Name: Évaluation de la multiplicité synaptique à l’aide de Patch-clamp de la cellule entière électrophysiologie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Découvrez une méthode simple pour estimer la multiplicité synaptique par électrophysiologie patch-clamp en cellule entière sur tranches de cerveau aigu. Cette technique permet d'étudier les mécanismes de transmission synaptique.

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J.S. a reçu des bourses d’études supérieures de l’Ontario. W.I. a reçu une nouvelle bourse de chercheur de recherche en santé mentale du Canada. Ce travail est soutenu par les subventions de fonctionnement à Florian de Sciences naturelles et génie conseil de recherches du Canada (06106-2015 RGPIN) et l’Institut canadien de recherche en santé (PJT 148707).

Toutes les expérimentations animales sont approuvées par le Comité de protection des animaux de l’Université de Western Ontario selon le Canadian Council on Animal Care Guidelines (PUA #2014-031).
1. les solutions
<ol><li>
Solution de tranchage
	<ol>
<li>Référer au tableau 1 pour la composition de la solution de tranchage.</li>
		<li>Préparer une solution 20 x à l’avance et les conserver à 4 ° C pendant environ 1 mois.</li>
		<li>Pour 1 x tranchage de solution, dissoudre NaHCO3, glucose et saccharose dans ddH2O et ajoutez le bouillon de 20 x. Assurez-vous que l’osmolarité est entre 315-320 mOsm et conserver la solution pour pas plus de 1 semaine à 4 ° C.</li>
		<li>Remplir deux béchers de 100 mL de solution de tranchage et recouvrez-les de parafilm. Faites refroidir la solution dans un congélateur jusqu'à ce que la solution est partiellement congelée (environ 20 min dans le congélateur-80 ° C). À l’aide d’un tube de dispersion de gaz, bulle les deux béchers de tranchage solution avec 95 % O25 % CO2 pendant 20 min sur la glace.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="5">Concentrations des dilutions (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Tranchage</td>
			<td>FSCA normal</td>
			<td>Faible Ca2 + FSCA</td>
			<td>FSCA SR+</td>
			<td>Pipette/interne</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>87</td>
			<td>126</td>
			<td>126</td>
			<td>126</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>2.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0,5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0,5</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>SrCl2
</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>2.5</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>7</td>
			<td>1.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1.5</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.25</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>25</td>
			<td>26</td>
			<td>26</td>
			<td>26</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glucose</td>
			<td>25</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Saccharose</td>
			<td>75</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>K-gluconate</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>116</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na-gluconate</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>12</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2-EGTA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2ATP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na3GTP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>0,3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : La composition des diverses solutions.
<ol start="2"><li>
aCSF (par tranche de restauration et d’entretien)
	<ol>
<li>Référer au tableau 1 pour la composition de l’aCSF.</li>
		<li>Préparer une solution 20 x à l’avance et les conserver à 4 ° C pendant environ 1 mois.</li>
		<li>Pour 1 x aCSF, dissoudre NaHCO3 et glucose dans ddH2O et ajoutez le bouillon de 20 x. Assurez-vous que l’osmolarité est entre 298-300 mOsm. Utiliser la solution sous 1 jour.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
aCSF (faible Ca2 + pour l’enregistrement)
	<ol>
<li>Référer au tableau 1 pour la composition de la bas Ca2 + FSCA.</li>
		<li>Préparer une solution 20 x à l’avance et les conserver à 4 ° C pendant environ 1 mois.</li>
		<li>Pour 1 x faible Ca2 + aCSF, dissoudre NaHCO3 et glucose dans ddH2O et ajouter 20 x (CaCl2 et MgCl2 gratuit) stock, CaCl2 et MgCl2 à spécifié des concentrations. Assurez-vous que l’osmolarité est entre 298-300. Utiliser la solution sous 1 jour.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
aCSF (Sr2 + pour l’enregistrement)
	<ol>
<li>Référer au tableau 1 pour la composition de la Sr2 + FSCA.</li>
		<li>Préparer une solution 20 x à l’avance et les conserver à 4 ° C pendant environ 1 mois.</li>
		<li>Pour 1 x Sr2 + aCSF, dissoudre NaHCO3 et glucose dans ddH2O et ajouter 20 x (CaCl2 et MgCl2 gratuit) stock, LVERS2 et MgCl2 à spécifié des concentrations. Assurez-vous que l’osmolarité est entre 298-300. Utiliser la solution sous 1 jour.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Solution interne
	<ol>
<li>Référer au tableau 1 pour la composition de la solution interne de K-gluconate basé.</li>
		<li>Pour faire 20 mL de solution interne, ajouter 15 mL d’eau de qualité biologie moléculaire dans un tube de 50 mL. Effectuez les opérations suivantes sur la glace.</li>
		<li>Préparer les solutions suivantes avance à 1 M des concentrations stock en biologie moléculaire de l’eau de qualité. Ajouter (en mL) : 2.32 K-gluconate, gluconate-Na de 0,24, 0,20 HEPES, 0,16 KCl, 0,05 K2-EGTA, 0,04 MgCl2 dans le tube de 50 mL.</li>
