Name: Procédure dexploitation standard pour la surveillance du Lyssavirus de la population de chauves-souris à Taiwan (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Découvrez la procédure de surveillance du Lyssavirus chez les chauves-souris à Taiwan. Cette méthode standardisée permet le dépistage diagnostique des antigènes viraux et aide les chercheurs à surveiller les zoonoses.

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Nous remercions Tien-Cheng Li, Yi-Tang Lin, Chia-Jung Tsai et Ya-Lan Li pour leur aide au cours de cette étude. Cette étude a été appuyée par la subvention no 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) du Bureau of Animal and Plant Health Inspection and Quarantine, Council of Agriculture, Executive Yuan, Taiwan.

1. Précautions de sécurité lors de la manipulation des lyssavirus
<ol><li>Veiller à ce que tous les travailleurs de laboratoire qui manipulent des échantillons de chauves-souris reçoivent une prophylaxie antirabique pré-exposition17. Surveiller les niveaux d'anticorps antirabiques des travailleurs à l'avance et les réexaminer tous les 6 mois17. La vaccination de suivi contre la rage est nécessaire pour ceux dont les niveaux d'anticorps sont inférieurs à 0,5 UI/mL17.</li>
	<li>Selon les règlements de biosécurité du pays où se trouve le laboratoire, assurez-vous que les procédures suivantes sont effectuées dans des laboratoires appropriés de niveau de biosécurité (p. ex., les laboratoires BSL-2 à Taiwan et les laboratoires BSL-3 en Australie), et que les travailleurs sont actuellement qualifiés et portent un équipement de protection individuelle approprié18. REMARQUE : La vaccination contre la rage offre peu ou pas de protection contre les lyssavirus appartenant aux phylogroupes II et III18. Les travailleurs doivent être informés que plusieurs agents pathogènes zoonotiques ont été identifiés chez les chauves-souris19 et doivent manipuler des échantillons dans des conditions de laboratoire appropriées au niveau de la biosécurité avec un équipement de protection individuelle approprié.</li>
</ol>2. Collecte d'échantillons
<ol><li>Utilisation trouvée chauves-souris faibles ou malades ou des carcasses. REMARQUE : Les chauves-souris faibles ou malades sont livrées à la Bat Conservation Society of Taipei pour des soins vétérinaires ou de la recherche, tandis que les carcasses sont soumises directement à l'Institut de recherche en santé animale. Aucune chauve-souris en bonne santé n'a été euthanasiée dans ce programme de surveillance.</li>
	<li>Demandez à un écologiste chauve-souris d'identifier les espèces de chauves-souris au moyen de caractéristiques morphologiques20.</li>
	<li>Effectuer le codage à barres de l'ADN de l'espèce chauve-souris lorsque le lyssavirus positif est diagnostiqué, en utilisant des procédures publiées précédemment21.</li>
	<li>Soumettez une fiche d'information de chaque carcasse de chauve-souris (site de collecte, espèces, signes cliniques, etc.).</li>
</ol>3. Nécropsie de spécimens de chauves-souris
<ol><li>Préparer les matériaux.<ol>
<li>Préparer un tableau de dissection propre et placer un tampon absorbant stérile pour l'autopsie.</li>
		<li>Préparer les tubes de collecte pour la collecte des organes de chauve-souris.</li>
		<li>Préparer des pinces jetables et des scalpels pour l'autopsie. Changez d'outils entre l'autopsie de chaque chauve-souris. Préparer les boules de coton humidifiées avec 70 % d'éthanol pour nettoyer les pinces et les scalpels pendant l'échantillonnage.</li>
		<li>Préparer deux lames de microscope pour le FAT. Recueillir des spécimens frais et les fixer dans la solution formaline pour l'examen histopathologique.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Examiner tous les orifices externes avant l'autopsie. Photographiez les caractéristiques externes de la chauve-souris, en particulier la tête, les oreilles et les ailes, pour la différenciation des espèces.</li>
	<li>Recueillir un échantillon d'écouvillonoral. Placer la chauve-souris dans la charge ventrale sur la planche et fixer la tête de la chauve-souris avec une pince à épiler. Couper la peau le long de la ligne médiane de la calvaria avec un scalpel et tirer la peau sur les côtés latéraux. Couper le crâne le long de la ligne médiane de la calvaria avec un scalpel et l'ouvrir avec une pince à épiler pour exposer le tissu cérébral.</li>
