Name: Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 11 s
Description: Apprenez à quantifier les réponses immunitaires chez Arabidopsis thaliana par l'éclat oxydatif et l'inhibition de croissance des plantules. Ces méthodes rapides permettent de comparer efficacement les génotypes.

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Les travaux de notre laboratoire sont financés par le Programme de découverte du Conseil canadien de recherches sur les ressources naturelles et le génie (CRSNG), le Fonds du chef de la Fondation canadienne pour l'innovation John R. Evans et l'Université Queen's. KS et IS sont appuyés par des bourses d'études supérieures de l'Ontario et des bourses d'études supérieures du CRSN Canada pour les étudiants à la maîtrise (CGS-M).

1. Détection de l'éclatement de ROS dans les disques de feuilles d'Arabidopsis suivant l'obtention immunitaire
<ol><li>Croissance et entretien des usines.<ol>
<li>Pour synchroniser la germination, stratifier les graines d'Arabidopsis en suspendant environ 50 graines dans 1 ml d'agar stérile de 0,1 % [w/v] et les stocker à 4 oC (pas de lumière) pendant 3 à 4 jours. REMARQUE : Stratisfier un contrôle de fond de type sauvage (par exemple, Col-0) et des génotypes à rendement immunitaire élevé et faible (par exemple, cpk28-1 et bak1-5, respectivement) pour servir de contrôles internes.</li>
		<li>Semer les graines sur le sol et germer dans des conditions de courte journée standard(22 oC, 10 h de lumière, 150 mE/m 2/s d'intensité lumineuse et 65 à 70 % d'humidité relative).</li>
		<li>Après environ 7 jours, utilisez des forceps pour transplanter des semis individuels dans de nouveaux pots, séparés d'au moins 4 cm pour permettre le développement complet de la rosette. Transplantez 6 à 12 semis par génotype et retournez à des conditions de courte journée standard. Arroser et fertiliser régulièrement les plantes (1 g/L de 20-20-20 engrais toutes les 2 semaines).</li>
	</ol></li>
	<li>Recueillir les disques de feuilles dans des assiettes de 96 puits pour la récupération pendant la nuit.<ol>
<li>À 4-5 semaines après la germination (Figure 1A), utilisez un poinçon de biopsie de 4 mm pour enlever un disque de feuille par plante, en évitant la veine moyenne et en prenant soin de limiter les blessures (Figure 1B). Placer les disques de feuilles dans une plaque de luminomètre inutilisée de 96 puits contenant 100 oL de ddH2O avec le côté adaxial orienté vers le haut pour empêcher la dessiccation22 (Figure 1C). Si vous évaluez plusieurs facteurs, retirez 1 disque de feuille de la même feuille pour chaque traitement de l'éveil. REMARQUE : Échantillondez les feuilles qui sont complètement élargies, de la troisième à la cinquième place du haut de la rosette, et à peu près de la même taille et de la même âge pour limiter la variabilité. Si possible, couper les disques de feuilles en deux à l'aide d'une lame de rasoir avant la récupération pendant la nuit, car cela augmente la surface exposée à la solution d'incitation23.</li>
		<li>Récupérer toute la nuit à température ambiante pour éviter l'interférence du ROS produit par la blessure lors de la collecte du disque de feuilles. Couvrir les plaques avec un couvercle pour éviter l'évaporation.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuer le traitement d'incitation et mesurer la production de ROS.<ol>
<li>Programmez le lecteur de plaque avant d'ajouter la solution de réaction, car cela réduira le temps entre l'initiation de l'éclatement ros et les premières mesures enregistrées. Utilisez un logiciel commercial qui convient au lecteur de plaques. Dans notre cas (voir Tableau des contenus),cliquez sur Paramètres, et sélectionnez le LUM96 Cartridge et le type de lecture cinétique. Cliquez sur la catégorie Zone lecture et faites glisser pour sélectionner un sous-ensemble de puits ou la plaque entière à lire. Sous l'onglet PMT et Optique, fixez le temps d'intégration à 1 000 ms. Sous l'onglet Timing, fixez le temps d'exécution total à 40-60 min et l'intervalle à 2 min. </li>
