VirWaTest, une méthode de point d'utilisation pour la détection des virus dans les échantillons d'eau

Les virus en entéroïques se trouvent principalement dans différents réservoirs aquatiques, y compris les eaux souterraines, l’eau potable, les ruisseaux, les rivières et l’eau r. Ils sont associés à des risques pour la santé et sont responsables des infections chez l’homme. Les virus entériques causent généralement une gastro-entérite et se transmettent principalement par voie fécale-orale.

D’autres maladies d’origine hydrique causent l’hépatite aiguë par le virus de l’hépatite A et les virus de l’hépatite E, avec une mortalité associée importante, en particulier en ce qui concerne l’hépatite E chez les femmes enceintes. Les protocoles réels de surveillance de la qualité de l’eau proposés dans des contextes humanitaires ont été conçus pour garder les bactéries comme E.Coli comme indicateur de contamination fécale. Mais il est déjà connu qu’il n’y a pas de corrélation avec d’autres micro-organismes tels que les virus qui sont plus résistants à de nombreux processus d’activation.

Jusqu’à présent, la détection des virus dans les contextes de crise humanitaire a été effectuée en adaptant les protocoles existants aux conditions de ces contextes, et en expédiant des échantillons aux laboratoires de référence pour la détection moléculaire des virus. Il est nécessaire de trouver des méthodes pour détecter les agents pathogènes viraux et les indicateurs viraux dans le point de vue de réduire les risques pour la santé publique, de prévenir les flambées et d’accroître l’efficacité des interventions humanitaires. Nous proposons une méthode pour la détection des virus dans des échantillons d’eau de 10 litres qui est divisé en trois étapes: concentration virale, extraction d’acide nucléique, et la détection virale.

Toutes ces étapes ont été adaptées à partir des méthodes actuellement utilisées dans notre laboratoire, et peuvent être effectuées dans le point de vue en utilisant des réapprovisionnements portables et de l’équipement, produisant les personnes à charge de l’alimentation électrique et des congélateurs. En outre, une solution de conservation a été ajoutée à la méthode pour justifier la stabilité des acides nucléiques pour l’expédition aux laboratoires de référence si nécessaire. La méthode que nous proposons s’appelle VirWaTest et a été développée avec la collaboration de GenIUL et d’Intermon Oxfam.

Avant de commencer, le nombre d’échantillons à tester doit être pris en considération pour la préparation des reagents et des matériaux. Il est recommandé de recueillir deux répliques de chaque échantillon d’eau afin d’obtenir des résultats représentatifs. Plusieurs échantillons peuvent être testés en même temps si la quantité appropriée de matériel est disponible.

Les reagents et les matériaux doivent être préparés et emballés avant d’être déplacés ou expédiés à l’endroit où la méthode est nécessaire. La liste des matériaux et des petits équipements qui devraient être emballés est décrite dans le premier tableau. Préparer un stock de BACtériophage MS2 à ajouter à chaque échantillon d’eau comme contrôle des processus en suivant la méthode ISO correspondante.

Ensuite, distribuez 10 microlitres d’une suspension contenant de 10 à 10 unités de plate-forme pré-fabriquées en tubes de 10 mL et laissez sécher l’eau. Un tube par échantillon d’eau sera nécessaire. De plus, préparez un tube contenant 10 mL d’eau distillée stérile par échantillon recueilli.

Pour la solution de lait écrémé pré-flocculated, préparez un tube contenant le lait écrémé, un sac en plastique de fermeture éclair contenant le sel de mer, et une bouteille en plastique contenant l’eau distillée. Pour l’ajustement du pH, préparer un tube contenant l’acide citrique, un tube contenant l’hydroxyde de sodium et deux contenants en plastique contenant 25 et 50 mL d’eau distillée. Pour que chaque échantillon d’eau soit testé, préparez un sachet de conditionnement en ajoutant les sels de mer et l’acide citrique à un sac en plastique à fermeture éclair, et une solution de conservation en ajoutant le tampon de lyse et l’agent de conservation de l’acide nucléique à un tube de 5 mL.