	<li>Retirez le tissu cérébral du crâne et placez-le sur un dépresseur de langue stérile, et faites des frottis d'impression du tissu cérébral (voir l'étape 4.2). Recueillir un petit morceau de tissu cérébral frais et le fixer en formaline pour l'examen histopathologique. Contenir le tissu cérébral restant dans un tube pour l'extraction d'acide nucléique.</li>
	<li>Nettoyer les pinces et le scalpel avec des boules de coton humidifiées avec 70% d'éthanol pour enlever les tissus conservés entre la collecte des spécimens.</li>
	<li>Placez la chauve-souris sur la planche en documbency dorsal et fixez-la sur la planche avec des aiguilles des deux côtés de l'axille et du talon arrière.</li>
	<li>Inciser la peau le long de la ligne médiane du corps de la mandibule à l'anus. Soulevez et séparez la peau et les tissus musculaires sous-jacents à l'œilplé. Recueillir les glandes salivaires, qui sont près de l'os mandibulaire.</li>
	<li>Soulevez légèrement le sternum à l'œil plàou, et coupez le sternum et la paroi abdominale le long de la ligne médiane à l'eau avec un scalpel. Couper les clavicules avec un scalpel. Fixer les cages thoraciques gauche et droite sur la planche avec des aiguilles pour ouvrir la cavité thoracique.</li>
	<li>Enregistrez les lésions brutes et le degré de changement post-mortem.</li>
	<li>Retirer les tissus viscéraux (c.-à-d. le cœur, les poumons, le foie, les reins, les intestins) de la carcasse à l'aide d'une pince à épiler et d'un scalpel. Recueillir les spécimens viscéraux au besoin pour la recherche future. REMARQUE : La collecte d'échantillons en double est recommandée. L'un doit être recueilli pour le diagnostic moléculaire, et l'autre doit être congelé à -80 oC avec ou sans moyen de transport viral pour la culture virale22.</li>
</ol>4. Test direct d'anticorps fluorescents (FAT)
<ol><li>Faites des frottis d'impression du tissu cérébral pour le FAT. Effectuer le FAT comme décrit précédemment18,23 avec les modifications suivantes.</li>
	<li>Séparez doucement le tissu cérébral du tissu nerveux connecté avec des pinces à épiler et transférez le tissu cérébral à un dépresseur de langue stérile. Couper la section transversale du cerveau, y compris le tronc cérébral et le cervelet18,23. Faites des frottis d'impression du tissu cérébral en touchant légèrement la surface coupée du tissu cérébral, et appuyez sur la diapositive sur le tissu de lentille pour enlever l'excès de tissu.</li>
	<li>Fixer les lames avec de l'acétone à -20 oC pendant 30 min. Séchez les glissières testées et les contrôles positifs et négatifs avant de les tacher avec conjugué.</li>
	<li>L'utilisation de chacun des deux anticorps antirabiques conjugués au FITC disponibles dans le commerce pour la coloration de l'antigène du lyssavirus est fortement recommandée23. Déterminer la concentration de travail de la conjuguée commerciale avant la première coloration. Déposer les conjugués dilués à l'intérieur d'un filtre à seringues de 0,45 M sur les lames et les couver à 37 oC pendant 30 min dans une chambre humide.</li>
	<li>Égoutter l'excédent conjugué des lames et laver les lames avec de la saline tamponnée par le phosphate (PBS) après l'incubation.</li>
	<li>Déposer une petite quantité de 10 % de glycérol sur les glissières et recouvrir de lames de couverture.</li>
	<li>Examinez les diapositives à l'utilisation d'un microscope fluorescent.</li>
</ol>5. Extraction d'acide nucléique
<ol><li>Ajouter le volume approprié de MEM-10 (milieu essentiel minimum complété par 10% de sérum bovin fœtal) au tissu cérébral (10% w/v).</li>
	<li>Homogéner le tissu cérébral avec une perle d'acier de 5 mm dans un instrument d'homogénéisateur et une centrifugeuse à 825 x g pendant 10 min.</li>
	<li>Extraire l'acide nucléique, dont le volume final est de 50 l, à moins de 200 l du supernatant à l'aide du kit d'extraction total d'acide nucléique disponible dans le commerce avec instrument.</li>
</ol>6. RT-PCR et analyse phylogénétique
REMARQUE : Plusieurs ensembles d'amorces ont été publiés pour détecter tous les lyssavirus connus ou lyssavirus spécifiques. Le protocole décrit ici est un exemple que notre laboratoire utilise et peut ne pas répondre à tous les besoins expérimentaux. Sélectionnez des amorces appropriées en fonction des besoins du laboratoire.