		<li>Retirer l'eau de chaque puits à l'aide d'une pipette multicanal. REMARQUE : Ne perforez pas les disques de feuilles, car cela peut causer un stress de blessure et entraîner des sorties DE ROS plus variables.</li>
		<li>Préparer une solution de réaction contenant 100 M de luminol, 10 g/mL HRP, et la concentration souhaitée de l'obspirateur (par exemple : elf18 à 1 nM, 10 nM, 100 nM, ou 1 000 nM) en ddH2O stérile en utilisant 10 ml de solution pour une plaque de 96 puits. REMARQUE : Dissoudre les peptides lyophilisés dans des h2O stériles dans des tubes à faible liaison pour faire un bouillon de 10 mm, un gel éclair dans le liquide N2et le stocker à -80 oC. Lorsqu'ils sont prêts à l'emploi, diluer les stocks dans le H2O stérile pour générer un stock de travail de 100 M et le stocker à -20 oC.</li>
		<li>Utilisez une pipette multicanal pour distribuer 100 L du mélange de réaction à chaque puits, en ajoutant la solution à tous les disques de feuilles du même traitement en même temps22. Inclure une réaction de contrôle (aucun sourceur) pour chaque génotype afin d'évaluer les niveaux de ROS basiques en l'absence d'obtention. Mesurez immédiatement les émissions de lumière pour toutes les longueurs d'onde du spectre visible à l'aide d'un lecteur de microplaques. REMARQUE : Préparez et appliquez la solution de réaction sous faible luminosité, car le luminol et le HRP sont des réactifs sensibles à la lumière. Gardez les réactifs sur la glace ou à -20 oC à moins d'être utilisés.</li>
		<li>Mesurer l'émission de lumière avec un temps d'intégration de 1 000 ms à intervalles de 2 min sur une période de 40 à 60 min dans un lecteur de microplaques afin de capturer l'éclatement oxydant dynamique (Figure 1D). REMARQUE : Utilisez un temps d'intégration plus long pour améliorer la sensibilité aux résultats11, tout en veillant à ce que tous les échantillons dans une plaque de 96 puits puissent être mesurés en un seul intervalle.</li>
	</ol></li>
	<li>Interprétation des données.<ol>
<li>Pour chaque génotype, utilisez une application de feuille de calcul pour calculer le nombre moyen de photons et l'erreur standard à chaque point de temps, et affichez la production DE ROS en fonction du temps à l'aide d'une parcelle de dispersion. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59437/59437eq1.jpg"> Où t - chaque point de temps
</li>
		<li>Vous pouvez également résumer le nombre de photons pour chaque disque de feuille et présenter la moyenne de ces valeurs pour chaque génotype à l'aide d'un graphique à barres avec des barres d'erreur standard ou une boîte et une parcelle de moustaches. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59437/59437eq2.jpg">
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Seedling Growth Inhibition Assay
<ol><li>Stériliser les graines et semer sur les assiettes De Murashige et Skoog (MS).<ol>
<li>Préparer une demi-résistance stérile (0,5x) moyenne de SP (2,16 g/L) contenant 0,8 % d'agar [w/v]. Verser le support dans des plaques (90 x 15 mm) dans une hotte à débit laminaire.</li>
		<li>Stériliser environ 100 graines dans un tube microcentrifuge en lavant avec 1 ml d'éthanol à 70 % pendant 2 min et retirer par aspiration. Ajouter 1 ml d'eau de Javel à 40 % et incorporer délicatement la roche pendant 17 min à température ambiante. Retirer l'eau de Javel par aspiration et laver trois fois dans 1 ml d'eau stérile pendant 5 min. Resuspendre dans 1 ml d'agar stérile de 0,1 %. REMARQUE : Vous pouvez également utiliser un protocole de stérilisation des graines de gaz chlore24.</li>
