Multi-locus Nombre variable Tandem-répétition Analyse du Bacterium Yersinia ruckeri par Multiplex PCR et Capillary Electrophoresis

Ce protocole de génotypage MLB a considérablement amélioré notre compréhension de l’épidémiologie et de la structure démographique mondiale de Yersinia ruckeri, une bactérie pathogène du poisson d’importance internationale. Comparé aux schémas de dactylographie Yersinia ruckeri précédemment établis, il offre une résolution de contrainte très élevée. La procédure est simple, bon marché, et attribue des résultats portables qui peuvent être facilement comparés entre les laboratoires.

La technique améliore considérablement la spécificité diagnostique et permet le traçage des infections. Par exemple, nous pouvons maintenant souvent distinguer les clones virulents de Yersinia ruckeri existant dans le contexte de souches environnementales non virulentes. Saima Nasrin Mohammad, technicienne dans notre laboratoire, démontrera la procédure.

Pour commencer, utilisez des boucles d’inoculation stériles pour semer yersinia ruckeri cultures pures sur n’importe quel type d’agar approprié sur les plats de Petri. Incuber à 22 degrés Celsius pendant un à deux jours ou 15 degrés Celsius pendant trois à quatre jours. Après cela, à l’aide de boucles d’inoculation, choisissez une seule colonie représentative de chaque boîte de Pétri et transférez-la dans des tubes de centrifugeuse de 1,5 millilitre, contenant 50 microlitres d’eau ultra purifiée à résusquer.

Vortex brièvement et incuber pendant sept minutes sur un bloc chauffant à 100 degrés Celsius. Puis, centrifugeuse à 16 000 g pendant trois minutes et utiliser une pipette pour transférer soigneusement l’ADN du modèle supernatant dans des tubes de centrifugeuse vides de 1,5 millilitre. Passez à l’étape suivante ou stockez l’ADN à 20 degrés Celsius.

Pour préparer les mélanges maîtres, calculez d’abord les volumes de reagent en fonction du nombre d’échantillons bactériens à analyser, ce qui représente également un contrôle négatif et un contrôle positif, et un volume final excédentaire de 10 %, tel que détaillé dans le manuscrit. Notez que différentes concentrations d’amorce sont utilisées. Dans deux tubes de centrifugeuse distincts, un par analyse PCR, ajouter le multiplex PCR plus le mélange principal, les amorces et l’eau sans RNase.

Vortex le maître préparé mélange doucement à basse vitesse, puis, distribuer 22 microlitres de chaque mélange maître séparément dans des puits individuels sur des bandes PCR ou des plaques. Ensuite, ajoutez trois microlitres du modèle d’ADN préparé à chaque puits contenant un mélange principal; deux puits par échantillon de bactéries, un pour chaque analyse. Utilisez l’ADN d’une souche de ruckeri Yersinia vérifiée pour un contrôle positif, et de l’eau ultra purifiée pour un contrôle négatif.

Sceller et centrifugeuse brièvement. Chargez les réactions préparées sur un thermo-cycleur PCR et configurez le programme selon le manuscrit. Le programme se terminera en moins de trois heures.

Selon les recommandations du fabricant, ajouter de la poudre de gel agarose dans un tampon TBE une fois pour atteindre 1,5 poids / volume pour cent et la chaleur à dissoudre. Avant le moulage, refroidir brièvement la solution de gel dissous sous l’eau courante, ajouter 5 microlitres de colorant fluorescent acide nucléique par 50 microlitres de solution de gel et mélanger. Assembler et niveler le plateau de moulage.

Ajouter des cônes au besoin pour le nombre d’échantillons. Verser la solution de gel dans le plâtre et attendre qu’il se solidifie. Après cela, submerger le plâtre contenant le gel dans un tampon TBE une fois dans un système d’électrophoresis gel.

Mélangez cinq microlitres des produits PCR avec deux microlitres de colorant de chargement dans de nouvelles bandes PCR. Transférer cinq microlitres des mélanges dans les puits du gel. Gardez au moins un puits vide.

Ajouter cinq microlitres d’échelle d’ADN dans le puits vide pour référence. Branchez les électrodes et exécutez le gel à 110 volts par 15 centimètres pendant environ une heure. Utilisez un système d’imagerie par gel à base d’UV pour vérifier la présence de plusieurs bandes représentant les amplicons PRC.

Après confirmation des amplicons PCR, utilisez de nouvelles bandes ou plaques PCR pour diluer les produits PCR un à 10 dans de l’eau purifiée. Vortex et centrifugeuse brièvement. Tout en travaillant dans un placard à vapeurs, préparez un mélange principal dans un tube de centrifugeuse composé de formamide et de solution standard de taille de référence.

Selon le nombre de produits PCR à analyser, utilisez les volumes de reagent tels que détaillés dans le manuscrit. Prévoyez un volume excédentaire de 10 %. Vortex brièvement et distribuer 9,5 microlitres dans des puits individuels sur une plaque PCR appropriée pour le système d’électrophoresis capillaire disponible.

