Utilisation d’unique molécule fluorescente hybridation In Situ (FISH-SM) afin de quantifier et Localize ARNm dans les ovocytes murin
April 24th, 2019
Pour compter reproductible les numéros des ARNm dans les ovocytes, in situ en fluorescence seule molécule RNA hybridation (RNA-poisson) a été optimisée pour les cellules non adhérentes. Ovocytes ont été recueillis, hybridaient avec des sondes spécifiques de transcription et quantifiées à l’aide d’un logiciel de quantification d’image.
Cette technique permet non seulement la localisation, mais aussi la quantitation des ARNM candidats dans les ovocytes et les embryons individuels. Par rapport à d’autres analyses, y compris pcr, l’achèvement de la technique se traduit par des données reproductibles avec une faible variation. Kelsey Timme, étudiante diplômée dans mon laboratoire, démontrera la procédure.
Commencez cette procédure avec la préparation du matériel requis et des souris femelles à l’âge de cinq à huit semaines comme décrit dans le protocole de texte. Nettoyez la souris à l’aide de 70 % d’éthanol. Exposer la cavité abdominale et visualiser l’appareil reproducteur féminin.
Tenez l’ovaire avec des forceps et retirez les ligaments utérin et l’excès de tissu adipeux autour de l’ovaire. Couper l’oviducte de l’utérus. Ensuite, placez la paire d’oviductes d’ovaire dans un milieu de fixation chaud dans un plat de 35 millimètres.
Retirez l’ovaire et tout tissu adipeux environnant. Déchirer l’ampullae gonflée de l’oviducte à l’aide d’une aiguille de calibre 27 d’un demi-pouce. Poussez l’oviducte à l’emplacement des complexes d’ovocytes de cellules de déchirure et de cumulus seront expulsés.
Utilisation d’une pipette buccale pour transférer les ovocytes ovulés à la goutte de 100 microlitres contenant le milieu de fixation avec l’hyaluronidase. Pour déloger les cellules cumulus, pipette la métaphyse deux complexes cellulaires cumulus ovocyte de haut en bas dans l’hyaluronidase contenant milieu de fixation avec la pipette buccale. Une fois qu’ils sont dépourvus de cellules cumulus, utilisez la pipette buccales pour transférer chaque ovocyte à une goutte de lavage contenant seulement le milieu de détention.
Répétez cette demande pour chaque gouttelette de lavage. Ne transférez pas d’ovocytes fragmentés ou transparents. Pour effectuer la coloration SM-FISH, d’abord fixer les ovocytes dans un puits individuel d’une plaque de six puits contenant 500 microlitres de tampon de fixation.
Submerger 20 ovocytes ou moins dans le puits. Incuber les ovocytes dans un tampon de fixation pendant 20 minutes à température ambiante. Après lavage des ovocytes tel que décrit dans le protocole textuel, incuber les ovocytes dans le tampon de permeablization pendant 30 minutes à température ambiante.
Après un autre lavage, transférer les ovocytes à 80 microlitres de protéase pré-diluée trois tampon pendant 30 minutes à température ambiante. Diluer les ensembles sondés réchauffés pour Nanog, Pou5f1 et DapB de un à 50 dans le diluant de la sonde. Incuber les ovocytes dans 80 microlitres de la sonde spécifique de transcription pendant deux heures à 40 degrés Celsius.
Lorsque les ovocytes sont dans la sonde et les tampons AMP, ils ont tendance à flotter. Il est essentiel que vous submergez les ovocytes en les poussant doucement dans le tampon. Transférer les ovocytes à 500 microlitres de tampon de lavage et incuber pendant 10 minutes à température ambiante.
Maintenant, incuber les ovocytes séquentiellement dans les tampons d’amplification. Tout d’abord, incuber les ovocytes dans 80 microlitres d’AMP1 pendant 30 minutes à 40 degrés Celsius. Transférer ensuite les ovocytes à 500 microlitres de tampon de lavage pendant 10 minutes à température ambiante.
Ensuite, incuber les ovocytes dans 80 microlitres d’AMP2 pendant 15 minutes à 40 degrés Celsius. Après avoir lavé les ovocytes comme avant, incuber les ovocytes dans 80 microlitres d’AMP3 pendant 30 minutes à 40 degrés Celsius suivie d’un lavage final. Enfin, ajouter des ovocytes à 80 microlitres d’AMP4FL pendant 15 minutes à 40 degrés Celsius.
