Procédure d'exploitation standard pour la surveillance du Lyssavirus de la population de chauves-souris à Taiwan

Le lyssavirus est un agent pathogène zoo-no-tic. Afin d’évaluer la présence de lyssavirus dans les populations taïwanaises de chauves-souris, nous avons lancé un programme de surveillance. Et il a identifié avec succès quatre lyssavirus de 2016 à 2018.

Ce protocole est une introduction étape par étape à la surveillance vi-al Lyssavirus à Taiwan. Nous espérons qu’il sera utile aux chercheurs qui s’intéressent à la surveillance du lyssavirus vi-al. Il est important de connecter le symbole tac-keg correct.

Une chauve-souris morte ou mourante est plus appropriée qu’une chauve-souris vivante pour la surveillance du lyssavirus. Selon les règlements de biosécurité du pays où se trouve le laboratoire; effectuer les procédures suivantes dans un laboratoire approprié de niveau de biosécurité. Et s’assurer que les chercheurs sont actuellement qualifiés et portent un équipement de protection individuelle approprié.

Lors de la collecte de chauves-souris ou de carcasses faibles ou malades, demandez à un écologiste de chauve-souris d’identifier l’espèce de chauve-souris en fonction des caractéristiques morphologiques du spécimen. Soumettez une fiche d’information au laboratoire, y compris le site de collecte, les espèces, les signes cliniques et d’autres données pertinentes avec chaque spécimen de chauve-souris. Avant de commencer la nécroscopie, examinez tous les orifices externes et photographiez les caractéristiques externes des chauves-souris, en particulier la tête, les oreilles et les ailes pour la différenciation des espèces.

Pour recueillir un échantillon oral d’écouvillon, placez la chauve-souris dans une couchée ventrale sur un tableau de dissection stérile et fixez la tête avec des pinces à épiler. Utilisez un scalpel pour couper la peau le long de la ligne médiane de la zone du veau; et tirez la peau sur les côtés latéraux, pour faire une incision dans le crâne le long de la ligne médiane de la zone du veau. Ouvrez le crâne avec des pinces à épiler pour exposer le tissu cérébral et utilisez la pince à épiler pour séparer doucement le tissu cérébral du tissu nerveux connecté.

Coupez la section transversale du cerveau, y compris le tronc cérébral et le cervelet, et touchez légèrement la surface coupée du tissu cérébral avec des glissières en verre pour faire des impressions de frottis. Appuyez sur la diapositive sur le tissu de la lentille pour enlever l’excès de tissu et de fixer l’impression de frottis glisse en moins 20 degrés Celsius acétone pendant 30 minutes. Puis fixer un petit morceau de tissu cérébral frais, en formaline, pour l’examen histopathologique.

Et placer le reste du tissu dans emi-em 10 pour l’extraction de l’acide nucléique. Ensuite, incisez la peau du collecteur à l’anus le long de la ligne médiane du corps, et utilisez les pinces pour soulever et séparer la peau et souligner les tissus musculaires; pour permettre la collecte des glandes salivaires, situées près de l’os mandibulaire. Soulevant légèrement le sternum avec la pince à épiler, utilisez le scalpel pour couper le sternum et la paroi abdominale le long de la ligne médiane et couper les clavicules.

Utilisez des aiguilles pour fixer les cages thoraciques gauche et droite à la planche de dissection, pour ouvrir la cavité thoracique. Et enregistrez les légions brutes et le degré de changement post mortem. Ensuite, utilisez la pince à épiler et le scalpel pour enlever les tissus viscérals, le cas échéant, pour l’analyse prévue en aval.

Pour effectuer un test d’anticorps fluorescent direct à la fin de la fixation, séchez les glissières d’impression de frottis et sélectionnez au moins deux anticorps antirabiques conjugués à fluorescence pour l’analyse. Filtrer un anticorps sur chaque glissière à travers une passoire de 0,45 micromètre. Et incuber les toboggans pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans une chambre humide.

À la fin de l’incubation, égoutter l’excès conjugué et laver les glissières avec du PBS. Ensuite, utilisez un petit volume de 10% glycérol pour monter des glissements de couverture sur les diapositives et l’image des diapositives par microscopie fluorescence. Lorsque l’essai d’anticorps fluorescents ou l’analyse RT-PCR indique la positivité, homogénéisez le spécimen de cerveau dans la suspension de 10% dans emi-en 10 et sédimentez les tissus fleu-rry par centrifugation.

Inoculer 200 microlitres du super-nat-en avec trois fois 10 à la 6ème souris cellules neuroblastome et un millilitre d’emi-en 10 pendant une heure à 37 degrés Celsius et 1% de dioxyde de carbone. Et transférer la suspension de cellules homogènes du cerveau à un flacon carré de 25 centimètres, contenant six millilitres d’emi-en 10 frais. À un millilitre de suspension de cellules homogènes du cerveau dans une glissière en verre enduit de téflon de quatre puits, avec un diamètre de six millimètres et placez la glissière à 37 degrés Celsius et 1 % de dioxyde de carbone pendant trois à quatre jours.

Après fixation avec 100% acétone, tacher les diapositives avec les deux mêmes anticorps antirabiques conjugués fluorescence comme utilisé pour le test d’anticorps fluorescence. Et visualisez les diapositives par microscopie fluorescente pour déterminer le nombre d’inclusions intracida-plas-mic. Après avoir trypsinisé et sous-cultivé la culture cellulaire inoculée selon les protocoles standard, retourner la culture du froid à l’incubateur de culture cellulaire pour un autre trois à quatre jours avec le comptage répété du nombre de cellules infectées comme juste démontré jusqu’à ce qu’une infectiosité de 100% est atteint.

De janvier 2014 à mai 2017, 332 carcasses de chauves-souris de 13 espèces ont été collectées pour surveillance. Dans cette analyse représentative de deux cas positifs de chauve-souris, l’impression cérébrale a été testée négative à l’aide du test d’anticorps fluorescent avec l’un des anticorps antirabique conjugués commerciaux et en forme, tandis que le RT-PCR utilisant chacun des deux ensembles d’amorces différents a donné des résultats positifs. La subjection de la séquence ampli-con obtenue à la requête par explosion dans la base de données de la banque Gen a révélé que la séquence était similaire aux Lyssavirus dont l’identité était inférieure à 79 % pour soutenir l’identité des Lyssavirus détectés.

Deux lyssavirus ont été plus tard avec succès isolés des deux cerveaux comme confirmé par l’essai et le séquençage d’anticorps de fluorescence. L’étape clé pour déterminer la positivité de Lyssavirus sont le test d’anticorps de fluorescence et l’analyse de RT-CPR. L’utilisation de deux anticorps antirabies ou plus dans les ensembles d’amorce est fortement recommandée.

En plus du lyssavirus, d’autres agents pathogènes zoo-non-ical de chauve-souris peuvent être surveillés utilisant des méthodes diagnostiques fermées. Les données peuvent ensuite être utilisées pour informer le public d’éviter tout contact avec les chauves-souris. Plus nous serons en mesure d’étudier le lyssavirus des chauves-souris, plus nous serons en mesure de comprendre son évolution et son impact sur la santé publique.