		<li>Ajouter 100 µL de 0,3 M Na3GTP.</li>
		<li>Peser 44,08 mg K2ATP dans un tube de microcentrifuge de 2 mL et ajouter 1 mL d’eau de qualité de la biologie moléculaire, puis ajouter au tube de 50 mL.</li>
		<li>Ajuster le pH à 7,2-7,4 avec 1 M KOH. Assurez-vous que l’osmolarité est entre mOsm 283-289.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. préparation de la tranche
<ol><li>
Préparer les outils
	<ol>
<li>Versez 200 mL de FSCA dans le compartiment de récupération (construit à partir d’un bécher de 250 mL avec 4 puits et filet) et placer la chambre de récupération dans un bain d’eau (35 ° C).</li>
		<li>Couvrir la chambre avec un film de paraffine et bouillonner constamment le FSCA avec 95 % O25 % CO2 à l’aide d’un tube de verre dispersion pendant au moins 20 min.</li>
		<li>Se préparer pour la dissection en mettant en place les outils (bistouri, angle des ciseaux, forceps, pinceau fin, une cuillère en plastique).</li>
		<li>Remplissez une seringue de 60 mL avec environ 15 mL de la solution de tranchage glacée de l’étape 1.1.4.</li>
		<li>Préparer la plate-forme de dissection en plaçant un filtre en papier sur le couvercle d’une plaque bien.</li>
		<li>Préparer la chambre de tranchage en le plaçant dans le bac à glaçons et le bac de remplissage avec de la glace.</li>
		<li>Mettre en place le vibratome en obtenant une lame jetable dans le porte-lame.</li>
		<li>Faire une pipette de transfert en briser la pointe de la pipette Pasteur et en plaçant une poire en caoutchouc sur l’extrémité cassée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Disséquer le cerveau de souris
	<ol>
<li>Anesthésier l’animal dans une enceinte saturée avec 4 % isoflurane, jusqu'à ce que les réflexes spinaux sont absents.</li>
		<li>Décapiter l’animal à l’aide d’une guillotine et enlever rapidement le cerveau.<ol>
<li>Faire une incision médiane avec une lame de bistouri Swann-Morton n ° 22 de rostral de caudale.</li>
			<li>Latéralement, peler le cuir chevelu de chaque côté de la tête.</li>
			<li>Utilisation des ciseaux pour découper le crâne sur un côté de la caudale à rostrale (y compris du côté des os frontaux), utilisation attention ne pas d’endommager le cerveau.</li>
			<li>Utilisation de forceps pour soulever le morceau de crâne hors du cerveau et refroidir rapidement le cerveau avec 15 mL de solution de tranchage glacée à l’aide de la seringue de l’étape 2.1.4.</li>
			<li>Soulevez le cerveau dans le crâne.</li>
			<li>Place du cerveau dans l’un des béchers remplis d’une solution tranchage glacée (de l’étape 1.1.4) barboter avec 95 % O25 % CO2.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparer des tranches de hypothalamus souris
	<ol>
<li>Bloquer le cerveau pour la zone du cerveau désirée et couper l’angle (par exemple, pour les tranches hypothalamiques coronales, couper le tissu rostral pour le chiasma optique et caudal de la protubérance à l’aide d’une lame et s’assurer que le bloc caudal a une surface perpendiculaire à la base du cerveau).</li>
		<li>À l’aide d’un morceau coupé de papier-filtre, ramasser le cerveau du côté antérieur et coller le côté postérieur de la plaque de retenue à l’aide de colle instantanée.</li>
		<li>Placer la plaque de retenue dans la chambre de tranchage et remplir la chambre de tranchage solution du bécher deuxième étape 1.1.4 rapidement.</li>
		<li>Fixer le plateau tranchage de chambre et de la glace sur le vibratome.</li>
		<li>Définir la zone de découpage en tranches (antérieure et postérieure du cerveau) et commencer à trancher 250 tranches coronales épaisseur de µm. Recommandé de paramètres : 0.10 mm/s, amplitude de vitesse 2 mm.</li>
		<li>Couper les tranches de la taille appropriée pour la zone du cerveau désirée.</li>
		<li>Récupérer les tranches à 35 ° C pendant 30-45 min. Ensuite, retirer la chambre de récupération du bain chauffant et laisser les tranches récupérer, à température ambiante pendant une 30 min supplémentaires, tranches de conserver à température ambiante pendant le reste de la journée et continuer à bouillonner la baignoire sans cesse à 95 % O25 % CO2 .</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. whole-cell Patch ClampRecording
<ol><li>
Tirez sur les pipettes
	<ol>
<li>Selon les paramètres suggérés pour la cellule entière d’enregistrement du manuel de l’extracteur de pipette, tirer des pipettes de patch de verre paroi épaisse à une résistance de pipette de MΩ 3-5.</li>
		<li>À l’aide d’une microseringue (commercial ou maison), remplir un embout de la pipette avec solution interne filtrée. À faire une microseringue, brûler le bout d’une seringue de 1 mL et laissez la pointe tombe en créant une amende longue tip.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Obtenir la configuration de la cellule entière
	<ol>
<li>Placez la pipette d’enregistrement juste au-dessus de la pipette de tranche et le décalage actuel dans le mode de serrage de tension. Appliquez une légère pression positive à la pipette et verrouiller le robinet d’arrêt.</li>
		<li>Sélectionnez une cellule saine avec une membrane intacte et approche de la cellule avec la pipette. La pression positive devrait provoquer une légère perturbation dans les tissus (c.-à-d. une onde lente dans les tissus lors de la saisie).</li>
		<li>Lentement continuent de porter la pipette plus près à la cellule à l’aide d’un mouvement en diagonal jusqu'à ce que la pipette forme une petite fossette sur la surface de la cellule.</li>