		<li>Semer environ 100 graines par génotype sur des plaques d'agar MS à l'aide d'une pipette et sceller avec du ruban adhésif micropore dans une hotte à écoulement laminaire. REMARQUE : Évitez de placer les graines à proximité, car cela rendra la transplantation des semis difficile plus tard.</li>
		<li>Stratifier les graines en plaçant les plaques à 4 oC (pas de lumière) pendant 3-4 jours pour synchroniser la germination (Figure 2A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transplanter les semis dans des plaques de 48 puits contenant des peptides d'incitation immunitaire.<ol>
<li>Après stratification, déplacez les plaques à la lumière dans des conditions de courte journée(22 oC, 10 h de lumière, 150 mE/m 2/s d'intensité lumineuse et 65-70% d'humidité relative) pendant 3-4 jours pour permettre la germination.</li>
		<li>Dans une hotte à débit laminaire, préparer des dilutions peptidiques (0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM et 1 000 nM) dans un média liquide stérile de 0,5x MS contenant 1 % de saccharose [w/v], en utilisant 25 ml de MS pour chaque plaque de 48 puits. Préparer les plaques en pipetilisant 500 l de milieu liquide MS ou de milieu MS contenant des peptides par puits. Si disponible, utilisez un pipettor répétitif pour la préparation de la plaque afin d'accélérer le processus. REMARQUE : Pour chaque génotype, cultiver des semis dans la SP sans obtenir de facteur à l'autre pour tenir compte des différences inhérentes à la croissance des semis.</li>
		<li>À l'aide de forceps stériles, transplantez soigneusement un semis à chaque puits de la même taille et de la même âge, en veillant à ce qu'il n'y ait aucun dommage au semis ou à la rupture de la racine et que la racine soit immergée dans les médias. Pour chaque génotype, transplanter un minimum de 6 à 8 semis dans chaque dilution peptidique (figure 2B). REMARQUE : Transplanter les semis à 4 jours après la germination, car les racines courtes sont plus faciles à manipuler, et les semis plus anciens peuvent donner des résultats moins optimaux.</li>
		<li>Plaques d'étanchéité avec du ruban adhésif micropore et retour à la lumière dans des conditions de temps court standard (22 oC, 10 h de lumière, 150 mE/m2/s intensité lumineuse et 65-70% d'humidité relative). Laisser pousser les semis pendant 8 à 12 jours.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Déterminer l'inhibition de la croissance en pourcentage.<ol>
<li>Retirer soigneusement les semis des assiettes de 48 puits et les sécher en tapant sur du papier essuie-tout. Peser les semis à l'échelle analytique et enregistrer les valeurs. Si disponible, utilisez une échelle analytique équipée de sortie USB pour enregistrer les valeurs de poids frais sur une feuille de calcul. Avant de peser les semis, prenez une photo pour afficher visuellement l'inhibition de la croissance (figure 2C).</li>
		<li>Déterminer l'inhibition de la croissance en pourcentage des semis traités par l'un ou l'autre par rapport aux semis cultivés dans la SP seulement (figure 2D) comme suit : <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59437/59437eq3.jpg">
</li>
		<li>Tracez les données à l'aide d'un graphique à barres avec des barres d'erreur standard ou à l'aide d'une parcelle de boîte et de moustaches pour mieux afficher la variance inter-expérimentale.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Cet article décrit deux méthodes pour assainer les réponses immunitaires déclenchées par modèle dans Arabidopsis, offrant des approches quantitatives à l'évaluation de la production immunitaire sans l'utilisation d'équipement spécialisé. En combinaison, le ROS et le SGI déclenchés par des motifs peuvent être utilisés pour évaluer les réponses précoces et tardives à la perception des microbes, respectivement.
La principale limitation de l'effort oxydatif est la variabilité. Pour des ra...