<ol><li>Préparer le réactif RT-PCR en une seule étape comme suit : ajouter 5 l d'acide nucléique extrait au mélange de réaction contenant 2,5 l de tampon de réaction 10x, 0,5 L d'amorces avant et inverse (10 M de chacun), 4 l de 1,25 m dNTP, 0,3 l d'inhibiteur de la RNase (40 U/L) , 0,3 L de transcriptase inversée (10 U/L), 0,4 l de polymérase d'ADN (5 U/L) et 11,5 l d'eau traitée par LE DEPC. REMARQUE : L'ensemble d'amorces utilisé dans ce protocole est JW12 (5'-ATGTAACACCTACAATG-3') et N165-146 (5'-GCAGGGTAYTTRTACTCATA-3')24. Modifier la préparation des réactifs et des conditions de cyclisme en fonction des ensembles d'amorce utilisés.</li>
	<li>Effectuer le cyclisme dans les conditions suivantes : incubation à 42 oC pendant 40 min; dénaturation initiale à 94 oC pendant 10 min; 35 cycles de 94 oC pour 30 s, 55 oC pour 30 s et 72 oC pour 30 s; et enfin, une extension ultérieure à 72 oC pendant 10 min.</li>
	<li>Utilisez un autre ensemble d'amorce ou plus pour augmenter la sensibilité diagnostique.<ol>
<li>Utilisez N113F (5'-GTAGGATGCTATATGGG-3') et N304R (5'-TTGACGAAGATCTTGCTCAT-3')25,26 pour préparer le réactif RT-PCR en une seule étape comme suit: ajouter 5 'L d'acide nucléique extrait à un mélange de réaction contenant 5 'L de 10x tampon, 5 'L de amorces avant et inversées (4 M de chacun), 5 L de 1,25 md dNTP, 0,5 l d'inhibiteur de la RNase (40 U/L), 0,2 L de transcriptase inversée (10 U/L), 1 l de polymérase d'ADN (5 U/L) et 23,3 l d'eau traitée par DEPC.</li>
		<li>Effectuer le cyclisme dans les conditions suivantes : incubation à 42 oC pendant 40 min; dénaturation initiale à 95 oC pendant 5 min; 35 cycles de 95 oC pour 1 min, 55 oC pour 1 min et 20 s, et 72 oC pour 1 min; et enfin, une extension ultérieure à 72 oC pendant 10 min. REMARQUE : Selon les besoins de laboratoire, choisissez des amorces appropriées pour le diagnostic. N113F a été initialement conçu pour l'amplification du virus de la rage, mais il peut ne pas fonctionner bien pour d'autres lyssavirus. L'ensemble de N113F et N304R fonctionne bien pour le virus de la rage (variante du blaireau de furet de Taiwan) et le lyssavirus de chauve-souris de Taiwan. Il sera plus facile d'obtenir des séquences de nucléoprotéines entières en utilisant l'ensemble des amorces JW12 et N304R si le lyssavirus est amplifié par les deux ensembles d'amorces ci-dessus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyser le produit PCR sur 2% électrophoresis gel agarose et visualiser par éclairage de lumière UV.</li>
	<li>Séquencer le produit PCR par service de séquençage commercial.</li>
	<li>Entrez ou téléchargez la séquence sur la page Web de l'outil de recherche local de base sur l'alignement nucléotide (BLAST). Sélectionnez la base de données « autres (nr etc.) » et entrez dans l'organisme sous le titre Lyssavirus. Sélectionnez l'algorithme MegaBlast et exécutez le BLAST.</li>
</ol>7. Isolement du virus
REMARQUE : Effectuez l'isolement de virus quand 1) le FAT ou 2) le RT-PCR indique la positivité.
<ol><li>Homogénéiser le spécimen du cerveau dans une suspension de 10% (w/v) dans MEM-10. Centrifugeuse à 825 x g pendant 10 min.</li>
	<li>Inoculer 200 l de supernatant avec une suspension de 3 x 106 cellules MNA (neuroblastome de souris) dans 1 ml de MEM-10 pour 1 h à 37 oC avec 1% de CO2. Transférer la suspension à cellules homogénéiques du cerveau à un flacon de 25 cm2 et ajouter 6 ml de MEM-10.</li>
	<li>Cultivez 1 ml de suspension à cellules homogénéiques du cerveau dans un toboggan en verre à 4 puits recouvert de téflon de 6 mm de diamètre en même temps.</li>
	<li>Après 3 à 4 jours d'incubation à37 oC avec 1 % de CO 2, fixez les cellules sur la diapositive de 4 puits avec 100 % d'acétone (v/v).</li>
	<li>Tainer les diapositives avec deux anticorps antirabiques conjugués au FITC suivant les étapes 4.4-4.7. Les cellules sont infectées lorsque les inclusions intracytoplasmiques sont étudiées. Enregistrez le pourcentage de cellules infectées.</li>
	<li>Effectuer la trypsinisation et la sous-culture de la culture cellulaire inoculée lorsque les diapositives sont tachées comme négatives:<ol>
<li>Retirer le milieu et rincer le flacon avec 5 ml de PBS.</li>
		<li>Ajouter 1 ml de trypsine dans le flacon et frapper fermement le fond du flacon.</li>
		<li>Ajouter 6 ml de MEM-10 et resuspendre les cellules.</li>
		<li>Mettre la suspension cellulaire dans un nouveau flacon de tissu (6 ml) et sur une glissière de 4 puits (1 ml).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Répéter les étapes 7,4 à 7,6 jusqu'à ce que l'infectiosité à 100 % soit atteinte.</li>
	<li>Recueillir le supernatant après 24 h d'incubation.</li>
</ol>