		<li>Libérer le verrou de pression positive. La cellule va commencer à former un joint d’étanchéité et la résistance augmente au-dessus de 1 GΩ. Bride de tension, détiennent la cellule à -68 mV.</li>
		<li>Un peu de tirer à l’extérieur de la cellule en diagonale pour retirer les excès de pression de la cellule.</li>
		<li>Compenser la capacité de la pipette lents et rapides.</li>
		<li>Appliquer une brève aspiration à travers le tube relié à la titulaire de la pipette de briser la cellule et d’obtenir la configuration cellule entière.</li>
		<li>Passez en mode cellule sur la membrane test fenêtre dans une électrophysiologie d’acquisition de données et logiciel d’analyse (p. ex., Clampex).</li>
		<li>Avant chaque bride de tension d’enregistrement, effectuer un essai de membrane en utilisant le même logiciel et enregistrer les paramètres pertinents dans un livre de laboratoire (résistance de la membrane, accès résistance et capacité).</li>
		<li>Maintenir la température du bain enregistrement entre 27 et 30 ° C et le débit à 1,5 à 2,0 mL/min pour des expériences ultérieures.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. la multiplicité des expériences
<ol><li>
Expérience 1 : estimation de la multiplicité à l’aide de 4-AP
	<ol>
<li>Bride de tension, détiennent la cellule à -68 mV. Utilisant le même logiciel, d’enregistrer les sEPSCs tout en perfusant le bain avec faible Ca2 + FSCA. Enregistrement pour au moins 5 min après le début de la configuration de la cellule entière pour assurer un enregistrement de base stable, comme l’activité synaptique peut être élevée, peu de temps après la percée de la membrane.</li>
		<li>À l’aide d’une micropipette, ajoutez 4-AP pour le FSCA et bain appliquez 30 µM 4-AP. notice sEPSCs pendant au moins 10 min obtenir l’effet de drogues complet.</li>
		<li>Ajouter 0,5 µM TTX et 10 µM Cd2 + pour le FSCA avec 4-AP et enregistrer les mEPSCs pendant au moins 10 min.</li>
		<li>Pour l’analyse hors ligne, utilisez le dernier 1 min de départ immédiatement avant l’application de 4-AP (en bas Ca2 + aCSF), les 10 min d’application 4-AP et la 10e min d’application TTX.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Expérience 2 : désynchroniser la libération des vésicules à l’aide de Sr2 +
	<ol>
<li>Tout en perfusant le bain avec normal Ca2 + aCSF (le même que le FSCA bain) record sEPSCs pendant au moins 5 min.</li>
		<li>Passer de la normale Ca2 + FSCA et commencer perfusant Sr2 + aCSF (de l’étape 1.4) et sEPSCs record.</li>
		<li>Pour l’analyse hors ligne, afin de déterminer si les sEPSCs de grande amplitude sont dus au rejet synchrone de vésicules, comparer les dernières min 1 de base (chez FSCA normale) à la minute deth 10 d’application Sr2 + FSCA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Expérience 3 : tester à l’aide de libération multivésiculaires Γ- DGG
	<ol>
<li>En bas Ca2 + FSCA record sEPSCs pendant au moins 5 min.</li>
		<li>Ajouter 4-AP de 30 µM pour le FSCA grâce au système de perfusion. SEPSCs record pendant au moins 10 min.</li>
		<li>Ajouter 200 µM γ-DGG pour le FSCA avec 4-AP et noter la sEPSCs pendant au moins 10 min.</li>
		<li>Comme une expérience de contrôle dans une cellule séparée, effectuez les étapes 1-3 mais s’appliquent à une faible concentration (125 nM) de DNQX au lieu de γ-DGG.</li>
		<li>Pour l’analyse hors ligne, analyser les dernières min de chaque demande de drogue.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Expérience 4 : Stimuler les entrées afférentes afin d’accroître le potentiel d’action tir.
	<ol>
<li>SEPSCs record en normal Ca2 + FSCA.</li>
		<li>Stimuler les afférences à l’aide d’une électrode de verre monopolaire remplie de FSCA à raison de 20 Hz pour 2 s et répéter 10 fois avec un intervalle entre rafale de 20 sec.</li>
		<li>Pour analyse, utilisez les 5 000 ms avant le premier stimulus comme référence et comparer aux 10-300 ms après le stimulus final et puis prendre la variation moyenne de l’amplitude et la fréquence de plus de 10 essais.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. analyse
<ol><li>Analyser les sEPSCs et mEPSCs à l’aide d’un programme qui détecte et analyse les courants synaptiques (par exemple, les logiciels d’analyse de la Mini).<ol>
<li>En utilisant ce logiciel, utilisez les paramètres de détection suggérée pour la détection EPSCs des récepteurs AMPA (ou GABA Receptor EPSCs si courants inhibitrices d’enregistrement).</li>
		<li>Utiliser la fonction d’analyse sans escale pour détecter les EPSCs dans l’enregistrement.</li>
		<li>Analyser manuellement chaque enregistrement afin de s’assurer que le programme est détecter avec précision chaque événement (par exemple, de s’assurer que les événements ne sont pas en manquer ou comptés deux fois).</li>
		<li>Exporter les données d’événement en le copiant dans le presse-papiers et le coller dans un logiciel de gestion de données (par exemple, Excel)</li>
		<li>Calculer la moyenne fréquence et/ou l’amplitude pour chaque traitement de la toxicomanie et d’effectuer des analyses statistiques pertinentes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Une condition importante pour une expérience d’électrophysiologie de pince patch réussie est d’obtenir des tranches/cellules saines. Notre protocole décrit est optimisé pour les tranches hypothalamiques qui contiennent les neurones PVN. Autre cerveau peuvent exiger des zones modifiées solutions et méthodes tranchage21,22,23,24. Pour l’enregistrement, il est essentiel pour n’accepter les enregis...