Pour percevoir et se défendre contre les agents pathogènes, les plantes ont évolué récepteurs de reconnaissance des modèles liés à la membrane (PRR) qui détectent les molécules microbiennes conservées en dehors de la cellule connue sous le nom de modèles moléculaires microbe-associés (MAMPs)1. La liaison des MMP à leurs PrR cognate initie la signalisation immunitaire médiée par la kinase protéique, ce qui entraîne une résistance aux maladies à large spectre2. L'une des premières réponses après l'activation de PRR est la phosphorylation et l'activation des protéines hydropètes DE membrane plasmatique intégrale RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) qui catalysent la production d'espèces d'oxygène réactif extracellulaires (ROS)3 , 4. ROS jouent un rôle important dans l'établissement de la résistance aux maladies, agissant à la fois comme messagers secondaires pour propager la signalisation immunitaire ainsi que les agents antimicrobiens directs5. La première observation d'une rafale oxydative immunisée a été décrite utilisant des tubercules depomme de terre de cv. Rishiri suivant l'inoculation d'infestans de Phytophthora 6. La production de ROS a été évaluéedans plusieurs espèces végétales utilisant des disques de feuille 7, cultures de suspension cellulaire8,et protoplastes6. Décrit ici est une méthode simple pour assainer la production de ROS déclenchée par des motifs dans les disques de feuilles d'Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).
En réponse à la perception de MAMP, les protéines RBOH activées catalysent la production de radicaux de superoxyde (O2-), les radicaux hydroxyles (OH), et l'oxygène de singlet (1O2) qui sont convertis en peroxyde d'hydrogène (H2O 2) dans l'espace extracellulaire9. H2O2 peut être quantifié par chemiluminescence à base de luminol en présence de l'agent oxydant raifort peroxidase (HRP)10. HRP oxyde H2O2 générant un ion hydroxyde (OH)et un gaz d'oxygène (O2) qui réagissent avec le luminol pour produire un intermédiaire instable qui libère un photon de lumière10. L'émission de photons peut être quantifiée en tant qu'unités lumineuses relatives (RLUs) à l'aide d'un lecteur de microplaques ou d'un imageur capable de détecter la luminescence, qui sont devenues des pièces d'équipement standard dans la plupart des laboratoires moléculaires. En mesurant la lumière produite sur un intervalle de 40-60 minutes, une rafale oxydative transitoire peut être détectée dès 2-5 minutes après le traitement de l'incitation, avec un pic de 10-20 minutes, et revenir à des niveaux basaux après 60 minutes11. La lumière cumulative produite au cours de ce cours de temps peut être utilisé comme une mesure de la force immunitaire correspondant à l'activation des protéines RBOH12. Pratiquement, cet essai ne nécessite pas d'équipement spécialisé ou de préparation d'échantillons encombrants.
Le pic peu de temps après la détection de MAMP, l'éclatement oxydatif estconsidéré une réponse immunitaire tôt, avec l'activation de MAPK et la production d'éthylène 5. Les réponses immunitaires postérieures incluent la reprogrammation transcriptionnelle, la fermeture stomatal, et le dépôt de callose2,5. L'exposition prolongée aux MAMP active continuellement la signalisation immunitaire énergétiquement coûteuse entraînant l'inhibition de la croissance des plantes, ce qui indique un compromis entre le développement et l'immunité13. L'inhibition de la croissance des semis déclenchéepar par les motifs (SGI) est largement utilisée pour évaluer la production immunitaire dans l'Arabidopsis et a fait partie intégrante de l'identification de plusieurs composants clés de la signalisation immunitaire, y compris les PrR14,15 ,16. Par conséquent, cet article présente en outre un analyse pour le SGI déclenché par le modèle dans Arabidopsis, par lequel les semis sont cultivés dans des plaques multi-bien contenant des médias standard ou des médias complétés par un stimulant immunitaire pendant 8-12 jours, puis pesé à l'aide d'une échelle analytique.
Pour démontrer comment les essais ROS et SGI peuvent être utilisés pour surveiller la signalisation par le PRR, trois génotypes qui représentent des extrants immunitaires variables ont été choisis : (1) le type sauvage Arabidopsis accession Columbia (Col-0), (2) le bak1-5 dominant-négatif mutant dans lequel le multi-fonctionnel PRR co-récepteur BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED KINASE 1 (BAK1) est non fonctionnel dans la signalisation immunitaire17,18, et (3) le mutant récessif cpk28-1, qui n'a pas le protéine régulatrice CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE 28 (CPK28) et affiche des réponses immunitaires accrues19,20. Les essais ROS et SGI sont présentés en réponse à un épitope de peptide d'elfe synthétiquement produit18 du facteur bactérien d'allongement Tu (EF-Tu), reconnu en Arabidopsis par le PRR EF-Tu RECEPTOR (EFR)15. Ces protocoles peuvent être utilisés avec d'autres stimulants immunitaires tels que la flagelline de protéine de motilité bactérienne14 ou les protéines endogènes d'incitation de plante (AtPeps)16,cependant, il convient de noter que la réactivité de plante diffère selon le l'obtenir21. Ensemble, les essais ROS et SGI peuvent être utilisés pour l'évaluation rapide et quantitative des réponses précoces et tardives de PRR-négociées.

