Name: In Vivo Reprogrammation directe des cellules gliales résidentes en interneurones par injection intracérébrale de vecteurs viraux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Découvrez la reprogrammation in vivo des cellules gliales en interneurones parvalbumine-positifs à l'aide de vecteurs viraux AAV chez la souris. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes neuronaux et les thérapies cellulaires.

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Marcella Birtele a été financée par le programme Horizon 2020 de l'Union européenne (H2020-MSCA-ITN-2015) dans le cadre des réseaux de formation innovants Marie Skoodowska-Curie et de l'Accord de subvention no 676408. Daniella Rylander Ottosson a été financée par le Conseil suédois de la recherche (2017-01234).

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<li>Grealish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A9+dopamine+neuron+component+in+grafts+of+ventral+mesencephalon+is+an+important+determinant+for+recovery+of+motor+function+in+a+rat+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The A9 dopamine neuron component in grafts of ventral mesencephalon is an important determinant for recovery of motor function in a rat model of Parkinson's disease.</a> Brain. 133 (Pt 2), 482-495 (2010).</li>
<li>Thompson, L., Barraud, P., Andersson, E., Kirik, D., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+dopaminergic+neurons+of+nigral+and+ventral+tegmental+area+subtypes+in+grafts+of+fetal+ventral+mesencephalon+based+on+cell+morphology%2C+protein+expression%2C+and+efferent+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of dopaminergic neurons of nigral and ventral tegmental area subtypes in grafts of fetal ventral mesencephalon based on cell morphology, protein expression, and efferent projections.</a> Journal of Neuroscience. 25 (27), 6467-6477 (2005).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

La reprogrammation directe in vivo peut être réalisée à l'aide de vecteurs AAV FLEX dans les souches de souris exprimant cre. Il est important de noter que des différences entre les souches de souris en ce qui concerne l'efficacité de la reprogrammation ont été observées. Pour la reprogrammation in vivo dans le striatum, la ligne de souris NG2-Cre s'est avérée la plus efficace par rapport à d'autres souches. Avant de commencer à utiliser une nouvelle souche animale, il est important de vérifier les directives du fournisseur de souris concernant l'expression Cre au fil du temps, comme l'âge des animaux a souvent un impact sur la spécificité de cette expression protéique. Dans nos études, les animaux âgés de plus de 12 semaines n'ont pas été utilisés pour la reprogrammation in vivo car il y avait un risque d'expression cre dans des cellules autres que NG2 glia. La présence et la surveillance constantes des animaux témoins injectés uniquement avec la construction Synapsin-FLEX-GFP sont conseillées. Cela permet de surveiller les animaux pour les cellules GFP-positives qui ne devraient pas être présents si aucun gène de reprogrammation (ALN) n'est utilisé.
Pour identifier les neurones nouvellement reprogrammés, une méthode d'identification spécifique aux neurones comme celle décrite dans ce protocole est de la plus haute importance. Cela permet une identification et une distinction appropriées des neurones reprogrammés des cellules environnantes endogènes qui est d'une pertinence particulière lors de la reprogrammation dans une région homotopique.
Il est également important de cibler la structure correcte pour l'injection virale. Par conséquent, la chirurgie stéréotaxique pour l'injection virale est importante et doit être abordée avec précision, en particulier lorsque vous ciblez de plus petites structures du cerveau.
Nous avons déjà montré11 qu'il n'est pas fiable de prédire le résultat de la reprogrammation in vivo basée sur des expériences de reprogrammation in vitro en utilisant les mêmes facteurs de reprogrammation. Tous les facteurs d'intérêt doivent donc être testés in vivo. Dans nos mains, de nombreuses combinaisons de facteurs différents donnent le même sous-type de neurones (c.-à-d., interneurons11 in vivo) malgré le fait que ces gènes ont été impliqués dans le développement d'autres neurones.
La pince de correction de cellules entières pour les neurones reprogrammés est une technique délicate et le traitement de tissu est important pour un bon résultat. La perfusion avec la solution Krebs glacée améliore la qualité des tissus. En outre, les neurones patchés doivent être traités avec soin. Même si la maturation et l'identité phénotypique des neurones reprogrammés peuvent être quelque peu évaluées à l'aide de pinces à patch à cellules entières, ces cellules ne sont pas entièrement comparables à leurs homologues endogènes. D'autres types d'analyse, comme le séquençage du génome (p. ex., le séquençage de l'ARN) devraient être utilisés pour confirmer davantage l'identité cellulaire reprogrammée.
La technique décrite ci-dessous est pourrait être considérée pour le développement de thérapies futures où le remplacement neuronal est nécessaire dans le cerveau. Bien que la reprogrammation in vivo en soit encore à ses débuts et que la traduction chez l'homme ne soit pas encore prévue, cette technique pourrait fournir une méthode pour évaluer la fonction génique exogène dans le cerveau et étudier la maturation cellulaire in vivo.