Pipette 12 microlitres de support anti-fondu sur le centre d’une glissière sans ajouter de bulles au reagent. Transférer les ovocytes avec le moins de tampon de lavage possible dans le milieu de montage. Enfin, appliquez un bordereau de couverture.
Imagez les ovocytes tridimensionnels à l’aide d’une microscopie confoccale en phase Z et enregistrez les images décrites dans le protocole texte. Faites glisser les fichiers ND2 dans Fidji et choisissez Hyperstack. Cliquez sur l’onglet Image, sélectionnez Couleur et cliquez sur Split Channels pour séparer les canaux fluorescents du fichier ND2.
Générer des fichiers TIFF individuels pour chaque tranche Z des ovocytes dans chaque canal fluorescent. Pour ce faire, cliquez sur l’onglet Image, sélectionnez Stacks et cliquez sur Stack to Images. Ensuite, cliquez sur l’onglet Image, sélectionnez Type et cliquez sur RVB Color pour convertir chaque tranche Z en une image couleur RVB individuelle.
Enregistrez chaque image convertie sous forme de fichier TIFF. Placez les images d’un seul ovocyte pour chaque canal fluorescent dans un nouveau dossier pour éviter toute confusion pendant la couture. Après avoir normalisé les fichiers tels que décrits dans le protocole texte, cliquez sur l’onglet Plugins, sélectionnez Couture et cliquez sur Grid Collection.
Sélectionnez images séquentielles dans le menu dropdown et cliquez sur Ok. Parcourez le répertoire et sélectionnez le dossier contenant toutes les images en tranches Z pour un ovocyte individuel à une longueur d’onde. Cliquez sur Ok.
Déplacez le curseur au bas de l’image cousue vers le canal de couleur approprié pour la longueur d’onde utilisée. Créez l’image cousue RVB finale en cliquant sur l’image, en sélectionnant le type et en cliquant sur la couleur RVB. Convertissez l’image cousue en une image projetée maximale de 32 bits.
Pour ce faire, cliquez sur Image, sélectionnez Type et cliquez sur 32 bits. Enregistrez cette image sous la forme d’un nouveau fichier TIFF. Ouvrez l’image cousue 32 bits dans un programme de recherche et de suivi des taches.
Sélectionnez le dropdown Localize et cliquez sur Localize, qui calculera le nombre de taches trouvées dans l’image. On y voit la quantification des ARNR à l’aide du repérage et du suivi des taches. La flèche bleue indique un signal positif au-dessus du seuil.
La flèche blanche montre une tache fluorescente en dessous du seuil et donc non comptée. Les dénombrements de l’ARNm ont ensuite été analysés à l’aide d’un outil standard d’analyse des données. Des images représentatives de l’image de la série Z moyenne sont affichées pour Pouf51 et Nanog.
La coloration DAPI des chromosomes alignés sur le fuseau de métaphoase deux est montrée en blanc. Les données recueillies dans ce protocole ont montré 775 transcriptions de Pouf51 et 113 transcriptions nanog dans la métaphyse deux ovocytes. Fait important, il n’y avait aucun point détecté dans les ovocytes qui sont étiquetés avec la sonde DapB, qui a servi de contrôle négatif.
Lors de l’utilisation de cellules non adhérentes, il est important d’identifier empiriquement la meilleure dilution du tampon de protéase du kit SM-FISH. La détection de l’ARNm a été testée à l’aide d’une courbe de titration de concentrations tampons non diluées et de plusieurs concentrations tampons diluées de protéase dans 1xPBS. La dilution de protéase utilisée dans ce protocole était un à huit car elle a montré la variation la plus basse dans l’expression fluorescente moyenne de Pouf51 ARNm dans la métaphyse deux ovocytes.
L’immuno fluorescence simultanée d’une protéine cible peut être effectuée afin de co-localisé l’ARNm avec une protéine liant l’ARN. La co-localisation des ARNM avec les protéines liant l’ARN permet aux chercheurs de déterminer les mécanismes qui régulent le stockage, la traduction et la dégradation de l’ARNm dans un ovocyte ou un embryon.
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Aperçu
Cet article décrit une technique optimisée d'hybridation in situ de fluorescence d'ARN à molécule unique (RNA-FISH) pour quantifier les ARNm dans des ovocytes individuels. La méthode permet à la fois la localisation et la quantification, fournissant des données reproductibles avec une faible variation.
Composantes clés de l'étude
Domaine de la science
- Neuroscience
- Biologie cellulaire
- Expression génique
Contexte
- Le RNA-FISH à molécule unique est une technique puissante pour étudier l'ARNm dans les cellules.