<table><tbody><tr><td>20-20-20 Engrais</td><td>Plant Prod</td><td>10529</td><td>Mélanger 1g/L dans de l’eau et appliquer sur les plantes toutes les 2 semaines pour une croissance optimale.</td></tr><tr><td>Poinçon à biopsie de 4 mm</td><td>Medical Mart</td><td>232-33-34-P</td><td>Un set de foreurs de liège d’une surface de 0,125 cm^2 peut également être utilisé.</td></tr><tr><td>Plaques stériles à 48 puits avec couvercle</td> Balance analytique <td>CLS3548</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>avec projet Sheid</td><td>VWR</td><td>VWR-225AC</td><td>Toute balance analytique standard peut être utilisée pour les tests d’initiation de croissance, cependant, une sortie informatique directe est optimale.</td></tr><tr><td>BioHit mLine Pipette mécanique multicanaux 12 (30-300 uL)</td><td>Sartorius</td><td>725240</td><td>N’importe quelle pipette multicanaux peut être utilisée, ainsi qu’un seul pipeteur si nécessaire.</td></tr><tr><td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td><td>EZ Biolab</td><td>cp7211</td><td>Stocker 10 mM de peptide stock à -80C dans des tubes à faible liaison protéique. Une fois décongelé, stockez le stock de travail de 100 uM à -20 °C.</td></tr><tr><td>Pince</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Raifort Peroxydase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6782</td><td>Dissoudre dans de l’eau pure. Conserver à -20C et à l’abri de la lumière.</td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8511</td><td>se dissoudre dans le DMSO. Conserver à -20C et à l’abri de la lumière.</td></tr><tr><td>Sel basal Murisage et Skoog Cedarlane</td><td>Labs</td><td>MSP09-100LT</td><td>Magasin au 4C.</td></tr><tr><td>Sol</td><td>SunGrow Horticulture</td><td>Sunshine Mix #1</td><td>D’autres types de sol peuvent également être utilisés pour cultiver Arabidopsis. Mélanger avec de l’eau lors du remplissage des casseroles.</td></tr><tr><td>SpectraMax Paradigm Lecteur de microplaques multimode avec module LUM</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>Doit demander un devis Tout</td><td>lecteur de plaques capable de détecter la luminescence peut être utilisé pour ces dosages.</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389-1KG</td><td>Conserver à température ambiante.</td></tr><tr><td>Plaques en polystyrène blanc à 96 puits</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-589</td><td></td></tr></tbody></table>