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<li>Fischer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+step+forward+in+molecular+diagnostics+of+lyssaviruses--results+of+a+ring+trial+among+European+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A step forward in molecular diagnostics of lyssaviruses--results of a ring trial among European laboratories.</a> PLoS ONE. 8 (3), 58372(2013).</li>
<li>David, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+virus+detection+by+RT-PCR+in+decomposed+naturally+infected+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rabies virus detection by RT-PCR in decomposed naturally infected brains.</a> Veterinary Microbiology. 87 (2), 111-118 (2002).</li>
<li>Robardet, E., Picard-Meyer, E., Andrieu, S., Servat, A., Cliquet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+interlaboratory+trials+on+rabies+diagnosis%3A+an+overview+of+results+and+variation+in+reference+diagnosis+techniques+%28fluorescent+antibody+test%2C+rabies+tissue+culture+infection+test%2C+mouse+inoculation+test%29+and+molecular+biology+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">International interlaboratory trials on rabies diagnosis: an overview of results and variation in reference diagnosis techniques (fluorescent antibody test, rabies tissue culture infection test, mouse inoculation test) and molecular biology techniques.</a> Journal of Virological Methods. 177 (1), 15-25 (2011).</li>
</ol>

Aucun conflit d'intérêts n'est déclaré.

Cette procédure d'exploitation standard de laboratoire (SOP) fournit un processus de série pour tester des échantillons de chauve-souris pour la présence d'antigènes de lyssavirus à Taiwan. Les principales étapes comprennent l'emploi de FAT et RT-PCR. La sélection d'échantillons appropriés et l'isolement réussi du virus sont également importants. En outre, un certain dépannage a été effectué pendant la surveillance des lyssavirus chauves-souris. La principale différence était les animaux cibles. Initialement (2008-2009),...

Les virus du genre Lyssavirus sont des agents pathogènes zoonotiques. Il existe au moins sept espèces de lyssavirus associées à des cas humains1. En plus des 16 espèces de ce genre1,2,3, Taiwan chauve-souris lyssavirus (TWBLV)4 et Kotalahti chauve-souris lyssavirus5 ont été récemment identifiés chez les chauves-souris, mais leurs statuts taxonomiques n'ont pas encore être déterminés.
Les chauves-souris sont les hôtes naturels de la plupart des lyssavirus, à l'exception de Mokola lyssavirus et Ikoma lyssavirus, qui n'ont pas encore été identifiés chez les chauves-souris1,2,3,6. L'information sur les lyssavirus chez les chauves-souris asiatiques est encore limitée. Deux lyssavirus non caractérisés chez les chauves-souris asiatiques (l'un en Inde et l'autre en Thaïlande)7,8 ont été signalés. Un cas de rage humaine associé à une morsure de chauve-souris en Chine a été rapporté en 2002, mais le diagnostic a été fait seulement par observation clinique9. En Asie centrale, aravan lyssavirus a été identifié dans la chauve-souris à oreilles de souris inférieure (Myotis blythi) au Kirghizistan en 1991, et Le lyssavirus de Khujand a été identifié dans la chauve-souris moustachue (Myotis mystacinus) au Tadjikistan en 200110. En Asie du Sud, Gannoruwa bat lyssavirus a été identifié chez le renard volant indien (Pteropus medius) au Sri Lanka en 20153. En Asie du Sud-Est, plusieurs études sérologiques sur les chauves-souris aux Philippines, en Thaïlande, au Bangladesh, au Cambodge et au Vietnam ont montré une séroprévalence variable11,12,13,14, 15. Bien que le lyssavirus d'Irk a été identifié dans la plus grande chauve-souris à nez tubulaire (Murina leucogaster) dans la province de Jilin, Chine en 201216, l'espèce exacte et l'emplacement des lyssavirus dans les populations de chauves-souris d'Asie de l'Est restent inconnus.
Pour évaluer la présence de lyssavirus dans les populations de chauves-souris taïwanaises, un programme de surveillance utilisant à la fois la FAT directe et le RT-PCR a été lancé. Taiwan bat lyssavirus a été identifié dans deux cas de pipistrelle japonaise (Pipistrellus abramus)4 en 2016-2017. Dans le présent article, une procédure d'opération standard de laboratoire est introduite pour la surveillance de lyssavirus de la population de chauves-souris à Taiwan. Le diagramme de flux du diagnostic de lyssavirus de chauve-souris dans notre laboratoire est présenté dans la figure 1.