La transmission synaptique est un mécanisme fondamental pour la communication entre les neurones et donc fonction du cerveau. La transmission synaptique est aussi labile et peut changer son efficacité de manière dépendante de l’activité ainsi qu’en réponse à des signaux modulatory1. Ainsi, l’examen de la fonction synaptique a été un thème majeur de la recherche en neurosciences. Cellule entière patch clamp électrophysiologie est une technique polyvalente qui permet de comprendre, de concevoir des modèles expérimentaux et analyses de données, des mécanismes biophysiques et moléculaires approfondies de la transmission synaptique. Une approche couramment utilisée, peut-être en raison de la simplicité de la technique et le concept, est la mesure de courants postsynaptiques excitateurs/inhibiteur miniature (mE / CISP) sous la tension de la pince configuration2,3, 4 , 5 , 6. MPSC individuels représente le flux d’ions à travers des récepteurs ionotropiques postsynaptique (par exemple les récepteurs AMPA et GABAA ) en réponse à la fixation de leurs respectifs neurotransmetteurs libérés de la terminaison présynaptique 7 . Parce que l’enregistrement est obtenu en présence de la voltage-dépendants Na+ canal bloqueur tétrodotoxine (TTX), la libération est indépendant du potentiel d’action et comporte normalement une seule Vésicule synaptique qui contient des neurotransmetteurs. Selon cette hypothèse, l’amplitude moyenne du MPSC est employé couramment comme une estimation brute pour la taille quantique, qui représente le nombre et la fonctionnalité de récepteurs post-synaptiques s’opposant à un site de sortie du single. En revanche, la fréquence de la MPSC est considéré comme une combinaison du nombre de synapses se terminant sur la cellule postsynaptique et leur probabilité de sortie moyenne. Cependant, ces paramètres ne mesurent pas une autre variable-multiplicativity des synapses ou multiplicité synaptique — qui est important pour l’efficacité de la transmission synaptique.
Basé sur la théorie quantique de la transmission synaptique7,8,9, la force d’une connexion donnée entre une paire de neurones est tributaire de trois facteurs : le nombre de synapses fonctionnelles (N), le postsynaptique réaction à la publication d’une seule Vésicule synaptique (taille quantique ; Q) et la probabilité de la libération des neurotransmetteurs (P,r). Multiplicité de synaptique est équivalente à N. Le développement de la multiplicité synaptique ou l’élagage des synapses multiplicatifs est en plastique tout au long de l’élaboration et la maladie différents États3,4,6,10. Pour cette raison, caractérisant la multiplicité synaptique a des implications importantes pour la compréhension de l’efficacité de la transmission synaptique dans la santé et la maladie. Techniques, telles que la microscopie électronique peuvent d’identifier des preuves de structure synaptique multiplicité en détectant des contacts synaptiques multiples provenant de l’axone même sur le même neurone postsynaptique11,12, 13,14. Cependant, ces multisynapses structurellement identifiés peuvent être fonctionnellement silencieux15,16. Examen fonctionnel précis de N exige techniquement difficile des approches électrophysiologiques, tels que les enregistrements de cellules entières paires qui peuvent déterminer si une connexion donnée a plusieurs sites de rejet fonctionnelle et minimal approches de stimulation qui visent à recruter un seul axone putatif.
Dans ce protocole, nous décrivons une méthode simple pour estimer la multiplicité synaptique en adoptant une méthode développée initialement par Hsia et al.,2. Cette technique consiste à mesurer la spontanée PSC (SLES SSP) et MPSC à l’aide d’électrophysiologie de cellules entières patch clamp, qui nous permet d’estimer le degré de multiplicité synaptique parmi toutes les entrées d’un neurone donné.  Tel que définie précédemment, synaptique multiplicité reflète le nombre de synapses entre un neurone donné en pré- et post-synaptiques. Si plusieurs synapses sont recrutés en même temps par un potentiel d’action, il y aura une forte probabilité de sommation temporelle des différents SSP (i.e. quantique), générant une plus grande amplitude CFP.  Dans les enregistrements de la mPSC (dans quels potentiels d’action sont bloqués par TTX), il est peu probable de sommation temporelle des individuels MPSC (non-synchrone). À l’aide de ce raisonnement, multiplicité synaptique peut être estimée en comparant l’amplitude sPSC (avec libération de potentiel d’action-dépendante) à l’amplitude de la mPSC.
Pour déterminer l’existence d’une multiplicité, les auteurs décrivent quatre expériences et leurs analyses utilisant glutamatergique EPSCs comme exemple. Cependant, la même approche peut être utilisée pour le jeûne transmission GABAergique/glycinergic (CISP). Une brève justification de chaque expérience est décrite ci-dessous. Tout d’abord, comme expliqué ci-dessus, multiplicité synaptique peut être estimée en comparant l’amplitude de sEPSCs à mEPSCs. Il existe deux conditions pour cette approche ; 1) présynaptiques axones doivent avoir un nombre suffisant de potentiels d’action pendant l’enregistrement, et 2) Pr doit être grande pour que plusieurs synapses libération neurotransmetteur à l’arrivée d’un potentiel d’action. Afin de répondre à ces exigences, sEPSCs sont pour la première fois en bas Ca2 + artificiel liquide céphalo-rachidien (aCSF) et ensuite enregistrées en présence d’une faible concentration de l’antagoniste des canaux K+ , 4-Aminopyridine (4-AP) pour augmenter l’action potentiel de tir et Pr. Puis, potentiel d’action tir est bloquée par la TTX et Pr diminué par un voltage-dépendants Ca2 + bloqueur des canaux Cd2 +. L’amplitude de sEPSCs (avec 4AP) est comparée à celle de Cpsem (avec 4AP, TTX et Cd2 +). Dans la seconde expérience, Ca2 + est remplacé par équimolaire Sr2 + dans le FSCA pour désynchroniser la libération des vésicules. Comme Ca2 + est nécessaire pour la version synchrone de vésicules, remplacement avec Sr2 + devrait éliminer le sEPSCs de grande amplitude qui témoignent de la multiplicité. En troisième lieu, mécaniquement, c’est la multiplicité peut résulter de multiples contacts synaptiques au même neurone postsynaptique ou libération multivésiculaires (c'est-à-dire plusieurs vésicules libérés au sein d’un même contact synaptique)17,18. Pour différencier les deux types de la multiplicité, la troisième expérience utilise une faible affinité, rapide dissociation antagoniste compétitif des récepteurs AMPA, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 , afin de déterminer si grand sEPSC sont le résultat de la sommation temporelle des synapses indépendants ou libération multivésiculaires agissant sur une population qui se chevauchent de récepteurs post-synaptiques. Si les événements de grande amplitude résultent de la dissémination multivésiculaires, γ-DGG sera moins efficace pour inhiber les plus sEPSCs par rapport aux plus petits, tandis que le grand sEPSCs qui découlent de la sommation temporelle de plusieurs contacts synaptiques seront affectés de la même manière par Γ-DGG. Dans la quatrième expérience, une méthode plus physiologique est utilisée pour renforcer le potentiel d’action tir, à savoir afférente stimulation synaptique. Rafales de l’activité synaptique peuvent transitoirement augmentation/faciliter la probabilité de mise à feu et de la libération de potentiel d’action spontanée des afférences stimulées. Par conséquent, cette approche permet de multiplicité de manifester d’une manière plus physiologique.
Le protocole suivant décrit la méthode pour mener ces expériences en tissu hypothalamique de souris. Plus précisément, corticotropin libérant l’hormone (CRH) des neurones du noyau paraventriculaire de l’hypothalamus (PVN) sont utilisés. Nous décrivons les procédures pour la conduite d’électrophysiologie de germes entiers patch clamp et expliquer les expériences spécifiques pour tester la multiplicité synaptique.

