Technologie CRISPR/Cas9 dans la restauration de l'expression de la dystrophine chez les progéniteurs musculaires dérivés de l'iPSC

Duchenne est une dystrophie musculaire causant un épuisement prématuré des cellules progénitrices musculaires. C’est l’une des dystrophies musculaires les plus sévères. Pour favoriser une régénération musculaire fonctionnelle, nous utilisons l’édition de gènes à base de CRISPR/Cas9 pour restaurer l’expression de la dystrophine dans les cellules progénitrices musculaires induites dérivées des cellules souches pluripotentes.

L’édition du gène CRISPR-Cas9 a le potentiel de restaurer l’expression du gène de la dystrophine. Les cellules progénitrices musculaires autologues dérivées de l’iPSC peuvent reconstituer le pore des cellules souches, réparer les dommages et prévenir d’autres complications dans la DMD sans provoquer de réponse immunitaire. Différents agents des cellules iPS dans les cellules progénitrices myogéniques ont réduit le risque de re-genèse tumorale dans les cellules iPS.

Plusieurs thérapies qui combinent les cellules progénitrices musculaires induites par les cellules souches pluripotentes autologues avec la correction génétique crispr-cas9-24 sont des stratégies prometteuses de traitement de la dystrophie musculaire de Duchenne. Cette technologie peut être utilisée pour traiter de nombreuses maladies congénitales en éditant génétiquement des cellules souches autologues, y compris le cœur, le cerveau et les maladies du sang. Nous avons montré que la démonstration de cette approche peut fournir aux lecteurs une expérience dans la manipulation de la reprogrammation cellulaire et l’édition de gènes, ce qui reste un défi.

Au microscope inversé, examiner les colonies de cellules souches embryonnaires de souris infectées. Marquer les colonies au fond du plat avec le marqueur d’objet auto-en-king. Appliquer des anneaux de clonage graissés pour couvrir les colonies cellulaires marquées.

Ajouter 100 microlitres de 0,05% Trypsin-EDTA à chaque anneau de clonage et placer la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, transférez les cellules digérées avec des pointes de pipette de 100 microlitres à des plaques de culture de 48 puits contenant 250 millilitres de milieu de croissance MES. Incuber les cellules dans l’incubateur de 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone et 85% d’humidité.

Quand ils lisent 70% de confluence, sélectionnez les puits avec des cellules bien cultivées et ajoutez 250 millilitres de solution TVP à digérer pendant 30 minutes. Ensuite, transférez la culture cellulaire de chaque puits à un plat de six centimètres. Répéter l’application d’anneaux de clonage et d’incubation pendant plusieurs fois jusqu’à ce que des clones uniformes en forme de dortoir soient obtenus.

Maintenant, digérer les iPSCs de souris préparés en ajoutant un millilitre de solution TVP. Transférer la culture cellulaire dans une plaque de 24 puits recouverte de fibronectine et de gélatine et incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Après que les cellules atteignent 50% de confluence, passer à 500 microlitres de milieu de culture frais contenant huit microgrammes par millilitre polybrene.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de la solution de particules lentivirales aux iPSCs de souris. Incuber les cellules pendant trois jours à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Ensuite, déterminez la concentration minimale de Blasticidine et hygromycine B qui est à la moitié du taux de mortalité dans les 24 heures.

Ajouter le média de 2,5 microgrammes par millilitre blasticidine et 100 microgrammes par millilitre hygromycine B dans les cellules, attendre trois jours, et sélectionnez les cellules qui restent adhérentes comme cellules infectées stabling. Digérer les iPSCs de souris sélectionnés avec 0,5 millilitres de solution TVP, chacun bien dans une nouvelle plaque de 24 puits, et incuber les cellules pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Ensuite, pipette les iPSCs en cellules simples et compter les cellules avec une chambre de comptage cellulaire.

Sélectionnez environ 150 cellules individuelles digérées et diluer avec le milieu MES dans un plat de 10 centimètres, la culture à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Après environ 10 jours, sous un microscope inversé, utilisez 10 pointes stériles de pipette de microlitre pour choisir des colonies simples et transférer chaque colonie dans 50 microlitres de solution TVP dans une plaque de 96 puits. Digérer à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Une cueillette manuelle fiable du clonage est essentielle au succès de la récolte des cellules souches pluripotentes induites éditées par CRISPR/Cas9. Ensuite, transférez et divisez les cellules digérées de chaque puits en deux autres plaques de culture de 96 puits. Incuber à 37 degrés Celsius jusqu’à 70% confluent.

Avec les colonies cellulaires à 70% de confluence, retirer le milieu dans la plaque de 96 puits. Ajouter 25 microlitres de réattant lysis contenant 1% de solution Proteinase K à chaque puits et transférer le lysate dans une autre plaque PCR de 96 puits. Sceller la plaque PCR avec des joints adhésifs et incuber la plaque dans un cycleur thermique à 55 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis à 95 degrés Celsius pendant 45 minutes pour lyser les cellules et dénoter la Proteinase K.Then, dans un tube PCR, ajouter deux microlitres du lysate, 10 microlitres de 2x ADN Polymerase Premix, 7 microlitres d’eau sans DNase , et un microlitre d’amorce DMD Exon23.

Démarrez la réaction PCR selon le manuscrit. Ensuite, chargez la réaction PCR fournie avec 2,2 microlitres de tampon de chargement sur un gel agarose de 2%. Faire fonctionner le gel de 100 à 150 volts pendant 30 minutes et inspecter le gel sous la lumière UV.

Dans ce protocole, deux ARN guides qui flanquent le mutant Exon23 ont été conçus. Après que cas9-23-20-gélifiés de double-brin et non-homologue fin-jointant, exon23 mutant a été supprimé, permettant la production tronquée mais fonctionnelle de dystrophine. Pour éviter la fuite de la solution Trypsin, nous devons appliquer la graisse uniformément au fond des anneaux.

La combinaison de l’édition du génome CRISPR/Cas9 avec un système d’activation myoD clouté fournit une stratégie sûre, réalisable et efficace pour la transplantation autologue chez les patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne avec des cellules progénitrices basiques de récupération génétique.