L'objectif global de cette méthode est de convertir efficacement les gliales résidentes du cerveau in vivo en neurones fonctionnels et spécifiques au sous-type tels que les interneurons exprimant la parvalbumine. Ceci fournit un pas en avant vers le développement d'une thérapie alternative de remplacement de cellules pour des maladies de cerveau sans avoir besoin d'une source exogène de cellules. Il crée également un outil pour étudier les commutateurs de destin cellulaire in situ.
Le cerveau n'a qu'une capacité limitée pour générer de nouveaux neurones. Par conséquent, dans les maladies neurologiques, il ya un besoin de sources cellulaires exogènes pour la réparation du cerveau. Pour cela, différentes sources de cellules ont fait l'objet d'intenses recherches au fil des ans, y compris des cellules provenant de tissus primaires, de cellules souches dérivées et de cellules reprogrammées1,2,3. La reprogrammation directe des cellules cérébrales résidentes en neurones est une approche récente qui pourrait fournir une méthode attrayante pour la réparation du cerveau car elle utilise les propres cellules du patient pour générer de nouveaux neurones à l'intérieur du cerveau. À ce jour, plusieurs rapports ont montré la reprogrammation in vivo par la livraison de vecteurs viraux dans le cerveau4,6,6,78,9 dans différentes régions du cerveau telles que le cortex, la moelle épinière, le striatum et le midbrain5,10,11, ainsi que dans le cerveau intact et lesioned5,8,11,12. Les neurones inhibiteurs et excitateurs ont été obtenus4,8, mais le phénotype précis ou la fonctionnalité de ces cellules n'a pas encore été analysé en détail.
Dans ce protocole, nous décrivons une reprogrammation plus efficace et l'identification cellulaire-spécifique des neurones reprogrammés in vivo. Nous fournissons un protocole pour l'évaluation fonctionnelle de la maturation neuronale et de la caractérisation de phénotype basée sur la fonctionnalité et les traits immunohistochemical.
Nous avons utilisé un vecteur AAV inductible et un journaliste GFP pour identifier les neurones reprogrammés in vivo. Ce choix de vecteurs viraux a l'avantage d'infecter à la fois les cellules de division et de non-division du cerveau, en augmentant le nombre de cellules ciblées, comme une alternative à l'utilisation du rétrovirus7,8. Un journaliste FLEX (GFP) piloté par la synapsine spécifique aux neurones nous a permis de détecter spécifiquement les neurones nouvellement générés. Des études antérieures ont utilisé des promoteurs spécifiques au sous-type pour la reprogrammation in vivo7,9, qui permettent également l'expression de gènes de reprogrammation et de journalistes dans des types de cellules spécifiques. Cependant, cette méthode exige une identification plus poussée des neurones reprogrammés par l'analyse post mortem de la co-expression des marqueurs de journaliste et neuronal. L'utilisation d'un journaliste spécifique aux neurones, comme celui décrit ci-contre, permet une identification directe. Ceci fournit une preuve directe d'une conversion réussie et permet une identification de cellules vivantes qui est exigée pour l'électrophysiologie de correction-clamp.

<table><tbody><tr><td><RÉACTIFS>FORTS POUR LE CLONAGE AAV5 ET LA PRÉPARATION DE VECTEURS VIRAUX</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAVA-CA-FLEX</td><td>AddGene</td><td>38042</td><td></td></tr><tr><td>Ascl1</td><td>AddGene</td><td>67291</td><td>NM_008553.4</td></tr><tr><td>Lmx1a</td><td>AddGene</td><td>33013</td><td>NM_0033652.5</td></tr><tr><td>Nurr1</td><td>AddGene</td><td>35000</td><td>NM_013613.2</td></tr><tr><td>GFP-syn</td><td>AddGene</td><td>30456</td><td></td></tr><tr><td>Séquence LoxP (FLEX) 1</td><td></td><td></td><td>GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac gaagttatatcaaaataggaagaccaatgcttc accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa gttatactagtcccgggaaggcgagaggga agaggctctaga</td></tr><tr><td>LoxP (FLEX) séquences</td><td></td><td></td> <td>2tactagtataacttcgtataggatactttatac gaagttatcattgggattcttcctattttgatc caagcatcaccatcgaccctctagtccacatct caccatcgacccataacttcgtatagcatacat tatacgaagttatgtccctcgaagaggttcgaa ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC</td></tr><tr><td>pDP5</td><td>Plasmid Factory</td><td>PF435</td><td></td></tr><tr><td>pDP6</td><td>Plasmid Factory</td><td>PF436</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>FBS (sérum de veau fœtal)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)+ Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61965026</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>14190094</tr><tr><td>cellules HEK293</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85120602-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Flacons</td><td>BD Falcon</td><td>10078780</td><td>175 cm2</td></tr><tr><td>Tris H-CL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10812846001</td><td> Pour tampon TE Utiliser 10 mM, pH 8,0 ; pour tampon de lyse utiliser 