pattern-triggered oxidative burst and seedling growth inhibition assays in arabidopsis thaliana

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Les plantes ont développé un système immunitaire robuste pour percevoir les agents pathogènes et se protéger contre les maladies. Cet article décrit deux essais qui peuvent être employés pour mesurer la force de l'activation immunisée dans Arabidopsis thaliana suivant le traitement avec des molécules d'éveil. Présenté en premier est une méthode pour capturer l'éclatement oxydatif rapidement induit et dynamique, qui peut être surveillé à l'aide d'un analyse à base de luminol. La deuxième est une méthode décrivant comment mesurer l'inhibition induite par le système immunitaire de la croissance des semis. Ces protocoles sont rapides et fiables, ne nécessitent pas de formation ou d'équipement spécialisé, et sont largement utilisés pour comprendre la base génétique de l'immunité végétale.

Mutant cpk28-119,25 et bak1-517,18 plantes ont été utilisées pour démontrer les résultats attendus pour les génotypes avec des réponses immunitaires élevées et faibles, respectivement, en rafale oxydative et SGI tests par rapport à un contrôle de fond de type sauvage (Col-0). Pour évaluer les effets dépendants de la dose, une série de dilution peptide 10 ...

Cet article décrit deux méthodes pour quantifier des réponses de défense dans Arabidopsis thaliana suivant l'exposition aux eliciteurs immunisés : l'éclatement oxydant transitoire, et l'inhibition de la croissance de plant.

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Ces analyses peuvent être utilisées pour évaluer et comparer les extrants immunitaires de différents génotypes végétaux. Le principal avantage de ces techniques est qu’elles sont rapides, fiables et utilisent des équipements de laboratoire communs. Pour l’essai d’inhibition de croissance, les semis de la même taille et âge devraient être transplantés et complètement effacés secs avant de peser pour limiter la variation.À quatre à cinq semaines après la germination, utilisez un poinçon pointu de biopsie de quatre millimètres pour enlever un disque de feuille par plante d’Arabidopsis, évitant la midvein et prenant soin de limiter la blessure. Recueillir les disques dans des puits individuels d’une plaque de luminomètre inutilisée de 96 puits contenant 100 microlitres d’eau double distillée par puits, côté adaxial vers le haut, pour éviter la dessication. Si vous évaluez plusieurs facteurs d’obtention, retirez un deuxième disque de feuille de la même feuille pour chaque traitement d’elicitor, et couvrez la plaque avec le couvercle pour permettre aux disques de feuille de récupérer pendant la nuit à température ambiante.Le lendemain matin, définissez les paramètres du lecteur de microplaques à un temps d’intégration de 1 000 millisecondes en intervalles de deux minutes sur une période de 40 à 60 minutes pour capturer l’éclatement oxydatif dynamique. Ensuite, utilisez une pipette multicanal pour remplacer l’eau de chaque puits par 100 microlitres de solution de réaction fraîchement préparée, y compris un contrôle, aucune réaction de elicitor pour chaque génotype pour évaluer les niveaux basaux d’espèces d’oxygène de réaction en l’absence d’obtention. Ensuite, mesurez immédiatement l’émission de lumière pour toutes les longueurs d’onde dans le spectre visible sur le lecteur de microplaque.À quatre jours après la germination, chargez chaque puits d’une plaque de 48 puits avec 500 microlitres de moyenne de SP complétés par une dilution du peptide de elicitor. Ensuite, utilisez des forceps stériles pour transplanter soigneusement six à huit semis de la même taille, âge et génotype à chaque dilution peptidique, en prenant soin qu’il n’y a aucun dommage au semis ou à la rupture de la racine et que la racine est immergée dans le milieu. Lorsque tous les semis ont été plaqués, sceller les plaques avec du ruban Micropore et placer les plantes dans des conditions standard de courte journée pendant huit à 12 jours.Pour déterminer l’inhibition de croissance en pourcentage, prenez une photo pour enregistrer visuellement l’inhibition de la croissance avant d’enlever soigneusement les semis de chaque puits. Ensuite, tamponnez les racines sur une serviette en papier pour sécher, et pesez chaque semis sur une échelle analytique. Dans cette expérience représentative, les plantes mutantes avec la signalisation immunisée hyperactive ont démontré un éclat oxydant cumulatif et moyen plus élevé comparé aux usines d’Arabidopsis sauvage-type, alors que les usines mutantes avec la signalisation immunisée altérée ont montré un éclat oxydant réduit aux concentrations entre 10 et 1.000 nanomolar.Les différences attendues dans l’inhibition de la croissance des semis pourraient également être discernées entre tous les génotypes cultivés dans 100 et 1000 concentrations nanomolaires de peptide de elicitor. Lorsqu’ils sont cultivés dans la dilution peptidique de 1000 nanomolaires, les mutants ayant une signalisation immunitaire hyperactive étaient nettement plus petits que les plantes de type sauvage cultivées dans les mêmes conditions, tandis que les mutants ayant une signalisation immunitaire altérée présentaient une faible inhibition de la croissance par rapport aux plantes de type sauvage. Ces méthodes fournissent des preuves de réponses immunitaires précoces et tardives.Plusieurs autres techniques, y compris les analyses de kinase MAP, l’expression des gènes induits par les pathogènes et les analyses d’infection, peuvent être utilisées pour délimifier ces voies. Ces techniques ont été modifiées pour être utilisées dans des écrans à grande échelle, qui ont permis d’identifier avec succès les protéines des récepteurs pathogènes et plusieurs autres composants de signalisation.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