Enfin, préparez quatre sachets neutralisants, ajoutant du détergent électrique à quatre sacs en plastique à fermeture éclair. Pour extraire chaque échantillon d’eau, préparez un tube de cinq mL contenant des particules magnétiques et de l’éthanol, et trois tubes de 2 mL contenant respectivement 500, 600 et 200 microlitres de tampons de lavage un, deux et trois, et un tube contenant un tampon d’élitution. Deux extractions différentes d’acide nucléique peuvent être analysées simultanément dans chaque analyse PCR si un thermocycleur Newell est utilisé.

Pour tous les tests PCR, préparez l’eau de biologie moléculaire. Préparez des mélanges contenant deux amorces et une preuve spécifique pour chaque virus cible selon les volumes et concentrations décrits dans le protocole. Pour chaque virus, ajouter les volumes indiqués dans les tubes un à huit d’un plateau de tubes.

Couper la bande, en la divisant en deux bandes. Tubes un à cinq et tubes six à huit. Pour chaque virus, suspensions d’ADN sèches à l’air contenant 10 à 5, 10 à 7, et 10 à 9 exemplaires et des copies connues pré-faites en tubes six, sept et huit.

Ce protocole de concentration est basé sur le principe de la flocculation organique par lequel le faible pH et l’état de haute conductivité pousse les protéines de lait écrémé à s’organiser en flocs que les virus absorbent. Une fois que les flocs sont réglés, ils peuvent être facilement collectés. Recueillir un échantillon d’eau de 10 litres dans un seau à fond plat fourni avec un couvercle.

Si vous collectez à partir d’un tuyau, laissez l’eau fonctionner pendant quelques secondes avant de recueillir l’eau. Il est important d’utiliser des seaux clairs pour visualiser les granulés. Recherchez un espace plat dans un endroit frais loin de la lumière directe du soleil Mettez un agitateur magnétique relié à une batterie sous le support du seau et placez le seau contenant l’échantillon d’eau sur chaque support.

Reconsidérer l’acide citrique et l’hydroxyde de sodium et secouer jusqu’à ce qu’ils soient complètement dissous. Verser 500 mL d’eau distillée dans un sac de stand-up et placer le sac sur un agitateur magnétique. Ajouter le contenu d’un sachet de sel de mer et le contenu d’un tube de lait écrémé et remuer pendant cinq minutes à vitesse moyenne.

Ajuster le pH du lait écrémé flocculé à l’aide d’acide citrique et d’hydroxyde de sodium à un pH compris entre 3,4 et 3,6. Éteignez l’agitateur magnétique et assurez-vous que les flocs sont visibles. Une lampe de poche peut aider à visualiser les flocs.

Laissez tomber un aimant en remuant dans l’eau. Réglez l’agitateur magnétique à vitesse maximale et allumez-le. Ajouter 10 mL d’eau distillée à un tube contrôlé par procédé.

Inversez-le plusieurs fois et versez la solution dans l’eau. Verser le contenu d’un sachet de conditionnement d’échantillon dans l’eau et remuer pendant cinq minutes. Assurez-vous que le pH de l’échantillon d’eau, qui doit être compris entre 3,4 et 3,6.

Ajustez le pH si nécessaire. Ajouter 100 mL de solution de lait écrémé préchauplé, sceller le seau avec le couvercle et laisser l’eau en remuant pendant huit heures à vitesse minimale. Après huit heures, éteignez l’agitateur magnétique et laissez les flocs se contenter d’au moins cinq heures supplémentaires.

Avec un système basé sur l’utilisation d’un contrôleur pipette, un tube en plastique, et un couple de pipettes, jeter le surnatant, en prenant soin de ne pas déranger les flocs sur le fond du seau. Lorsque le niveau d’eau est sur le point d’atteindre l’aimant en remuant, presser le tube en plastique pour arrêter le débit d’eau et éloigner la pipette du seau. Secouez le seau pour réutiliser les flocs et versez-les dans un sac en plastique stand-up.

Laissez les flocs se contenter d’une heure supplémentaire. Aspirez soigneusement le surnatant d’eau à l’aide d’une pipette en évitant de déranger les flocs. Aspirer les flocs à l’aide d’une pipette et les transférer dans un tube conique.

Notez le volume final du concentré d’échantillon et transférez 1 mL dans un tube contenant la solution de conservation. La suspension peut être utilisée soit pour effectuer l’extraction d’acide nucléique sur le terrain, soit expédier à un laboratoire de référence pour une analyse plus approfondie. L’eau jetée lors de la collecte des flocs doit être traitée avant l’élimination.