<table><tbody><tr><td>2,5 % Trypsine (10x)</td><td>Gibco</td><td>15090046</td><td>Trypsine</td></tr><tr><td>25 cm2 flacon</td><td>Greiner bio-one</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Honeywell</td><td>32201-1L</td><td></td></tr><tr><td>Agarose I</td><td>VWR Life Science</td><td>97062-250</td><td></td></tr><tr><td>Alcool</td><td>NIHON SHIYAKU RÉACTIF</td><td>NS-32294</td><td></td></tr><tr><td>AMV Transcriptase inverse</td><td>Promega</td><td>M5101</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique-Antimycosique(100X)&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>Lame</td><td>Braun</td><td>BA215</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Système de chimilumineance</td><td>TOP BIO CO.</td><td>MGIS-21-C2-1M</td><td></td></tr><tr><td>Tube de collecte</td><td>Qiagen</td><td>990381</td><td></td></tr><tr><td>Tube de collecte</td><td>SSI</td><td>2341-SO</td><td></td></tr><tr><td>Lame de couverture</td><td>Muto Pure chemical Co., LTD.</td><td>24505</td><td></td></tr><tr><td>Analyseur d’ADN</td><td>Applied Biosystems</td><td>3700XL</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>FITC Anti-Rabies Monoclonal Globulin</td><td>Fujirebio Diagnostic Inc.</td><td>800-092</td><td>Anticorps antirabiques conjugués FITC : réactif B</td></tr><tr><td>Lame de verre à quatre puits avec revêtement en téflon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>30-86H-WHITE</td><td></td></tr><tr><td>Système d’électrophorèse sur gel</td><td>Major Science</td><td>MJ-105-R</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td>Incubateur de trypsine</td></tr><tr><td></td><td>ASTEC</td><td>SCA-165DS</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>LIGHT DIAGNOSTICS Réactif de graisse antirabique</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>5100</td><td>Anticorps antirabiques conjugués FITC : réactif A</td></tr><tr><td>MagNA Pure Compact Instrument</td><td>Roche</td><td>03731146001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1</td><td>Roche</td><td>03730964001</td><td></td></tr><tr><td>MEM (10x)</td><td>Gibco</td><td>11430030</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>MEM NEAA (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>MEM solution vitaminique</td><td>Gibco</td><td>11120052</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1.06329.0500</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>Aiguille</td><td>Terumo</td><td>NN*2332R9</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Medicago</td><td>09-8912-100</td><td></td></tr><tr><td>Synthèse d’amorces</td><td>Mission Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNasin inhibiteur de ribonucléase</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>Service de séquençage</td><td>Mission Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide</td><td>Thermo Scientific</td><td>AA00008032E00MNT10</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>Perles d’acier inoxydable</td><td>QIAGEN</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>Tampon absorbant stérile</td><td>3M</td><td>1604T-2</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue</td><td>Nalgene</td><td>171-0045</td><td></td></tr><tr><td>Taq polymérase</td><td>JMR Holdings</td><td>JMR-801</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>Applied Biosystems</td><td>2720</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>QIAGEN</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Abaisse-langue</td><td>HONJER CO., LTD.</td><td></td><td></td>122246</tr><tr><td>pince à épiler</td><td>Tennyson instrument médical en développement CO., LTD.</td><td>A0601</td><td></td></tr><tr><td>Tartrate de tylosine</td><td>Sigma</td><td>T6271-10G</td><td>MEM-10</td></tr></tbody></table>

procédure d'exploitation standard pour la surveillance du lyssavirus de la population de chauves-souris à taiwan