50 mM, pH 8,5 ; pour le tampon IE utiliser 20 mM, pH 8,0 ; pour le tampon d’élution utiliser 20 mM, pH 8,0 </td></tr><tr><td>EDTA EDTA</td><td>: Invitrogen</td><td>EDTA : AM9260G</td><td> Pour l’utilisation d’un tampon TE 1 mM EDTA </td></tr><tr>Eau <td></td><td></td><td>ultrapure,</td><td> voir Système d’eau ultrapure </td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SigmaAldrich</td><td>C5080</td><td>2,5 M</td></tr><tr><td>Dulbecco&acute ; s solution saline tamponnée au phosphate (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td> POUR HBS utilisation 140 mM ; pour tampon de lyse utilisation 150 mM ; pour tampon IE utilisation 15 mM ; pour tampon d’élution utilisation 250 </td></tr><tr><td>mM MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td> Pour lyse Tampon : 1 mM </td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse tubes d’étanchéité</td><td>Beckman Coulter</td><td>Quick-Seal&reg ; &nbsp ; Tube</td><td></td>en polypropylène</tr><tr><td>OptiPrep&trade ; &nbsp ; Gradient de densité Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 10 ml-18G aiguille</td><td>BD</td><td>305064</td><td></td></tr><tr><td>Bouteilles en verre</td><td>de laboratoire VWR</td> <td>?</td><td></td></tr><tr><td>Filtre échangeur d’anions</td><td>Unité d’acrodisque PALL de laboratoire MSTG25Q6</td><td></td><td> avec membrane Mustang Q </td></tr><tr><td>Unité de filtration centrifuge</td><td>Merck</td><td>Z740210-24EA</td><td> Dispositif Amicon Ultra-4 </td></tr><tr><td>Kits d’isolement d’ADN plasmidique sans endotoxines</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A33073</td><td></td></tr><tr><td>Na2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td>Tube Falcon 15 mL</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Corning 352196</td><td></td></tr><tr><td>Tube Falcon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Corning 352070</td><td></td></tr><tr><td>Flacons en verre</td><td>Novatech</td><td>30209-1232</td><td> CGGCCTCAGFGAGCGA </td></tr><tr><td>Amorce avant pour séquence</td><td></td><td></td> de répétition terminale inversée (ITR) <td> GGAACCCCTAGTGATGGAGTT </td></tr><tr><td>Amorce inversée pour la séquence</td><td></td><td></td> de répétition terminale inversée (ITR) <td> CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG </td></tr><tr><td>5&acute ; FAM / 3&aigu ; Sonde BHQ1</td><td>Jena Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtre 0,22 mm</td><td>Filtre Merck</td><td>SLGV004SL</td><td>Millex-GV</td></tr> <tr><td><fort>ÉQUIPEMENT AAV5 PRÉPARATION DE VECTEUR VIRAL </FORT></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Congélateur -20 &deg ; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Congélateur -80 &deg ; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Réfrigérateur +4 &deg ; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV salle</td><td></td><td></td><td></td>virale</tr><tr><td>Système d’eau ultrapure</td><td>Merck</td><td>Milli-Q&reg ; IQ 7000</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur vortex</td><td>VWR</td><td>444-0004</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>Beckman Optima LE-80K Ultracentrifugeuse</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Tuttnauer</td><td>2540 EL</td><td></td></tr><tr><td>Réaction en chaîne par polymérase (PCR)</td><td>BioRad</td><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>PCR quantitative (qPCR)</td><td>Roche</td><td>LightCycler&reg ; 480 Système</td><td></td></tr><tr><td>de centrifugation</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Sorvall ST16</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSGP02</td><td></td></tr><tr><td>ANIMAL MODEL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NG2-Cre</td><td>mice Jackson</td><td>NG2-CrexB6129, Stock #008533</td><td></td></tr><tr><td>RÉACTIFS POUR L’INJECTION DE FACTEURS DE REPROGRAMMATION DANS LE CERVEAU</ Eau forte >Saline</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Apoteket AB</td><td></td><td>70 %</td></tr> <tr><td>Éthanol</td><td>Solveco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolfurane</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td> Diluer à 1 % solution avec de l’eau tiède. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Virkon</td><td>Viroderm</td><td>7511° ;</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Apoteket AB</td><td>P0500000</td><td> i.p. pour procédure terminale à la dose de 60 mg/ml. </td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Retrobeads</td><td>Lumafluor</td><td>R170</td><td></td></tr><tr><td>Buprénorphine</td><td>Apoteket AB<STRONG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>>EQUIPMENT POUR L’INJECTION DE FACTEURS DE REPROGRAMMATION DANS LE CERVEAU</td><td></td><td></td><td> De RSG Solingen. </td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>VWR</td><td>233-1552</td><td>de Biochem.