Ajouter ensuite 0,5 microlitres de produit PCR dilué. Sceller et centrifugeuse brièvement. Ensuite, chargez la plaque contenant les échantillons dans un thermo-cycler PCR et dnaturez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant trois minutes avant de refroidir à quatre degrés Celsius indéfiniment.

Centrifugeuse à 1000 g pendant une minute, retirez soigneusement le joint et chargez la plaque sur un système d’électrophoresis capillaire calibré selon les instructions du fabricant. Exécutez l’électrophoresis capillaire d’analyse de fragment, utilisant des reagents comme approprié pour l’appareil de choix, et ajustez les conditions de course selon la description dans le manuscrit. Pour yersinia ruckeri VNTR capillaire électrophoresis taille appel, première importation capillaire electrophoresis fichiers de résultat dans Gene Mapper 5 logiciel.

Réglez la méthode d’analyse à, Microsatellite Default, sélectionnez le choix approprié du produit en standard de taille, puis appuyez sur le bouton Analyser. Par l’intermédiaire de l’éditeur de correspondance de taille, vérifiez l’identification correcte des fragments standard de taille et corrigez toutes les allocations visiblement erronées. Ensuite, sélectionnez l’échantillon à lire, appuyez sur le bouton Afficher le terrain et appuyez sur Contrôle A pour activer la vue de la table de dimensionnement.

Lorsque vous vous placez dans le panneau supérieur, maintenez le contrôle, tout en cliquant sur les cinq pics représentant les amplicons VNTR. Contrôle de la presse G pour filtrer la table de dimensionnement, ne montrant que les caractéristiques des cinq pics surligés, et enregistrer les appels de taille pour chaque locus VNTR pour l’application en aval. Afin de tenir compte des modèles de mobilité amplicon biaisés pendant l’électrophoresis capillaire, calculer les comptes de répétition VNTR précis en utilisant les appels de taille acquis en combinaison avec les variables spécifiques au locus.

La formule peut être implémentée dans un modèle de feuille de calcul pour l’automatisation. Dans la feuille de calcul, la répétition VNRT calculée ronde compte jusqu’à l’entier le plus proche avant l’analyse en aval. Dans le logiciel BioNumerics, créez une nouvelle base de données et choisissez d’activer le plugin MLVA.

Dans le panneau de type expérience, appuyez sur Créer un nouveau type d’expérience, choisir le type de caractère et utiliser les paramètres par défaut lorsqu’on le demande. Sélectionnez ensuite la nouvelle expérience et ajoutez de nouveaux caractères pour chacun des 10 loci VNTR, en utilisant zéro à 100 comme plage de valeur. De retour dans le panneau principal, importez les comptes répétés et les données de méthode de Yersinia ruckeri VNTR en sélectionnant les champs et les caractères d’importation.

Localisez le fichier où cela est stocké et faites des sélections dans la colonne de type Destination. Pour les VNTR, cela signifie sélectionner la valeur de caractère appropriée, tandis que les métadonnées diverses sont classées comme champs d’informations d’entrée. Les choix faits peuvent être stockés comme un modèle afin de faciliter le processus pour plus tard.

Sélectionnez les échantillons importés destinés à l’analyse du cluster MST, puis cliquez sur le nouveau bouton Créer de nouvelles comparaisons dans le panneau Comparaisons. Si vous le souhaitez pour la présentation visuelle du MST, allouez les échantillons à des groupes colorés, par exemple, selon une fonction de métadonnées particulière. Ensuite, sélectionnez analyse de cluster avancée et MST pour les données catégoriques pour générer un diagramme MST basé sur les échantillons choisis.

Modifiez davantage la présentation visuelle du MST en ajoutant des paramètres de partition, des longueurs croisées, l’étiquetage des branches de nœuds, etc. Si nécessaire, exportez le MST finalisé dans le format désiré en utilisant la sélection d’images Export. Après le multiplex PCR, l’image gel électrophoresis vérifie la présence de multiples amplicons dans les 12 voies contenant des échantillons, la première voie représentant l’échelle d’ADN utilisée.

Dans les électrophéogrammes résultant de l’électrophorèse capillaire, les différents loci VNTR peuvent être identifiés selon une combinaison de taille et d’étiquetage des colorants. Les pics orange représentent la norme de taille utilisée. Un exemple d’arbre s’étendant au minimum, basé sur les profils MLVA des isolats de Yersinia Ruckeri récupérés sur le saumon de l’Atlantique dans cinq fermes norvégiennes différentes, est montré.

On peut observer une tendance claire au regroupement liée à l’origine agricole. L’identification par MLVA de différents clones de Yersinia ruckeri dominant, par exemple, en particulier les régions géographiques des espèces de poissons, a déjà été exploitée pour améliorer les stratégies de vaccination contre cet agent pathogène.