Une stratégie convergente pour la génération d'une bibliothèque d'ADNc pratiquement séquencée à partir d'huîtres du Pacifique non référencées

La question clé que nous voulons aborder avec cette méthode est de savoir comment pouvons-nous utiliser des échantillons d’ARN à partir de matériaux achetés sur les marchés alimentaires locaux pour le clonage de gènes biotechnologiquement pertinents? Ici, nous utilisons les huîtres du Pacifique comme étude de cas pour démontrer cette approche et d’autres applications potentielles. Le principal avantage de cette technique est que le génome conventionnel ou le séquençage cDNA des échantillons d’huîtres peuvent être contournés.

Au lieu de cela, des séquences de la sous-unité cytochrome c oxidase I et nadh déshydrogénase ont été comparées à des séquences de référence accessibles au public de l’huître du Pacifique pour sélectionner le spécimen le plus étroitement apparenté. L’ADNC préparé à partir de ce spécimen peut être directement utilisé pour le clonage de gènes biotechnologiquement pertinents, qui peuvent être sélectionnés à l’aide de l’information sur la séquence publique. Yongmei Lyu et Yuquan Li, deux étudiants diplômés du Glycomics et du Glycan Bioengineering Research Center de l’Université agricole de Nanjing, démontreront la procédure.

Pour préparer l’échantillon de tissu ostréicole, utilisez un scalpel stérilisé pour découper environ 100 milligrammes de tissus mous homogènes à partir du centre géométrique approximatif de chaque spécimen d’huître. Transférer l’échantillon dans un mortier rempli de 50 millilitres d’azote liquide. Moudre le tissu d’huître congelé flash dans une poudre fine.

Peser 75 milligrammes du tissu congelé de chaque spécimen dans un tube stérile centrifugeuse de 1,5 millilitre, et mélanger avec un millilitre de guanidinium thiocyanate-phénol extraction reagent. L’étape la plus critique de cette procédure est l’étape d’extraction de l’ARN. Afin de minimiser la dégradation de l’ARN, il est essentiel de réduire le temps entre la récolte du tissu ostréicole et l’extraction de l’ARN.

Centrifugez l’échantillon à 14 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Transférer le supernatant dans un nouveau tube centrifugeuse de 1,5 millilitre, ajouter 200 microlitres de chloroforme et bien mélanger sur un mélangeur vortex pendant 10 à 15 secondes jusqu’à ce que le mélange soit blanc laiteuse. Ensuite, centrifugeuse pendant 15 minutes comme cela a été fait précédemment.

Avec une pipette de 200 microlitres, transférez soigneusement la couche aqueuse supérieure, sans déranger l’interphase, dans un nouveau tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre. Ajouter 500 microlitres d’alcool isopropylique dans le tube de centrifugeuse et inverser délicatement pour mélanger les échantillons. Ensuite, laissez les échantillons sur la glace pendant 20 minutes.

Centrifugeuse à 14 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant huit minutes, et enlever le supernatant. Resuspendez la pastille en un millilitre de 75% d’éthanol, et centrifugeuse à 14 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirer tout le surnatant et répéter le lavage à l’éthanol.

Sécher les granulés pendant six minutes à température ambiante. Ensuite, dissoudre la pastille d’ARN séchée dans 25 microlitres d’eau traitée par dePC, et garder le tube sur la glace. Utilisez les échantillons d’ARN dans les 24 heures.

Pour générer une bibliothèque cDNA, préparez d’abord un mélange de réaction pour chaque échantillon d’ARN dans un tube PCR de 300 microlitres en ajoutant des solutions selon le manuscrit. Ajouter un microlitre de l’échantillon d’ARN extrait dans le tube. Incuber le mélange dans un thermocycleur PCR pendant 60 minutes à 42 degrés Celsius, puis augmenter la température à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Stockez la bibliothèque cDNA générée jusqu’à 12 mois à moins 20 degrés Celsius. Tout d’abord, ajoutez un microlitre de la bibliothèque cDNA générée aux tubes contenant des mélanges PCR, préparés selon le manuscrit. Placez les tubes PCR dans le thermocycleur PCR, et effectuez l’amplification PCR avec une étape initiale de dénaturation et 35 cycles de réaction PCR composé d’une étape d’annealing, une étape d’allongement, et une étape de dénaturation selon le manuscrit.

Après les cycles, effectuer une étape d’allongement finalisant pendant cinq minutes. Utilisez cinq microlitres du produit PCR pour vérifier la qualité par électrophoresis gel agarose. Observez le gène COX1 ou ND amplifié comme une seule bande à 759 ou 748 paires de base, respectivement.

Pour purifier le reste du produit PCR, ajouter 100 microlitres de tampon liant l’ADN contenant des concentrations élevées de sels chaotropiques à chaque échantillon. Vortex brièvement pour mélanger le contenu. Placez une colonne de purification dans un tube de centrifugeuse de deux millilitres.