Standard Operating Procedure for Lyssavirus Surveillance of the Bat Population in Taiwan

Les virus du genre Lyssavirus sont des agents pathogènes zoonotiques, et au moins sept espèces de lyssavirus sont associées à des cas humains. Parce que les chauves-souris sont des réservoirs naturels de la plupart des lyssavirus, un programme de surveillance du lyssavirus des chauves-souris a été menée à Taiwan depuis 2008 pour comprendre l'écologie de ces virus chez les chauves-souris. Dans le le but, des organisations non gouvernementales de conservation des chauves-souris et des centres locaux de lutte contre les maladies animales ont coopéré pour recueillir les chauves-souris mortes ou les chauves-souris qui meurent de faiblesse ou de maladie. Les tissus cérébraux des chauves-souris ont été obtenus par autopsie et soumis à l'essai fluorescent direct d'anticorps (FAT) et à la réaction en chaîne de polymère de transcription inverse (RT-PCR) pour la détection des antigènes de lyssavirus et des acides nucléiques. Pour la FAT, au moins deux conjugués différents de diagnostic de rage sont recommandés. Pour le RT-PCR, deux ensembles d'amorces (JW12/N165-146, N113F/N304R) sont utilisés pour amplifier une séquence partielle du gène nucléoprotéine de lyssavirus. Ce programme de surveillance surveille les lyssavirus et autres agents zoonotiques chez les chauves-souris. Taiwan bat lyssavirus est trouvé dans deux cas de la pipistrelle japonaise (Pipistrellus abramus) en 2016-2017. Ces résultats devraient informer le public, les professionnels de la santé et les scientifiques des risques potentiels de communiquer avec les chauves-souris et d'autres espèces sauvages.

De 2014 à mai 2017, 332 carcasses de chauves-souris de 13 espèces ont été recueillies pour surveillance. Deux ont été testés positifs. Dans le premier cas de chauve-souris, l'impression cérébrale a donné un résultat négatif à l'aide du FAT avec l'un des anticorps antirabiques conjugués au FITC (figure 2), tandis que les RT-PCR employant chacun des deux ensembles d'amorces (JW12/N165-146, N113F/N304R) ont donné résultats positifs (figure 3). Une séquence de 428 b...

Ce protocole introduit une procédure d'exploitation de laboratoire standard pour l'essai diagnostique des antigènes de lyssavirus dans les chauves-souris à Taiwan.

Procédure d'exploitation standard pour la surveillance du Lyssavirus de la population de chauves-souris à Taiwan

Viruses within the genus Lyssavirus are zoonotic pathogens, and at least seven lyssavirus species are associated with human cases. Because bats are ...