</td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td>VWR</td><td>232-0007</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td>VWR</td><td>232-0120</td><td></td></tr><tr><td>Porte-scalpel</td><td>VWR</td><td>RSGA106.621</td><td>Numéro 20.</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>VWR</td><td>RSGA106.200</td><td></td></tr><tr><td>Cadre stéréotaxique</td><td>Stoelting Europe</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>Barres d’oreille de souris</td><td>Stoelting Europe</td><td>51648</td><td>5 ul</td></tr><tr><td>Seringue avec aiguille amovible</td><td>Hamilton Company</td><td>65</td><td> 0,75 diamètre intérieur et 1,5 diamètre extérieur. </td></tr><tr><td>Capillaires en verre</td><td>Stoelting</td><td>50811</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur capillaire en verre</td><td>Sutter company</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Foret dentaire</td><td>Agnthos AB</td><td>1464</td><td></td></tr><tr><td>Rasoir</td><td>Agnthos AB</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>Chambre et pompe isoflurane</td><td>Agnthos AB</td><td>8323101</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>Seringues</td><td>Merck</td><td>Z118400-30EA</td><td>25G</td></tr><tr><td>Aiguilles</td><td>Merck</td><td>Z192414&nbsp ; Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Souris et rat néonatal adaptateur pour fram stéréotaxique</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Coussin chauffant</td><td>Braintree scientific, inc</td><td>53800M</td><td> De Covidien 2187. </td></tr><tr><td>Gaze de coton</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-037-902</td><td></td></tr><tr><td>Tube en caoutchouc</td><td>Elfa Distrelec</td><td>HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150</td><td></td></tr><tr><td>Cotons-tiges</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-366-473</td><td></td></tr><tr><td>RÉACTIFS POUR ENREGISTREMENTS DE PATCHS À CELLULES ENTIÈRES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4-H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2-6 H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2-6 H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4-7 H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td> voir Système d’eau ultrapure </td></tr><tr><td>Eau</td><td></td><td></td> ultrapure <td>Prepare 1 ou 2M.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958-500G</td><td></td></tr><tr><td>K-D-gluconate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500&nbsp ; Sigma</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KOH-EGTA (Etilene glycol-bis-N-tetracetic acid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889&nbsp ; Sigma</td><td></td></tr><tr><td>KOH- Acide Hepes (N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-acide éthanesulfonique)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Mg2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Biocytine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxine</td><td>Merck</td><td>P1675²5 ; Sigma</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Merck</td><td>C239° ; Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT POUR L’ENREGISTREMENT DE PATCHS À CELLULES ENTIÈRES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette en verre borosilicaté</td><td>Sutter Company</td><td>B150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur capillaire en verre</td><td>Sutter company</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>Leica VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>WaterBath</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSGP02</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Clampfit</td><td>Dispositifs moléculaires Logiciel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp</td><td>Dispositifs</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>moléculaires<forts>réactifs POUR L’IMMUNOHISTOCHIMIE</FORT></td><td></td><td></td><td> Utilisation à une concentration de 4 %.&nbsp ; MISE EN GARDE&NBSP ; Le PFA est un puissant fixateur. Évitez l’ingestion et le contact avec la peau. </td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Merck Millipore</td><td>1040051000</td><td> Utilisation à une concentration de 0,1 %. </td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>10254640</td><td> Donkey.Utilisation à une concentration de 1 : 400. </td></tr><tr><td>Sérum</td><td>Merck Millipore</td><td>S30-100ML</td><td> Reconstituer la poudre dans de l’eau Milli-Q à 1 mg/mL. Aliquote et stocker à -20&deg ; C,&nbsp ; sensible à la lumière. Utiliser à une concentration de 1 : 500. </td></tr><tr><td>4&prime ;,6-Diamidino-2&prime ;-dichlorhydrate de phénylindole (DAPI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td> 1:600 dans KPBS-T. </td></tr><tr><td>streptavidin- Cy3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>434315</td><td>1:5000, lapin.</td></tr><tr><td>Anti-GAD65/67</td><td>Abcam</td><td></td><td>1:2000, souris.</td></tr><tr><td>Anti-PV</td><td>Sigma</td><td>P3088</td><td>1:200, chèvre.</td></tr><tr><td>Anti-Chat</td><td>Merk</td><td>AB143</td><td>1:5000, lapin.