<table><tbody><tr><td>Seringue de 1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 lames</td><td>Fisher Scientific/autres</td><td>35698</td><td></td></tr><tr><td>22 lames</td><td>VWR/autres</td><td>21909-626</td><td></td></tr><tr><td>22 &mu ; Filtres à seringue M</td><td>Milipore</td><td>09-719-000</td><td></td></tr><tr><td>Adson foreceps</td><td>Harvard Instruments</td><td>72-8547</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux aigus coudés</td><td>Harvard Instruments</td><td>72-8437</td><td></td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10</td><td></td></tr><tr><td>Lame à double tranchant</td><td>VWR</td><td>74-0002</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtre</td><td>Sigma/autres</td><td>1001090</td><td></td></tr><tr><td>Pinceau fin</td><td>Fisher/divers</td><td>15-183-35/divers</td><td></td></tr><tr><td>Tube de dispersion de gaz</td><td>VWR</td><td>LG-8680-120</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Fresenius Kabi/autres</td><td>M60303</td><td></td></tr><tr><td>Krazy colle</td><td>divers</td><td>divers</td><td></td></tr><tr><td>Mini analyse</td><td>Synaptosoft</td><td>MiniAnalysis 6</td><td></td></tr><tr><td>Osmomoter</td><td>Wescor Inc</td><td>Modèle 5600</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur</td><td>VWR</td><td>14672-200</td><td></td></tr><tr><td>ph-mètre</td><td>Mettler Toledo</td><td>FE20-ATC</td><td></td></tr><tr><td>Poire en caoutchouc</td><td>VWR</td><td>82024-550</td><td></td></tr><tr><td>Manche de scalpel n° 3</td><td>Harvard Instruments</td><td>72-8350</td><td></td></tr><tr><td>Manche de scalpel n° 4</td><td>Harvard Instruments</td><td>72-8356</td><td></td></tr><tr><td>Lame à un seul tranchant</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Trancheuse vibrante</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Système de purification d’eau</td><td>Millipore</td><td>Milli-Q Academic A10</td><td></td></tr><tr><td>Couvercle de plaque</td><td>de puits Fisher/divers</td><td>07-201-590/divers</td><td></td></tr><tr><td><fort>Produits chimiques/réactifs</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sondes moléculaires 4-AP</td><td>Sigma</td><td>275875</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA</td><td></td><td>B1204</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2*2H2O</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>CdCl2</td><td>sigma</td><td>202908</td><td></td></tr><tr><td>DNQX</td><td>Tocris</td><td>189</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>glucose</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>K2-ATP</td><td>Sigma</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconate</td><td>Sigma</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2*6H2O</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Qualité biologie moléculaire water</td><td>Sigma</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bioshop</td><td>SOD001.1</td><td></td></tr><tr><td>Na-gluconate</td><td>Sigma</td><td>S2054</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>71504</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxine</td><td>sigma</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>SrCl</td><td>Sigma</td><td>255521</td><td></td></tr><tr><td>saccharose</td><td>Bioshop</td><td>SUC507.1</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Alamone Labs</td><td>T-550</td><td></td></tr><tr><td>yDGG</td><td>Tocris</td><td>6729-55-1</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation de la multiplicité synaptique à l’aide de patch-clamp de la cellule entière électrophysiologie