- Il est particulièrement utile pour les cellules non adhérentes comme les ovocytes.
- La reproductibilité et la faible variation sont essentielles pour des données fiables.
- Comprendre la localisation et la quantification de l'ARNm peut fournir des aperçus en biologie du développement.
Objectif de l'étude
- Optimiser le RNA-FISH pour le comptage des ARNm dans des ovocytes individuels.
- Démontrer l'efficacité de la procédure par rapport à d'autres tests.
- Fournir un protocole détaillé pour les chercheurs dans le domaine.
Méthodes utilisées
- Collecte d'ovocytes de souris femelles.
- Hybridation avec des sondes spécifiques aux transcrits.
- Quantification d'images à l'aide d'un logiciel spécialisé.
- Préparation des matériaux et nettoyage des échantillons.
Résultats principaux
- La technique RNA-FISH optimisée permet une quantification précise des ARNm.
- Les données obtenues montrent une faible variation par rapport aux méthodes traditionnelles comme la PCR.
- La démonstration de la procédure par un étudiant diplômé améliore la reproductibilité.
- Les résultats contribuent à une meilleure compréhension de l'expression génique dans les ovocytes.
Conclusions
- Le RNA-FISH est une méthode fiable pour étudier l'ARNm dans les ovocytes individuels.
- La technique peut être adaptée pour diverses applications de recherche en biologie du développement.
- Des études futures peuvent s'appuyer sur cette méthodologie pour obtenir de plus amples informations sur la régulation génique.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Single-molecule mRNA quantification in oocytes addresses a critical gap in early developmental biology where low-abundance transcripts evade detection by bulk or pooled assays. By enabling reproducible, single-cell transcript counting with minimal variability, this method improves target validation confidence in germline and embryogenesis research. It supports mechanistic de-risking by linking spatial mRNA patterns to functional outcomes in oocyte maturation and early embryogenesis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying low-copy mRNAs in single oocytes, reducing false negatives in target expression profiling.
- Operational Value: Eliminates need for oocyte pooling, decreasing sample variability and improving reproducibility across experimental groups.
- Predictive Value: Supports target prioritization by providing quantitative, spatially resolved mRNA data that correlates with functional phenotypes in metaphase II oocytes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative mRNA counts per oocyte using spot-finding software, enabling reliable comparison across treatment or genetic conditions.
- Scalability: Protocol uses 6-well plates and mounting media, allowing batch processing of oocytes for medium-throughput screening applications.
- Reproducibility: Optimized protease dilution (1:8) and buffer substitutions minimize oocyte lysis and technical variation, enhancing assay robustness.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates biomarker alignment by detecting oocyte-specific transcripts like Nanog and Pou5f1, which are relevant to pluripotency and early embryonic development.
- Mechanistic De-risking: Permits co-localization with RNA-binding proteins via concurrent immunofluorescence, enabling mechanistic studies of mRNA storage, translation, and degradation.
- Risk-Adjusted Advancement: Negative control (DapB probe) confirms specificity, reducing false-positive risk in target validation workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, particularly in germline-targeted or embryotoxicology programs where single-cell resolution is essential.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying mRNA expression changes in individual oocytes under experimental perturbations.
- Screening: Delivers quantitative, spatially resolved outputs that enable reliable compound or genetic screening in oocyte-based models.
- Analytics: Spot-finding and tracking software provides digital mRNA counts per cell, enabling statistical comparison of transcript abundance across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical relevance through detection of pluripotency markers (Pou5f1, Nanog) and their regulatory mechanisms.
- Enterprise Reuse: Optimized buffer conditions and mounting protocol create a reusable platform adaptable to other non-adherent cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by detecting low-abundance mRNAs missed by PCR or sequencing in single oocytes.
- Operational Value: Reduces technical variability and sample requirements, improving throughput and cost-efficiency in oocyte-based assays.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decisions by providing spatially resolved, quantitative mRNA data linked to phenotypic outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets in developmental biology and reproductive health pipelines.
Implementation Considerations
- Expertise in oocyte handling, fixation, and permeabilization is required to prevent lysis and ensure reagent penetration.
- Access to confocal microscopy and spot-finding/tracking software (e.g., Fiji with Grid Collection plugin) is essential for 3D imaging and quantification.
- Standardization of protease dilution and wash buffers across teams is critical for reproducible results in non-adherent cells.
- Adaptation to other model systems may require re-optimization of permeabilization, hybridization, and washing conditions.
- Practical limitations include sensitivity to oocyte quality and the need for careful handling during transfer to mounting media to avoid shear stress.