</td></tr><tr><td>Anti-NPY</td><td>Immunostar</td><td>22940</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NIST200B</td><td>1:1000, poulet.</td></tr><tr><td>Anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Solution de montage</td><td>Merck</td><td>10981</td><td> Alcool polyvinylique avec DABCO&reg ;, anti-décoloration </td></tr><tr><td>OCT</td><td>Agar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scientific Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Eau</td><td></td><td></td><td></td>distillée</tr><tr><td>Solution antigel</td><td>Tissue Pro Technology</td><td>AFS05-1000N, 1000 mL/ch.</td><td></td></tr><tr><td>ÉQUIPEMENT <FORT>POUR L’IMMUNOHISTOCHIMIE</Microscope >à fluorescence inversée</td> Leica DMI6000 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>B</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Leica</td><td>TCS SP8 Microscope confocal à balayage laser.</td><td></td></tr><tr><td>Prisme</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>SM2010R</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo reprogrammation directe des cellules gliales résidentes en interneurones par injection intracérébrale de vecteurs viraux

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

La conversion des glies résidentes dans le cerveau en neurones fonctionnels et spécifiques au sous-type in vivo permet de faire un pas en avant vers le développement de thérapies alternatives de remplacement cellulaire tout en créant des outils pour étudier le destin cellulaire in situ. Jusqu'à présent, il a été possible d'obtenir des neurones par reprogrammation in vivo, mais le phénotype précis de ces neurones ou comment ils mûrissent n'a pas été analysé en détail. Dans ce protocole, nous décrivons une conversion plus efficace et une identification cellulaire spécifique des neurones reprogrammés in vivo, à l'aide d'un système vectorielle virale basé sur l'AAV. Nous fournissons également un protocole pour l'évaluation fonctionnelle de la maturation neuronale des cellules reprogrammées. En injectant des vecteurs flip-excision (FLEX), contenant les gènes de la reprogrammation et de la synapsine à des types de cellules spécifiques dans le cerveau qui servent de cible pour la reprogrammation cellulaire. Cette technique permet d'identifier facilement les neurones nouvellement reprogrammés. Les résultats montrent que les neurones reprogrammés obtenus mûrissent fonctionnellement au fil du temps, reçoivent des contacts synaptiques et montrent des propriétés électrophysiologiques de différents types d'interneurones. En utilisant les facteurs de transcription Ascl1, Lmx1a et Nurr1, la majorité des cellules reprogrammées ont des propriétés d'interneurons à pointe rapide et contenant de la parvalbumine.

L'injection de vecteurs AAV est utilisée pour reprogrammer avec succès les cellules gliales NG2 résidentes dans les neurones du striatum de souris NG2-Cre (Figure 1A). Pour cibler spécifiquement NG2 glia, les vecteurs FLEX avec des gènes de reprogrammation/reporter, sont insérés dans une direction antisens et flanqués de deux paires de sites loxP antiparallèles et hétérorotypic (Figure 1B). Chacun des trois gènes de reprogrammation (Ascl1, Lmx1a et Nurr1) est placé sous le contrôle du promoteur de l'abc omniprésent sur les vecteurs individuels. Afin de s'assurer que l'expression GFP est limitée aux neurones reprogrammés provenant d'une cellule exprimant cre, GFP est placé sous le contrôle du promoteur de synapsin spécifique aux neurones, (également dans un vecteur FLEX).
L'utilisation de la combinaison de la reprogrammation et des constructions de reporter permet la génération de neurones GFP-positifs dans le striatum de souris (Figure 1C, C'). L'utilisation de la construction du journaliste sans la présence de gènes de reprogrammation ne donne pas de neurones GFP-positifs (Figure 1D).
Les neurones reprogrammés qui sont remplis de biocytine sont visibles après l'immunocoloration post-mortem (Figure 2A). Si la conversion est réussie, il devrait y avoir une morphologie neuronale étendue. Les enregistrements électrophysiologiques des neurones reprogrammés montrent la présence de connexions fonctionnelles postsynaptiques avec des mesures d'activité spontanées (Figure 2B, C). Ceci peut être bloqué avec le bloqueur gabAergique ionotropique ou glutamatergic (Picrotoxin ou CNQX), suggérant l'entrée synaptique excitatoire et inhibitrice aux neurones reprogrammés. L'occurrence de l'activité spontanée augmente avec le temps après l'injection virale (figure 2D),indiquant une maturation progressive.
Les potentiels d'action induits par le courant sont présents dans les neurones fonctionnels. Les potentiels d'action augmentent en nombre au fil du temps après la conversion (Figure 2E). Ceci indique davantage la maturation dans la fonction neuronale. Dans un neurone immature, le courant induira aucun ou très peu de potentiels d'action (Figure 2F).