Le lyssavirus est un agent pathogène zoo-no-tic. Afin d’évaluer la présence de lyssavirus dans les populations taïwanaises de chauves-souris, nous avons lancé un programme de surveillance. Et il a identifié avec succès quatre lyssavirus de 2016 à 2018.Ce protocole est une introduction étape par étape à la surveillance vi-al Lyssavirus à Taiwan. Nous espérons qu’il sera utile aux chercheurs qui s’intéressent à la surveillance du lyssavirus vi-al. Il est important de connecter le symbole tac-keg correct.Une chauve-souris morte ou mourante est plus appropriée qu’une chauve-souris vivante pour la surveillance du lyssavirus. Selon les règlements de biosécurité du pays où se trouve le laboratoire; effectuer les procédures suivantes dans un laboratoire approprié de niveau de biosécurité. Et s’assurer que les chercheurs sont actuellement qualifiés et portent un équipement de protection individuelle approprié.Lors de la collecte de chauves-souris ou de carcasses faibles ou malades, demandez à un écologiste de chauve-souris d’identifier l’espèce de chauve-souris en fonction des caractéristiques morphologiques du spécimen. Soumettez une fiche d’information au laboratoire, y compris le site de collecte, les espèces, les signes cliniques et d’autres données pertinentes avec chaque spécimen de chauve-souris. Avant de commencer la nécroscopie, examinez tous les orifices externes et photographiez les caractéristiques externes des chauves-souris, en particulier la tête, les oreilles et les ailes pour la différenciation des espèces.Pour recueillir un échantillon oral d’écouvillon, placez la chauve-souris dans une couchée ventrale sur un tableau de dissection stérile et fixez la tête avec des pinces à épiler. Utilisez un scalpel pour couper la peau le long de la ligne médiane de la zone du veau; et tirez la peau sur les côtés latéraux, pour faire une incision dans le crâne le long de la ligne médiane de la zone du veau. Ouvrez le crâne avec des pinces à épiler pour exposer le tissu cérébral et utilisez la pince à épiler pour séparer doucement le tissu cérébral du tissu nerveux connecté.Coupez la section transversale du cerveau, y compris le tronc cérébral et le cervelet, et touchez légèrement la surface coupée du tissu cérébral avec des glissières en verre pour faire des impressions de frottis. Appuyez sur la diapositive sur le tissu de la lentille pour enlever l’excès de tissu et de fixer l’impression de frottis glisse en moins 20 degrés Celsius acétone pendant 30 minutes. Puis fixer un petit morceau de tissu cérébral frais, en formaline, pour l’examen histopathologique.Et placer le reste du tissu dans emi-em 10 pour l’extraction de l’acide nucléique. Ensuite, incisez la peau du collecteur à l’anus le long de la ligne médiane du corps, et utilisez les pinces pour soulever et séparer la peau et souligner les tissus musculaires; pour permettre la collecte des glandes salivaires, situées près de l’os mandibulaire. Soulevant légèrement le sternum avec la pince à épiler, utilisez le scalpel pour couper le sternum et la paroi abdominale le long de la ligne médiane et couper les clavicules.Utilisez des aiguilles pour fixer les cages thoraciques gauche et droite à la planche de dissection, pour ouvrir la cavité thoracique. Et enregistrez les légions brutes et le degré de changement post mortem. Ensuite, utilisez la pince à épiler et le scalpel pour enlever les tissus viscérals, le cas échéant, pour l’analyse prévue en aval.Pour effectuer un test d’anticorps fluorescent direct à la fin de la fixation, séchez les glissières d’impression de frottis et sélectionnez au moins deux anticorps antirabiques conjugués à fluorescence pour l’analyse. Filtrer un anticorps sur chaque glissière à travers une passoire de 0,45 micromètre. Et incuber les toboggans pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans une chambre humide.À la fin de l’incubation, égoutter l’excès conjugué et laver les glissières avec du PBS. Ensuite, utilisez un petit volume de 10% glycérol pour monter des glissements de couverture sur les diapositives et l’image des diapositives par microscopie fluorescence. Lorsque l’essai d’anticorps fluorescents ou l’analyse RT-PCR indique la positivité, homogénéisez le spécimen de cerveau dans la suspension de 10% dans emi-en 10 et sédimentez les tissus fleu-rry par centrifugation.Inoculer 200 microlitres du super-nat-en avec trois fois 10 à la 6ème souris cellules neuroblastome et un millilitre d’emi-en 10 pendant une heure à 37 degrés Celsius et 1% de dioxyde de carbone. Et transférer la suspension de cellules homogènes du cerveau à un flacon carré de 25 centimètres, contenant six millilitres d’emi-en 10 frais. À un millilitre de suspension de cellules homogènes du cerveau dans une glissière en verre enduit de téflon de quatre puits, avec un diamètre de six millimètres et placez la glissière à 37 degrés Celsius et 1 % de dioxyde de carbone pendant trois à quatre jours.Après fixation avec 100% acétone, tacher les diapositives avec les deux mêmes anticorps antirabiques conjugués fluorescence comme utilisé pour le test d’anticorps fluorescence. Et visualisez les diapositives par microscopie fluorescente pour déterminer le nombre d’inclusions intracida-plas-mic. Après avoir trypsinisé et sous-cultivé la culture cellulaire inoculée selon les protocoles standard, retourner la culture du froid à l’incubateur de culture cellulaire pour un autre trois à quatre jours avec le comptage répété du nombre de cellules infectées comme juste démontré jusqu’à ce qu’une infectiosité de 100% est atteint.De janvier 2014 à mai 2017, 332 carcasses de chauves-souris de 13 espèces ont été collectées pour surveillance. Dans cette analyse représentative de deux cas positifs de chauve-souris, l’impression cérébrale a été testée négative à l’aide du test d’anticorps fluorescent avec l’un des anticorps antirabique conjugués commerciaux et en forme, tandis que le RT-PCR utilisant chacun des deux ensembles d’amorces différents a donné des résultats positifs. La subjection de la séquence ampli-con obtenue à la requête par explosion dans la base de données de la banque Gen a révélé que la séquence était similaire aux Lyssavirus dont l’identité était inférieure à 79 % pour soutenir l’identité des Lyssavirus détectés.Deux lyssavirus ont été plus tard avec succès isolés des deux cerveaux comme confirmé par l’essai et le séquençage d’anticorps de fluorescence. L’étape clé pour déterminer la positivité de Lyssavirus sont le test d’anticorps de fluorescence et l’analyse de RT-CPR. L’utilisation de deux anticorps antirabies ou plus dans les ensembles d’amorce est fortement recommandée.En plus du lyssavirus, d’autres agents pathogènes zoo-non-ical de chauve-souris peuvent être surveillés utilisant des méthodes diagnostiques fermées. Les données peuvent ensuite être utilisées pour informer le public d’éviter tout contact avec les chauves-souris. Plus nous serons en mesure d’étudier le lyssavirus des chauves-souris, plus nous serons en mesure de comprendre son évolution et son impact sur la santé publique.

