Améliorer l'engraftment des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l'homme par l'intermédiaire d'une inhibition transitoire de l'activité de Rho Kinase

Nos données démontrent que l’inhibition transitoire de l’activité rho-kinase améliore l’adhérence, la survie, et l’engraftment des cardiomyocytes hiPSC-dérivés après avoir été transplantés dans les coeurs animaux infarctus. Nous fournissons une méthode simple, peu coûteux, bien que très efficace pour augmenter l’engraftment des cardiomyocytes transplantés hiPSC-dérivés dans les coeurs animaux blessés. Comme cette technique peut améliorer les taux d’engraftment cellulaire en toute sécurité et efficacement dans l’infarctus cardiaque aigu et l’insuffisance cardiaque, elle contribue à l’amélioration résultante de la fonction cardiaque, des vascularités et de l’apoptose.

Bien que nous n’avons testé nos protocoles que dans des hiPSC, ces méthodes peuvent être appliquées à d’autres types de cellules, comme les cellules souches embryonnaires, les cellules souches mésenchymales, et cetera. La dose et la durée du traitement Y-27632 sont critiques. La démonstration visuelle peut démontrer en détail toutes les étapes clés du protocole, ce qui est bénéfique pour quelqu’un qui n’a jamais effectué cette technique auparavant.

Le jour 21 après la différenciation hiPSC-CM, aspirer le milieu et laver les cellules avec PBS stérile une fois. Incuber les cellules avec 0,5 millilitres d’enzymes de dissociation cellulaire par puits à 37 degrés Celsius pendant cinq à sept minutes. Après le temps d’incubation, pipette à plusieurs reprises la suspension cellulaire à l’aide d’une pipette d’un millilitre afin de bien dissocier les cellules.

Ensuite, ajoutez un millilitre de solution neutralisante à chaque puits, recueillez le mélange cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres et centrifugez à 200 fois g pendant trois minutes. Après la centrifugation, jetez le supernatant et réutilisez les cellules dans la solution neutralisante. Ensuite, replanter les cellules sur des plaques de six puits recouvertes de gélatine à une densité de deux millions de cellules par puits.

Après 24 à 48 heures, remplacer le milieu de culture par le milieu de purification pendant trois à cinq jours. Avant la transplantation, la culture des cellules dans le groupe de traitement pendant 12 heures dans RB-plus moyen complété avec 10-micromolar Y-27632. De même, effectuer un traitement verapamil sur les cellules dans le milieu RB-plus avec une micromole de verapamil pendant 12 heures.

Après le traitement, lavez les hiPSC-MC avec PBS une fois, et incuber les cellules avec 0,5 microlitres d’enzymes de dissociation cellulaire par puits pendant un maximum de deux minutes. Pipette à plusieurs reprises la suspension cellulaire à l’aide d’une pipette d’un millilitre pour dissocier complètement les cellules. Ensuite, neutralisez les cellules avec une solution neutralisante, recueillez le mélange cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres et centrifugez à 200 fois g pendant trois minutes.

Après centrifugation, résuspendez les cellules dans PBS à une concentration de 0,1 million de cellules par cinq microlitres en préparation pour l’injection. Immédiatement après l’induction de l’infarctus du myocarde, injectez cinq microlitres de hiPSC-MC de contrôle, des hiPSC-MC prétraités Y-27632, des hiPSC-MC traités au verapamil, ou un volume égal de PBS dans le myocarde de la souris à chaque site, un dans la zone infarctus et deux dans les zones autour de l’infarctus. 12 heures avant d’effectuer la détection transitoire et de la contractilité du calcium, ajouter 10 micromolaires Y-27632, 100 nanomolaires RA, verapamil d’un micromolaire, ou un volume égal de PBS dans le milieu de culture de hiPSC-MC.

Ensuite, jetez le milieu, et laver la plaque avec PBS une fois. Changez le milieu en un DMEM sans phénol contenant 0,02 poids par volume pour cent de polyol surfactant, indicateur de calcium cinq micromolaires, et le Y-27632 correspondant, RA, verapamil, ou un volume égal de PBS, et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l’incubation, jeter le supernatant, laver les cellules avec le DMEM sans colorant trois fois, et laisser reposer le milieu pendant 30 minutes pour désestérifier le colorant cartographique.

Placez le couvercle ensemencé de cellules dans une chambre de bain ouverte et insérez la chambre dans un système de microincubation équilibré à 37 degrés Celsius à l’aide d’un contrôleur automatique de température. Perfusez-le avec la solution de Tyrode, et ajoutez continuellement ri, RA, ou PBS à la solution de perfusion. Utilisez un microscope à fluorescence inversé et une tête de balayage laser pour enregistrer le calcium spontané transitoire en utilisant un balayage de ligne x-t.

Enregistrez la contraction spontanée des hiPSC-MC à l’aide de la fonctionnalité différentielle de contraste d’interférence du microscope confocal. Le taux de survie des cellules transplantées a été confirmé par l’activité accrue de luciferase. L’augmentation de la troponine cardiaque humaine T et de l’expression nucléaire humaine d’antigène a prouvé que le prétraitement de Y-27632 pourrait améliorer de manière significative le taux d’engraftment cellulaire.

Les cellules prétraitées Y-27632 présentaient une structure cytosquelettique plus grande et plus définie en forme de tige. En outre, le prétraitement Y-27632 a diminué les cellules TUNEL-positives, indiquant l’apoptose transplantée réduite d’hiPSC-CM in vivo. La tache occidentale a suggéré que le prétraitement de Y-27632 ait augmenté l’expression de bêta-1 d’intégrine et de N-cadherin et ait diminué l’expression de la chaîne lumineuse de phospho-myosin 2.

Ce changement a été normalisé 72 heures après le retrait de Y-27632. Les expériences in vitro d’attachement cellulaire de souris HL-1 ont indiqué que le prétraitement Y-27632 a augmenté de manière significative l’adhérence hiPSC-CM par rapport à HL-1. Le prétraitement Y-27632 a réduit la force contractile, la fluorescence transitoire maximale du calcium et la durée transitoire du calcium.

Y-27632 prétraitement régulé contraction cardiomyocyte en réduisant considérablement l’expression de cTnI et cTnT. Semblable à Y-27632, le prétraitement de verapamil a augmenté l’activité de luciferase et le nombre de cellules double-positives de hcTnT/HNA. L’étape la plus importante est de culture des cellules dans le groupe de traitement pendant 12 heures dans rb-plus moyen complété par 10-micromolar Y-27632.

Sur la base de cette méthode, la libération lente de Y-27632 pour augmenter davantage le taux d’engraftment cellulaire est une stratégie prometteuse. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour étudier la physiologie et la fonction de hiPSC des MC in vivo. La petite molécule CHIR99021 utilisée pour la différenciation des cardiomyocytes est dangereuse, ce qui peut provoquer une irritation respiratoire.

S’il vous plaît ne pas prendre ou inhaler en aucune façon.