Les modèles de tir d'un neurone est de type cellulaire spécifique car il dépend de facteurs tels que la morphologie des cellules et l'expression du canal15. Les modèles enregistrés dans les neurones reprogrammés in vivo peuvent être distingués en groupes et comparés à ceux des sous-types neuronaux endogènes, par exemple les interneurons à pointe rapide (cell type B, figure 3B) ou d'autres types de cellules (Figure 3A,C,D ). Les différences électrophysiologiques observées peuvent être confirmées par la présence de marqueurs de sous-type spécifiques et la coexpression avec GFP (Figure 3E-H). Au total, ces données indiquent que les neurones reprogrammés présents dans le striatum ont des propriétés de différents types d'interneurons, tels que Les interneurons exprimant par-albumine, ChAt- et NPY, ainsi que l'identité striatal de neurones épineux moyens (DARPP32) ( Figure 3E -H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig1.jpg"> Figure 1 : Reprogrammation in vivo des gliales NG2 résidentes en neurones. (A) Représentation schématique de la reprogrammation in vivo de NG2 médié par le virus AAV. (B) Représentation schématique des constructions AAV5 FLEX utilisées pour la reprogrammation in vivo, dans laquelle l'expression des gènes est réglementée par l'expression Cre dans les cellules ciblées. (C et C') Neurones reprogrammés in vivo, résultant de l'injection de Syn-GFP et d'ALN dans le Striatum. (D) Absence de neurones reprogrammés lorsqu'aucun facteur de reprogrammation n'est ajouté dans le cocktail viral, et que seule la construction du journaliste est injectée in vivo. Barres d'échelle de 100 mm (C), 25 mm (C'), 25 mm (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig2.jpg"> Figure 2 : Les neurones reprogrammés in vivo sont fonctionnels et montrent une maturation au fil du temps. (A) Neurone reprogrammé rempli de biocytine, montre la morphologie neuronale mûre, y compris les épines dendritiques. Traces montre (B) l'activité inhibitrice (GABAergic) qui est bloquée avec la picrotoxine, un antagoniste des récepteurs GABAA et (C) activité excitatrice qui est bloqué avec CNQX, un antagoniste des récepteurs AMPA. (D) Le nombre de neurones avec l'activité postsynaptique augmente avec le temps. (E) Les neurones patchés montrent le tir répétitif déjà à 5 semaines après l'injection (w.p.i.) et continuent à montrer qu'à 8 et 12 w.p.i. (F) Potentiel d'action induit par le courant et activité postsynaptique d'un neurone immature, montrant peu de synaptique événements et peu de potentiels d'action par rapport à B et D. Barre d'échelle de 25 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig2large.jpg" target="_blank">S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2.jpg"> Figure 3 : Les neurones reprogrammés in vivo montrent des propriétés immunohistochimiques et électrophysiologiques des interneurons striatal. (A-D) Les modèles de tir des neurones reprogrammés in vivo peuvent être de types distincts : (A) Type A est similaire au neurone épineux moyen endogène (DARPP32); (B) semblable aux interneurons à pointe rapide (PVMD); (C) semblable aux neurones à faible seuil avec un affaissement proéminent (NPYMD); (D) neurones tirant avec une grande hyperpolarisation après (Chat). (E-H) Images confocales montrant la co-localisation du GFP et des marqueurs interneuron PV (E), ChAT (F), NPY (G), et marqueur neuronal de projection DARPP32 (H). Toutes les barres d'échelle de 50 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Ce protocole vise à générer des interneurones directement reprogrammés in vivo, à l'aide d'un système viral à base d'AAV dans le cerveau et d'un journaliste GFP piloté par la synapsine FLEX, qui permet l'identification cellulaire et une analyse plus approfondie in vivo.