A la mort cellulaire à base d'analyse pour PTI dans les plantes de Nicotiana benthamiana est décrite.

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Fluorescence microscopie dépistage et séquençage de prochaine génération: des outils utiles pour l&#39;identification des gènes impliqués dans des organites intégrité

Source: Liu, X., et al. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method to assess the bacterial load in Arabidopsis thaliana leaves infected with Pseudomonas syringae. Leaf discs from infected leaves are homogenized, serially diluted, and plated onto nutrient-rich agar to promote bacterial colony formation. Colony counts are then used to...

Assessing Pseudomonas syringae Infection Load in Arabidopsis thaliana Leaves

Cette vidéo montre un test permettant de mesurer l’explosion oxydative dans les feuilles d’Arabidopsis lors de l’élicitation immunitaire. Les disques de feuilles, coupés dans les feuilles des plantes, sont incubés avec des peptides bactériens fonctionnant comme des motifs moléculaires associés aux microbes ou MAMP. Lors de la détection des MAMPs, les cellules végétales induisent la production de ROS extracellulaires, qui sont détectés à l’aide d’un test de chimiluminescence.

Un test pour détecter l’explosion oxydative dans les disques de feuilles d’Arabidopsis lors de l’élicitation immunitaire

Cette vidéo montre le test d’inhibition de la croissance des plantules chez la plante Arabidopsis thaliana. L’impact d’une concentration accrue d’éliciteur de peptides immunitaires sur la croissance des plantules est déterminé.

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Bactérienne Feuille Infiltration Essai de caractérisation fine des réponses de défense des plantes à l&#39;aide du<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystème

L’objectif de cette étude était de déterminer les effets de l’eau de Javel et de chlore stérilisation au gaz sur la germination des graines d’une gamme d’Arabidopsis génotypes cultivés sur des milieux stériles. Stérilisation optimisé protocoles ont été développés pour prévenir la croissance des contaminants microbiens, tout en assurant la survie des graines satisfaisante.

Méthode normalisée pour la stérilisation à haut débit des graines d’Arabidopsis

Un protocole à haut débit pour la stérilisation de surface des graines d’Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) est fourni, optimisant les étapes de manipulation des liquides avec un simple dispositif d’aspiration construit avec une pompe à vide. Des centaines d’échantillons de semences peuvent être stérilisés en surface en une journée.

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Nous décrivons ici un outil avancé conçu pour le suivi de la biosynthèse de la chlorophylle au cours des premiers stades de la désétiolement des plantules d’Arabidopsis . La nouvelle méthodologie fournit une imagerie non invasive de fluorescence de la chlorophylle en temps réel à haute résolution spatiale et temporelle.

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Ici, nous présentons une méthode simple d’observation directe et de mesure automatisée des réponses stomatiques à l’invasion bactérienne chez Arabidopsis thaliana. Cette méthode exploite un dispositif d’imagerie stomatique portable, ainsi qu’un pipeline d’analyse d’images conçu pour les images de feuilles capturées par l’appareil.

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Ce protocole décrit une approche à haut débit pour évaluer la fuite d’ions de la plante, l’activité de la peroxydase et la production de callose dans le même échantillon.

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Apprenez à quantifier les réponses immunitaires chez Arabidopsis thaliana par l'éclat oxydatif et l'inhibition de croissance des plantules. Ces méthodes rapides permettent de comparer efficacement les génotypes.

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