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

Dans le système nerveux central, une paire de neurones forment souvent des multiples contacts synaptiques et/ou sites de libération neurotransmetteur fonctionnelle (multiplicité synaptique). Multiplicité synaptique est plastique et change au cours du développement et dans les conditions physiologiques différentes, étant un facteur déterminant pour l’efficacité de la transmission synaptique. Ici, nous exposons les expériences pour estimer le degré de multiplicité des synapses se terminant sur un neurone postsynaptique donné à l’aide d’électrophysiologie de germes entiers patch clamp en tranches cérébrale aiguë. Plus précisément, enregistrement de voltage clamp est utilisé pour comparer la différence entre l’amplitude des courants postsynaptiques excitateurs spontanées (sEPSCs) et les courants postsynaptiques excitateurs miniature (mEPSCs). La théorie derrière cette méthode est que des entrées afférentes qui présentent une multiplicité montrera sEPSCs grande, dépendante du potentiel d’action en raison de la sortie synchrone qui survient à chaque contact synaptique. En revanche, libération de potentiel d’action indépendante (qui est asynchrone) générera plus petite amplitude mEPSCs. Cet article décrit un ensemble d’expériences et d’analyses pour caractériser l’existence d’une multiplicité synaptique et traite les exigences et les limites de la technique. Cette technique peut être appliquée afin d’étudier comment différentes interventions comportementales, pharmacologiques ou environnementales en vivo affectent l’organisation des contacts synaptiques dans certaines zones du cerveau différentes.

Le protocole ci-dessus décrit une méthode permettant d’utiliser électrophysiologie de germes entiers patch clamp pour examiner le degré de multiplicité synaptique, à l’aide de neurones hypothalamiques souris à titre d’exemple. Cette technique de préparation de tranche devrait produire des cellules viables en bonne santé qui n’ont pas une membrane gonflée ou noyau (Figure 1). Chaque étape du protocole est important pour la santé du tissu et la qualité des enregistrements.<...

Nous présentons ici un protocole permettant d’évaluer la multiplicité synaptique fonctionnelle à l’aide d’électrophysiologie de germes entiers patch clamp en tranches cérébrale aiguë.

Évaluation de la multiplicité synaptique à l’aide de Patch-clamp de la cellule entière électrophysiologie