In Vivo Reprogrammation directe des cellules gliales résidentes en interneurones par injection intracérébrale de vecteurs viraux

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Ce protocole montre qu’il est possible de générer de nouveaux neurones directement dans le cerveau à partir de glia résidents et que ces cellules reprogrammées mûrissent en neurones spécifiques au sous-type. Le principal avantage est le virus AAV dépendant de la cre qui permet un ciblage spécifique de la NG2-glia et le journaliste GFP qui étiquette les neurones reprogrammés pour analyse. Générer de nouveaux neurones dans le cerveau peut conduire à un développement futur pour les thérapies de remplacement cellulaire dans le cerveau.Dans notre protocole, nous générons les interneurones parvalbumin-positifs qui ont des implications pour les troubles psychiatriques. La reprogrammation in vivo peut être appliquée à d’autres zones et circuits cérébraux en fonction de l’état neuronal de phénotype et neurologique que vous souhaitez cibler. Jenny Johansson: technicienne, Maria Pereira, ancienne doctorante, et Marcella Birtele, doctorante dans notre laboratoire, feront la démonstration de la procédure.Pour produire un vecteur viral AAV5, grainez les cellules HEK293T avec un milieu de culture standard dans cinq flacons T175. Lorsque les cellules atteignent 50 à 70% de confluence, préparer le mélange suivant pour la transvection. Dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres, ajouter des quantités molaires égales de plasmide vectoriel, et plasmide d’aide de série pDG.Ajouter le tampon Tris-EDTA à un volume final de 144 microlitres puis ajouter de l’eau ultrapure pour obtenir un volume total de 1296 microlitres et mélanger. Ensuite, ajouter 144 microlitres de chlorure de calcium molaire de 2,5 molaires et mélanger. Après cela, ajouter 1,92 millilitres de HBS à la solution d’ADN et vortex immédiatement.Incuber à température ambiante pendant exactement 60 secondes. Par la suite, transférer la solution à 28 millilitres de milieu de culture cellulaire fraîche et mélanger. Remplacer le milieu dans les flacons par le mélange de transvection moyen.Attendez trois jours et transférez les médias au gaspillage. Ajouter cinq millilitres de tampon de récolte à chaque flacon, puis ajouter quatre millilitres de DPBS à chaque flacon pour rincer les cellules restantes et mettre en commun avec la solution cellulaire. Centrifugeuse les cellules récoltées à 1000 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Après centrifugation, retirer le supernatant et dissoudre la pastille en 15 millilitres de tampon de lyse. Congeler le tube de centrifugeuse de 50 millilitres sur la glace sèche pendant 15 minutes et les conserver dans un congélateur de moins 20 degrés Celsius. Avant utilisation, décongeler la cellule récoltée lysate dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius.Dans cette procédure, effectuer la purification de l’AAV par ultracentrifugation de gradient iodoxanol et utiliser des tubes de plafond ultracentrifugeuse avec centrifugation à 350 000 x g pendant une heure et 45 minutes à température ambiante. Pour extraire la phase contenant l’AAV, insérez une seringue de 10 millilitres avec une aiguille de calibre 18 à environ deux millimètres au-dessous de la bordure de phase de 40 à 60 %, le biseau faisant face vers le haut et se retirant. Assurez-vous de vous arrêter avant d’atteindre la bande protéique après l’extraction de cinq à six millilitres du vecteur viral.Ensuite, purifiez et concentrez le gradient iodixanol dilué à travers un filtre d’échange d’anions, en le poussant à travers à un taux pas plus rapide qu’une goutte par seconde. Par la suite, poussez trois millilitres de tampon IE lentement à travers le filtre pour le laver. Ensuite, élitez le mélange dans une unité de filtre centrifuge avec un à deux millilitres de tampon d’élitution.Ajoutez DPBS à l’appareil à un volume final de quatre millilitres. Centrifugeuse à 2000 x g à température ambiante jusqu’à ce que moins de 0,5 millilitres de DPBS reste dans le filtre. Par la suite, retirer le liquide du fond du tube, le remplir de quatre millilitres de DPBS et la centrifugeuse à nouveau.Répétez cette étape deux fois de plus, assurez-vous que le volume de vecteur concentré sur le filtre est d’environ 200 microlitres après la dernière centrifugation. Retirez le vecteur concentré de 200 microlitres à l’aide d’une pipette et poussez-le à travers un filtre de 0,22 micromètre pour le stériliser. Ensuite, aliquot 200 microlitres dans un flacon de verre avec insert imbriqué.Pour injecter des facteurs de reprogrammation, placez une souris anesthésiée dans le cadre stéréotaxique. Administrer l’analgésie appropriée au début de la chirurgie, puis apporter la pointe du capillaire en verre de l’aiguille d’injection juste au-dessus bregma. Assurez-vous que la pointe capillaire est parfaitement droite dans les avions A-P et M-L.Réinitialisez les valeurs M-L et A-P à 0,0 sur le compteur de coordonnées numériques. Pour vous assurer que la tête de l’animal est en position parfaitement plate, utilisez le compteur de coordonnées numériques pour mesurer la valeur de coordonnées D-V lorsque le bras A-P est à plus 2,0 et moins 2,0 ainsi que lorsque le bras M-L est à plus 2,0 et moins 2,0. Ajustez la