Ajouter le contenu d’un sachet d’agent neutralisant au seau contenant l’eau jetée. Mélanger l’eau et la laisser immobile pendant trente minutes. Puis éliminer l’eau traitée comme déchets généraux.

Les particules magnétiques peuvent être transférées d’un tube à l’autre à l’aide d’une pipette magnétique. Habitez-vous au fonctionnement d’une pipette magnétique avant d’effectuer l’extraction. Disposer les tubes contenant le reagent nécessaire à l’extraction dans une grille.

C’est-à-dire, de gauche à droite: tampon contraignant, tampons de lavage, et tampon d’élitution. Transférer 1 mL de concentré d’échantillon dans le tube contenant le tampon de liaison à l’aide d’une pipette en plastique jetable. Inversez le tube dix fois pour optimiser la solution.

Incuber la solution à température ambiante pendant dix minutes tout en mélangeant continuellement soit à l’aide d’une orbitale solo ou manuellement. Recueillir les particules magnétiques à l’aide d’une pipette magnétique et d’une pointe propre qui peut être réutilisée pour les trois tampons de lavage et libérer les particules magnétiques dans le tube contenant un tampon de lavage. Lavez-les en secouant doucement la solution avec la pointe pendant trente secondes et recueillez-les.

Répétez cette procédure de lavage pour laver les tampons deux et trois. Recueillir les particules magnétiques dans le tampon de lavage trois et les libérer dans le tube contenant le tampon d’élitution. Puis jetez la pointe.

Incuber la solution à température ambiante pendant cinq minutes tout en mélangeant continuellement à l’aide de l’orbitale solo. Remplacez la pointe sur la pipette magnétique par n’importe qui et recueillez toutes les particules magnétiques du tampon d’élitution. Jetez la pointe avec les particules attachées.

L’acide nucléique reste dans le tampon d’élitution, qui doit être stocké pour une analyse plus approfondie ou l’expédition. Utilisez une bande à cinq tubes et une bande à trois tubes prêtes à détecter les adénovirus humains. Ajoutez de l’eau, du mélange PCR et de l’extration d’acide nucléique aux tubes un à cinq selon le protocole.

Ensuite, ajouter l’eau et le mélange PCR aux tubes de six à huit. Mettez les deux bandes dans le thermocycleur et sélectionnez la course appropriée. Une fois la course terminée, recueillez les résultats et analysez les données obtenues.

Ce n’est que lorsque des tests viraux ont donné lieu à des tests négatifs que la détection du MS2 devrait être effectuée. Utilisez des bandes de tube préparées pour la détection ms2 et sélectionnez le profil thermique approprié pour le PCR. L’extraction magnétique d’acide nucléique VirWaTest a été comparée à l’ARN viral QIAgen, l’imitant en testant des échantillons d’eau piqués avec des adénovirus humains et des MS2.

La valeur p du test de réduction montre des récupérations virales significativement plus élevées en utilisant VirWaTest que QiAgen comme méthode d’extraction pour les deux virus testés. La méthode développée pour la concentration virale a été testée sur le terrain avec la collaboration d’équipes de lavage d’Oxfam situées à Bangui, en République centrafricaine et à Pedernales, en Équateur, qui ont prélevé des échantillons d’eau, les ont concentrés en appliquant la méthode de concentration développée, et les ont envoyées au laboratoire de Barcelone pour l’extraction de l’acide nucléique et la quantification virale. En Équateur, des adénovirus humains ont été détectés dans tous les échantillons testés, tandis qu’un échantillon sur cinq prélevé et concentré à Bangui a donné des résultats positifs pour les adénovirus humains.

La méthode développée s’est avérée utile lorsqu’elle a été évaluée par les équipes de lavage d’Oxfam Intermon à Bangui, en République centrafricaine, et par une autre équipe à Pedernales, en Équateur. VirWaTest peut faire partie d’un système d’alerte précoce ou peut être utilisé dans les enquêtes sur les flambées par les organisations impliquées dans l’assainissement de l’eau. Cet équipement facilite l’analyse des pathogènes viraux dans l’eau et l’amélioration de la gestion de la sécurité de l’eau dans le but de réduire les incidents de maladies virales dans les contextes de crise humanitaire.