chaque ensemble expérimental de puits et 50 microlitres d’OBB aux puits de bactéries seulement. Agiter la plaque de puits 96 à 37 degrés Celsius pendant une heure.Pour plaquer les échantillons, diluer chaque puits avec de l’OBB à un volume final d’un à cinq afin que chaque échantillon ait un volume d’au moins 50 microlitres. Ensuite, pipette 50 microlitres de chaque échantillon directement sur une zone désignée d’une plaque de culture bactérienne, assurant un espacement adéquat entre les échantillons. Couvrir et laisser sécher les échantillons pendant environ 15 minutes à température ambiante.Inverser les assiettes et la culture pendant la nuit à 30 degrés Celsius. Alternativement, plaques de culture dans des pots anaérobies pour tester si les conditions anoxiques affectent la croissance bactérienne ou pour contrôler la morphologie. Après la culture du jour au lendemain, comptez les colonies dans chaque zone d’échantillonnage désignée et procédez à l’analyse des données en comparant le nombre de cellules vivantes dans chaque ensemble aux contrôles correspondants.Les aspects les plus difficiles de l’établissement de cette technique pour la première fois seront probablement l’optimisation des CFUs de départ du stock bactérien, ainsi que de s’assurer que les cellules HL60 sont effectivement différenciées. Avant de commencer l’OPKA, la différenciation HL60 a été validée à l’aide de la cytométrie du débit avec l’iodure propidium comme marqueur de viabilité. Après avoir été traité avec DMF pendant trois jours, l’expression de CD35 a été augmentée et l’expression de CD71 a été diminuée.Les pourcentages moyens d’FC bactériennes dans les groupes traités HL60 par rapport aux groupes traités non-HL60 correspondants ont été utilisés pour comparer la survie des cellules bactériennes de différents traitements. Les résultats ont montré qu’avec un traitement efficace, le nombre de colonies était différent entre la co-culture HL60 et aucune cellule HL60, ce qui indique une phagocytose plus efficace. Les résultats ont montré que lorsque la dilution bactérienne n’était pas optimisée ou que la croissance de la colonie n’était pas soigneusement observée après placage, la prolifération des colonies pouvait empêcher un comptage précis des colonies.La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de cette procédure est de surveiller attentivement l’incubation bactérienne afin d’éviter la prolifération des FC. Les analyses in vivo peuvent être utilisées pour évaluer le dégagement bactérien efficace au sein d’un hôte. Ces analyses peuvent être utilisées pour confirmer que l’efficacité immunitaire observée avec l’OPKA est traduisible en modèles humains ou animaux.L’essai de mise à mort opsonophagocytic a été employé à grand effet dans les études significatives précédentes de recherche pour lier des thérapies antibactériennes aux réponses immunisées phagostiques. Travailler avec des agents pathogènes bactériens peut être dangereux. S’il vous plaît porter de l’équipement personnel de protection en tout temps au cours de cet essai.

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JoVE Journal

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Immunologie et infection

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