hauteur de la barre dentaire et des barres d’oreille en conséquence.Par la suite, soulevez légèrement la seringue et percez un trou à l’aide d’une perceuse dentaire aux coordonnées d’injection. Commencez à forer sur le site, en travaillant d’une manière circulaire et douce. Ensuite, placez un morceau de gaze de coton sur l’incision ouverte et rincez la seringue avec une solution saline.Après le rinçage, dessinez une bulle d’air, puis un microlitre de solution contenant le vecteur viral. Assurez-vous que la solution virale peut être facilement visualisée sous la bulle d’air. Ensuite, abaissez la seringue, progressant lentement à la profondeur désirée, et assurez-vous que la trajectoire est claire des fragments d’os.Par la suite, injecter un microlitre de la solution virale à un taux de 0,4 microlitres par minute. Lorsque l’injection est terminée, prévoyez deux minutes de diffusion avant le retrait de la seringue. Après diffusion, rétractez lentement la seringue jusqu’à ce que la pointe du capillaire soit complètement retirée du cerveau, puis suturez soigneusement l’incision et retirez l’animal du cadre stéréotaxique.Surveillez l’animal dans une station postopératoire jusqu’à ce que la conscience soit retrouvée. Les animaux sont gardés jusqu’à 12 semaines après l’injection du virus pour permettre aux gliales résidentes de se reprogrammer dans des neurones matures. Pour préparer des tranches de cerveau pour l’électrophysiologie à l’aide d’un vibratome, section du cerveau de la partie la plus rostrale jusqu’au niveau striatal à grande vitesse.Ensuite, section du striatum coronally à 275 micromètres à 0,1 millimètre par seconde. Après chaque section, retirez soigneusement le côté striatal non injecté et transférez le côté injecté dans un flacon avec un filet inférieur et une glissière de sens CREB oxygénée dans le bain d’eau à température ambiante. Gardez le flacon à température ambiante jusqu’à ce que toutes les sections soient coupées.Ensuite, augmentez lentement la température du bain d’eau à 37 degrés Celsius et laissez-la pendant 30 minutes, puis éteignez le chauffe-eau et laissez-le refroidir à température ambiante. Après avoir transféré une section de tissu dans une chambre d’enregistrement pour l’électrophysiologie, montez la pipette en verre sur l’électrode d’enregistrement et abaissez-la dans la solution. Vérifiez la résistance de l’électrode.Ensuite, approchez lentement de la cellule reprogrammée avec la pipette, en gardant une légère pression positive dans l’électrode pour éviter de brancher la pointe, et vérifiez que la cellule est GFP positive avant le patchage. Lorsque la cellule est patchée, maintenir la cellule dans la pince actuelle de moins 60 à moins 70 millivolts, et injecter des courants de 500 millisecondes de moins 20 à plus 90 picoamperes avec 10 incréments picoampere pour induire des potentiels d’action. Ceci est indicatif d’une maturation neuronale et d’une reprogrammation réussie.Par la suite, passez à la pince de tension et mesurez le sodium vers l’intérieur et retardez la rectification des courants de potassium à des étapes dépolarisantes de 10 millivolts. Voici un neurone reprogrammé rempli de biocytine post-enregistrée qui montre la morphologie neuronale mature et les épines dendritiques. Ici, les enregistrements électrophysiologiques des neurones reprogrammés montrent la présence de connexions fonctionnelles postsynaptiques avec des mesures spontanées d’activité.Les traces montrent l’activité inhibitrice qui est bloquée avec la picrotoxine, un antagoniste des récepteurs GABAA et l’activité excitatrice qui est bloquée par CNQX, un antagoniste des récepteurs AMPA. Les neurones patchés montrent déjà l’activité postsynaptique à cinq semaines après injection, et continuent à huit et 12 semaines après injection. Le nombre de neurones ayant des potentiels d’action induits par le courant augmente également avec le temps.Une analyse plus détaillée a indiqué plusieurs modèles distincts de tir où la majorité des cellules montrent l’activité de spiking rapide semblable aux interneurones de parvalbumin. L’analyse immunohistochimique à 12 semaines plus loin a montré la co-expression du journaliste GFP et de la parvalbumin. Suite à cette procédure, vous pouvez examiner l’expression du gène avec patch chercher la technique ou d’évaluer la connectivité synaptique tridimensionnelle avec le traçage monosynaptique et iDISCO.Maintenant qu’il est possible de reprogrammer les glia résidents en parvalbumine exprimant des interneurones, nous avons commencé à étudier si elles sont authentiques et peuvent être utilisées comme un outil thérapeutique. N’oubliez pas de suivre les protocoles et les lignes directrices établis lors de la manipulation des animaux et de l’utilisation du virus AAV.

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Enregistrements électrophysiologiques de neurones reprogrammés dans une tranche de cerveau de souris

Source : Pereira, M. et. al., In vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo démontre l’injection stéréotaxique d’un virus adéno-associé dans le cortex cérébral d’une souris transgénique pour délivrer des gènes de reprogrammation neuronale et de rapporteur fluorescent dépendants de Cre dans les cellules gliales.

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