Pipette le mélange de réaction dans la colonne. Placez le tube avec la colonne montée dans une centrifugeuse à 14 000 fois g pendant une minute à température ambiante. Après avoir jeté le filtrate du tube de centrifugeuse de deux millilitres, lavez-le deux fois avec 700 et 400 microlitres de solution de lavage W2 en centrifugant à 14 000 fois g.

Ensuite, chauffer un millilitre d’eau déionisée à 65 degrés Celsius dans un chauffe-blocs métallique. Transférer la colonne dans un nouveau tube centrifugeuse de 1,5 millilitre et pipette 25 microlitres de l’eau déionisée préchauffée au centre de la membrane de la colonne blanche. Laisser tremper la membrane pendant une minute à température ambiante.

Ensuite, centrifugez le tube avec la colonne à 14 000 fois g pendant une minute à température ambiante. Jetez la colonne et conservez le produit PCR purifié jusqu’à 12 mois à moins 20 degrés Celsius. En option, les amorces inversées COX1 ou ND peuvent également être utilisées pour le séquençage bidirectionnel.

Pour le séquençage Sanger, utilisez l’amorce avant COX1 ou ND pertinente. Après avoir récupéré les résultats du séquençage, comparez les séquences avec la séquence génomique de la souche de référence des huîtres du Pacifique à l’aide de l’outil en ligne NCBI Nucleotide BLAST. Utilisez les amorces avant et arrière respectives des gènes MgUGD et MgUXS pour amplifier et purifier par PCR comme cela a été fait précédemment.

Après avoir incubé des produits PCR purifiés avec tampon de digestion, préparer le vecteur prédigesté pET-30a en dissolvant 500 nanogrammes de pET-30a dans un tube centrifugeuse de 1,5 millilitre, et ajouter de l’eau déionisée pour recharger jusqu’à 16 microlitres. Ensuite, ajoutez deux microlitres de tampon de digestion 10 fois concentré et un microlitre chacun des 20 unités de restriction endonucleases Nde1 et Xho1 dans le tube. Incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant trois heures.

Après cela, ajouter un microlitre de phosphatase alcalin d’une unité, et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure supplémentaire. Ensuite, placez le tube dans un chauffe-bloc métallique préchauffé à 75 degrés Celsius pendant 10 minutes pour inactiver la phosphatase alcaline. Après avoir cultivé les cellules E.coli BL21 portant les gènes MgUGD et MgUXS, transférez la culture en milieu LB de 400 millilitres dans un flacon de secousse de deux litres et placez-la sur un shaker à 200 rpm à une température de 37 degrés Celsius.

Après trois heures, vérifiez la densité optique d’un photomètre à une longueur d’onde de 600 nanomètres et assurez-vous qu’il atteint une absorption d’environ 0,5. Réduisez ensuite la température du shaker à 20 degrés Celsius. Ajouter 400 microlitres d’IPTG uni molaire pour induire l’expression des protéines recombinantes pendant trois heures.

Après la récolte des cellules, perturber les cellules par sonication pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Centrifugeuse à 14 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes, et recueillir le supernatant dans un nouveau tube pour le test d’activité. Après l’analyse d’activité, étanchez les réactions en ajoutant 20 microlitres de méthanol et 40 microlitres de chloroforme aux mélanges MgUXS et MgUGD.

Vortex les mélanges d’échantillon, et centrifugeuse à 14.000 fois g pendant six minutes et quatre degrés Celsius. Recueillir la couche aqueuse supérieure de chaque tube dans de nouveaux tubes pour la spectrométrie de masse MALDI-TOF. Dans cette expérience, l’alignement des séquences génétiques COX1 et ND d’un spécimen très divergent a été comparé à la souche d’huîtres du Pacifique de référence.

Les flèches rouges montrent des différences de nucléotide entre la séquence de référence et la séquence des échantillons obtenus d’ADNC. Les séquences des gènes COX1 et ND d’un spécimen d’huître étroitement apparenté montrent une faible divergence par rapport à la souche d’huîtres du Pacifique de référence. La spectrométrie de masse MALDI-TOF montre l’application réussie de la bibliothèque cDNA pour cloner les gènes industriellement pertinents MgUGD et MgUXS.

L’image du gel identifie également l’acide udp-glucuronique et l’UDP-xylose générés par l’action enzymatique du MgUGD et du MgUXS successivement exprimés et purifiés. Cette méthode ne nécessite pas une correspondance parfaite entre la séquence de référence et les séquences de marqueurs obtenues et devrait donner au chercheur la confiance nécessaire pour travailler avec des huîtres non référencées. En principe, cette méthode peut être appliquée à tout échantillon biologique non référencé pour lequel des séquences provenant d’une espèce de référence étroitement apparentée sont accessibles au public.

Cette méthode permet aux chercheurs non experts d’accéder facilement au matériel génétique d’importance biologique potentielle et ouvre la voie à un plus grand nombre de scientifiques pour travailler avec des échantillons biologiques facilement accessibles mais incomplètement identifiés.