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Nous présentons ici les protocoles afin d’identifier les immunomodulateurs 1) virus codé qui favorisent la réplication arbovirus et facteurs de l’hôte 2) eucaryotes que restreignent la réplication des arbovirus. Ces méthodes à base de fluorescence et de luminescence aux chercheurs d’obtenir rapidement des afficheurs quantitatives de réplication arbovirus dans les essais simplistes avec des rapports signal sur bruit faibles.

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Une réaction en chaîne de polymérase de transcription inverse imbriquée de Pan-lyssavirus a été développée pour détecter spécifiquement tous les lyssavirus connus. La validation à l’aide d’échantillons de cerveau de la rage de différentes espèces animales a montré que cette méthode a une sensibilité et une spécificité équivalentes au test d’anticorps fluorescent étalon-or et pourrait être utilisée pour le diagnostic systématique de la rage.

Évaluation d’une réaction en chaîne de polymérase de transcription inverse imbriquée universelle pour la détection des lyssavirus

Il s'agit d'un protocole pour la préparation optimale des tissus pour les analyses génomiques, transcriptomiques et protéomiques des chauves-souris capturées à l'état sauvage. Il comprend des protocoles pour la capture et la dissection des chauves-souris, la préservation des tissus et la culture cellulaire du tissu de chauve-souris.

Collection de tissus de chauves-souris pour -Analyses d'omics et culture cellulaire primaire

Ce RT-PCR en temps réel utilisant le colorant intercalateur de dsDNA est approprié pour diagnostiquer des infections de lyssavirus. La méthode commence par l'ARN extrait d'échantillons pré-mortem ou post-mortem soupçonnés de rage, détaillant la préparation du mélange maître, l'ajout d'ARN, la configuration de la machine en temps réel et l'interprétation correcte des résultats.

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Nous présentons un protocole complet pour le diagnostic post mortem de la rage animale dans des conditions de terrain utilisant un essai immunochromagraphic rapide de diagnostic (RIDT), de l’échantillonnage de biopsie de cerveau à l’interprétation finale. Nous décrivons également d’autres applications utilisant le dispositif pour l’analyse moléculaire et le génotypage viral.

Test de diagnostic immunochromatographique rapide sur le terrain postmortem pour les paramètres limités par les ressources avec d’autres applications moléculaires

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Une approche a été développée pour identifier les conditions optimales de concentration virale pour des échantillons d’eau de petit volume à l’aide de pointes d’adénovirus humains. Les techniques décrites ici sont utilisées pour identifier les paramètres de concentration d’autres cibles virales et appliquées à l’expérimentation de concentration virale à grande échelle.

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Une attention particulière est nécessaire pour collecter et traiter correctement les échantillons d’eau pour les études de métaux traces dans les environnements aquatiques. Un protocole pour l’échantillonnage, le traitement et les procédures analytiques dans le but d’obtenir des données et des résultats de surveillance environnementale fiables et très sensibles pour des études détaillées des métaux traces est présenté.

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Plancton et les particules en suspension jouent un rôle majeur dans les cycles biogéochimiques dans l’océan. Ici, nous fournissons une méthode ultra propre, faible contrainte pour la collecte de différentes tailles de particules et de planctons en mer avec la capacité de traiter des volumes importants d’eau de mer.

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Découvrez la procédure de surveillance du Lyssavirus chez les chauves-souris à Taiwan. Cette méthode standardisée permet le dépistage diagnostique des antigènes viraux et aide les chercheurs à surveiller les zoonoses.

Procédure d'exploitation standard pour la surveillance du Lyssavirus de la population de chauves-souris à Taiwan

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