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

Dans le cerveau, une paire de neurones forment souvent de multiples contacts synaptiques, ce qu’on appelle la multiplicité synaptique. Cependant, l’examen précis de la multiplicité synaptique nécessite des expériences techniquement difficiles. Ce protocole décrit une méthode simple pour l’estimation brute de la multiplicité synaptique utilisant l’électrophysiologie de patch-clamp de cellule entière.Cette méthode peut être appliquée à n’importe quelle espèce et région du cerveau pour étudier la multiplicité synaptique. Cette méthode exige des compétences de base en électrophysiologie patch-clamp à cellules entières. L’obtention d’enregistrements de haute qualité avec une résistance d’accès faible et stable est essentielle pour l’interprétation précise des données.Pour obtenir la configuration de cellule entière, placez la pipette d’enregistrement juste au-dessus de la tranche et compensez le courant de pipette dans le mode de pince de tension. Appliquez une légère pression positive sur la pipette et verrouillez le robinet d’arrêt. Ensuite, choisissez une cellule saine avec une membrane intacte, et approchez le tissu avec la pipette.La pression positive devrait causer une légère perturbation sur le tissu. Rapprochez lentement la pipette de la cellule en diagonale jusqu’à ce qu’une petite fossette soit formée à la surface de la cellule. Ensuite, relâchez le verrou de pression positive.La cellule commencera à former un joint, et la résistance augmentera au-dessus d’un gigaohm. Dans la pince de tension, maintenez la cellule à moins 68 millivolts. Par la suite, retirez légèrement la pipette de la cellule en diagonale pour enlever l’excès de pression.Compensez la capacité rapide et lente de pipette. Appliquez une brève aspiration à travers le tube relié au support pipette pour percer la cellule et obtenir une configuration de cellule entière. Ensuite, passez en mode cellulaire sur la fenêtre de test membranaire dans un logiciel d’acquisition et d’analyse de données d’électrophysiologie.Maintenir la température du bain d’enregistrement à 27 à 30 degrés Celsius et le débit à 1,5 à 2 millilitres par minute pour les expériences subséquentes. Dans une synapse de multiplicité, un potentiel d’action synchronise la libération de neurotransmetteur et génère un courant postsynaptique plus grand. Le blocage du potentiel d’action et de la libération vésiculaire dépendante du calcium avec TTX et cadmium empêche la summation du courant postsynaptique et diminue l’amplitude.Lorsqu’il n’y a pas de multiplicité, le potentiel d’action de blocage ne changera pas l’amplitude. Dans l’expérience 1, pour estimer la multiplicité, maintenez la cellule à moins 68 millivolts tout en la perfusant avec l’aCSF à faible teneur en calcium. Enregistrez les CPE spontanés pendant au moins cinq minutes pour assurer une base de référence stable.Ensuite, ajoutez 30 micromolaires 4-AP à l’ACSF pour augmenter les événements d’action dépendant du potentiel, et enregistrez les CPE spontanés pendant au moins 10 minutes pour obtenir l’effet médicamentif complet. Ensuite, ajoutez 0,5 micromolaires TTX et 10 micromolaires cadmium à l’aCSF avec 4-AP, et enregistrez les CPE miniatures pendant au moins 10 minutes. Pour l’analyse hors ligne, utilisez la dernière minute de base juste avant l’application de 4-AP, la 10ème minute de l’application 4-AP, et la 10ème minute de l’application TTX.Dans cette expérience, le calcium extracellulaire est remplacé par du strontium pour désynchroniser la libération de vésicules synaptiques. Par conséquent, si la multiplicité est présente, cela devrait diminuer l’amplitude des courants postsynaptiques. Dans l’expérience deux, enregistrez les CPE spontanés pendant au moins cinq minutes tout en perfusant la cellule avec l’ACSF normal de calcium.Pour désynchroniser la libération vésicule, commencer à perfuser la cellule avec strontium aCSF, et enregistrer les EPSC spontanés. Pour l’analyse hors ligne, pour déterminer si les EPSC spontanés de grande amplitude sont dus à la libération synchrone des vésicules, comparez la dernière minute de ligne de base à la 10ème minute de l’application d’aCSF de strontium. La multiplicité peut impliquer la libération multivesicular, qui cause la concentration plus élevée de neurotransmetteur dans la fente synaptique.L’ajout de gamma-DGG, un antagoniste des récepteurs AMPA de faible affinité, conduit à une inhibition moins efficace de plus grand multiquantal par rapport aux petits courants postsynaptiques uniquantaux. Sans libération multivéhiculaire, gamma-DGG sera tout aussi efficace sur les courants postsynaptiques de plus en plus petits. Dans l’expérience trois, pour tester la libération multivesicular, enregistrez les EPSCs spontanés dans l’ACSF à faible teneur en calcium pendant au moins cinq minutes.Ajouter 30 micromolaires 4-AP à l’aCSF par le système de perfusion. Enregistrez les CPE spontanés pendant au moins 10 minutes. Ensuite, ajoutez 200 micromolaires gamma-DGG à l’aCSF avec 4-AP, et enregistrez les EPSC spontanés pendant au moins 10 minutes.Comme une expérience de contrôle dans une cellule séparée, répéter les procédures, mais appliquer une faible concentration de DNQX au lieu de gamma-DGG. Pour une analyse hors ligne, analyser la dernière minute de chaque demande de médicament. Les éclats d’activité synaptique peuvent augmenter transitoirement le potentiel d’action spontanée de tir et libérer la probabilité des afferents stimulés.Si les neurones présentent une multiplicité, l’augmentation des potentiels d’action devrait provoquer une augmentation transitoire de l’amplitude des courants postsynaptiques. Dans l’expérience quatre, enregistrez les CPE spontanés dans l’ACSF normal de calcium. Pour augmenter le tir potentiel d’action, stimulez les afferents à l’aide d’une électrode de verre monopolisaire remplie d’aCSF à raison de 20 hertz pendant deux secondes, et répétez 10 fois avec un intervalle inter-rafale de 20 secondes.Pour analyse, utilisez 5000 millisecondes d’EPSC spontanés avant le premier stimulus comme base et comparez aux CPE spontanés de 10 à 300 millisecondes après le stimulus final. Ensuite, prenez l’amplitude moyenne et le changement de fréquence sur 10 essais. Analyser les CPE spontanés et les CPE miniatures à l’aide d’un programme qui détecte et analyse les courants synaptiques.Utilisez les paramètres de détection suggérés et la fonction d’analyse non-stop pour détecter les CPE à base de récepteurs AMPA. Numérisez manuellement chaque enregistrement pour vous assurer que le programme détecte avec précision chaque événement. Exportez les données de l’événement en les copiant sur le presse-papiers et les coller dans un logiciel de gestion de données.Ensuite, calculez la fréquence moyenne et l’amplitude pour chaque traitement médicamenteux et effectuez les analyses statistiques pertinentes. Dans un exemple montré ici, 4-AP augmente à la fois l’amplitude et la fréquence des EPSC spontanés. L’application subséquente de TTX et de cadmium diminue à la fois l’amplitude et la fréquence.Voici la distribution de l’amplitude spontanée epsc de l’enregistrement. Dans les neurones hypothalamiques examinés ici, l’amplitude et la fréquence des conditions de ligne de base et de TTX sont les mêmes, suggérant que les EPSC spontanés de ligne de base contiennent très peu d’EPSCs potentiel-dépendants d’action. Par conséquent, les expériences subséquentes peuvent comparer la différence entre la ligne de base et 4-AP pour mesurer la multiplicité.La force de la transmission synaptique peut être transitoirement augmentée par des éclats d’activité synaptique. Pour étudier la multiplicité dans des conditions plus physiologiques, une stimulation afferent peut être utilisée pour augmenter la probabilité de tir potentiel d’action et de libération. Voici les résumés des changements spontanés de fréquence et d’amplitude d’EPSC suivant la stimulation synaptique.Des enregistrements stables sont essentiels à une interprétation précise des données. Décrivez les données si la résistance à l’accès change de plus de 20 % au cours de l’enregistrement, car cela pourrait confondre l’analyse. Ce protocole offre un moyen simple d’estimer la multiplicité synaptique, qui est un déterminant clé de l’efficacité synaptique et de sa plasticité dans différentes conditions physiologiques et pathophysiologiques.

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Ce protocole décrit une technique appelée électrophysiologie par patch clamp à cellules entières, qui est une méthode pour étudier les propriétés électriques des neurones de Mauthner et d’autres cellules réticulospinales dans les embryons de poisson-zèbre.

Électrophysiologie par patch clamp de cellules entières : une méthode pour étudier les propriétés électriques des neurones

Cette vidéo illustre la technique de patch clamp de cellules entières dans une tranche de cerveau de souris. Cette technique établit une connexion stable entre la micropipette et la membrane neuronale, qui est ensuite perturbée pour établir une configuration de cellule entière afin d'étudier la santé et les réponses physiologiques du neurone.

Établissement d’une configuration de cellule entière grâce à la méthode du patch clamp

La vidéo présente une méthode pour étudier l’excitabilité des cellules neuronales exprimant une protéine fluorescente à l’aide d’une pince de courant de patch de cellule entière. Dans le mode de pince de courant, des potentiels d’action indiquant l’excitabilité neuronale sont générés.

Étude de l’excitabilité des neurones fluorescents à l’aide d’une pince à patch de cellules entières

Cette vidéo montre le positionnement d’une pipette à pointe fine près de tranches de cerveau, formant un sceau avec une cellule neuronale. L’aspiration brise la membrane cellulaire, créant ainsi une pince patch pour cellules entières qui permet des mesures de courant pour les expériences d’électrophysiologie.

Etablissement d’une configuration de tension de cellule entière pour les enregistrements électrophysiologiques dans des tranches de cerveau

Multi-électrodes patch-clamp enregistrements constituent une tâche complexe. Ici, nous montrons comment, par l'automatisation de nombreuses étapes expérimentales, il est possible d'accélérer le processus conduisant à une amélioration qualitative de la performance et le nombre d'enregistrements.

Un multi-électrode système de patch-clamp assistée par ordinateur

Réseaux corticaux sont contrôlés par un petit, mais diversifié ensemble des interneurones inhibiteurs. Exploration fonctionnelle des interneurones nécessite donc l'enregistrement ciblée et identification rigoureuse. Décrit ici est une approche combinée impliquant des enregistrements de cellules entières de paires simples ou synapses de neurones couplés avec marquage intracellulaire, post-hoc morphologique et l'analyse immunocytochimique.

De cellules entières de patch-clamp enregistrements de Morphologically- et interneurones hippocampiques neurochemically identifiés

Les enregistrements de paires sont des enregistrements simultanés de cellules entières à partir de deux neurones synaptiquement connectés, permettant une caractérisation électrophysiologique et pharmacologique précise des synapses entre les neurones individuels. Nous décrivons ici la méthodologie détaillée et les exigences pour établir cette technique dans les cultures de coupes organotypiques d’hippocampe dans tout laboratoire équipé pour l’électrophysiologie.

Appariés enregistrements de cellules entières dans organotypiques coupes d&#39;hippocampe

Les enregistrements patch-clamp et le remplissage simultané de neurones couplés synaptiquement dans des tranches cérébrales aiguës permettent une analyse corrélée de leurs propriétés structurelles et fonctionnelles. L’objectif de ce protocole est de décrire les étapes techniques essentielles de l’enregistrement électrophysiologique des microcircuits neuronaux et de leur analyse morphologique ultérieure.

Électrophysiologiques et Caractérisation morphologique des neurones Les circuits dans aiguë tranches cerveau en utilisant jumelés patch-clamp enregistrements

Ce protocole décrit les étapes de procédure de base pour effectuer des cellules entières enregistrements de patch-clamp. Cette technique permet l'étude du comportement électrique des neurones, et lorsqu'elle est effectuée dans des tranches de cerveau, permet d'évaluer les différentes fonctions de neurones à partir de neurones qui sont encore intégrés dans des circuits du cerveau relativement bien conservées.

Recordings cellules entières Patch-clamp en tranches cérébrales

La technique du patch clamp tranche est une méthode efficace pour analyser les changements induits par l’apprentissage dans les propriétés intrinsèques et la plasticité des synapses excitatrices ou inhibitrices.

Tranche Patch Clamp Technique d’analyse de plasticité induite par l’apprentissage

Découvrez une méthode simple pour estimer la multiplicité synaptique par électrophysiologie patch-clamp en cellule entière sur tranches de cerveau aigu. Cette technique permet d'étudier les mécanismes de transmission synaptique.

Évaluation de la multiplicité synaptique à l’aide de Patch-clamp de la cellule entière électrophysiologie

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