Name: Inactivation chimique de lE3 Ubiquitin Ligase Cereblon par des Homo-PROTAC à base de Pomalidomide (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Découvrez l'inactivation chimique de Cereblon par des homo-PROTAC à base de pomalidomide pour la dégradation protéique ciblée. Cette méthode innovante permet d'étudier les mécanismes moléculaires des analogues de thalidomide.

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Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Emmy-Noether Program Kr-3886/2-1 et SFB-1074 à J.K.; FOR2372 à M.G.)

1. Préparation des molécules PROTAC
CAUTION : Veuillez consulter toutes les fiches de données pertinentes sur la sécurité des matériaux (MSDS) avant d'être utilisées. Plusieurs des produits chimiques utilisés dans ces synthèses sont toxiques et cancérigènes. Veuillez utiliser toutes les pratiques de sécurité appropriées et l'équipement de protection individuelle.
<ol><li>Préparation de tert-butyl N-(2,6-dioxo-3-piperidyl)carbamate (composé 1)
	<ol>
<li>Ajouter 1,1'-carbonyldiimidazole (1.95 g, 12 mmol) et une quantité catalytique de 4-(dimethylamino)pyridine (5 mg) à un mélange de Boc-Gln-OH (2.46 g, 10 mmol) en THF (50 ml) en 100 ml de flacon rond de fond avec une barre d'agitation et équipé d'un reflux condenser. Chauffer au reflux pendant 10 h en remuant jusqu'à ce qu'une solution claire soit formée.</li>
		<li>Retirer le solvant sous pression réduite à l'frémisseur rotatif, ajouter EtOAc (200 ml) et le transférer dans un entonnoir séparatif. Laver la couche organique avec H2O (50 ml) et la saumure (50 ml) et la sécher sur Na2SO4.</li>
		<li>Filtrer la solution à l'intérieur d'un court bloc de gel de silice (5 cm de diamètre et 5 cm de hauteur) et échapper à un autre volume (200 ml) d'EtOAc.</li>
		<li>Évaporer le solvant et sécher le solide incolore obtenu dans le vacuo.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de tert-butyl N-(1-méthyl-2,6-dioxo-3-piperidyl)carbamate (composé 2)
	<ol>
<li>Mélanger le composé 1 (2,28 g, 10 mmol) avec le carbonate de potassium moulu (2,76 g, 20 mmol) et le DMF (25 ml) dans un flacon rond de 100 ml. Ajouter de l'iodométhane (1,42 g, 0,62 ml, 10 mmol) à l'aide d'une seringue et équiper le flacon d'un septum en caoutchouc perforé. Placer le vaisseau de réaction dans un bain à ultrasonation pendant 2 h.</li>
		<li>Diluer le mélange de réaction avec EtOAc (100 ml) et le transférer dans un entonnoir séparatiste. Laver la couche organique avec 1 N NaOH (2x 25 ml), H2O (25 ml), et la saumure (25 ml), et la sécher sur Na2SO4.</li>
		<li>Filtrer et évaporer le solvant. Purififier le produit par chromatographie de colonne au-dessus du gel de silice (6 cm de diamètre de colonne et 20 cm de hauteur) en utilisant l'éther/EtOAc de pétrole (2:1).</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-fluoroisoindoline-1,3-dione (composé 3)
	<ol>
<li>Mélanger l'anhydride 3-fluorophthalique (1,25 g, 7,5 mmol), le glutarimide 1 (1,14 g, 5 mmol) et une solution d'acétate de sodium (0,50 g, 6,0 mmol) en acide acétique glaciaire (20 ml) dans un flacon de fond rond de 50 ml avec une barre d'agitation et équipé d'un condenseur de reflux. Chauffer le mélange à 120 oC pendant 6 h.</li>
		<li>Après refroidissement, verser le mélange violet sur H2O (100 ml) et remuer pendant 10 min. Recueillir le solide formé par filtration, laver avec H2O (3 x 5 ml) et l'éther de pétrole (3 x 5 ml) et sécher dans le vacuo.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de 4-fluoro-2-(1-methyl-2,6-dioxopiperidin-3-yl)isoindoline-1,3-dione (composé 4)
	<ol>
<li>Mélanger l'anhydride 3-fluorophthalique (1,25 g, 7,5 mmol), le glutarimide 2 (1,21 g, 5 mmol) et une solution d'acétate de sodium (0,50 g, 6,0 mmol) en acide acétique glaciaire (20 ml) dans un flacon de fond rond de 100 ml avec une barre d'agitation et équipé d'un condenseur de reflux. Chauffer le mélange à 120 oC pendant 6 h.</li>
		<li>Après refroidissement, verser le mélange violet sur H2O (100 ml) et remuer pendant 10 min. Recueillir le solide formé par filtration, laver avec H2O (3 x 5 ml) et l'éther de pétrole (3 x 5 ml) et sécher dans le vacuo.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de tert-butyl N-[2-[2-[2-[2-[2,6-dioxo-3-piperidyl)-1,3-dioxo-isoindolin-4-yl]amino]ethoxy]ethoxy]ethyl]carbamate (composé 7)
	<ol>
<li>Chargez un flacon de fond rond de 50 ml avec tert-butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate (5, 0,41 g, 1,65 mmol), composé 3 (0,41 g, 1,50 mmol), DMF sec (10 ml) et DIPEA (0,39 g, 0,51 ml, 3,0 mmol). Équiper d'une barre d'agitation et d'un condensateur de reflux. Chauffer sous l'atmosphère d'argon à 90 oC pendant 10 h.</li>
		<li>Après refroidissement à température ambiante, verser le mélange vert foncé sur H2O (100 ml) et extraire avec EtOAc (3x 50 ml) dans un entonnoir séparatif. Laver les couches organiques combinées avec H2O (50 ml) et saumure (50 ml), sécher sur Na2SO4, filtrer, et se concentrer dans le vacuo.</li>
		<li>Purifiez le produit brut par chromatographie de colonne au-dessus du gel de silice (3 cm de diamètre de colonne et 60 cm de hauteur) en utilisant un gradient d'éther/EtOAc de pétrole (1:1 à 1:2).</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de l'homodimère (composé 8)
	<ol>
<li>Combinez le lien 6 (0,22 g, 0,22 ml, 1,50 mmol), le DIPEA (1,05 ml, 6,00 mmol) et une solution de 3 (0,83 g, 3,00 mmol) dans un DMSO sec (20 ml) dans un flacon rond de 50 ml avec une barre d'agitation et équipé d'un condensateur de reflux. Chauffer sous l'atmosphère d'argon à 90 oC pendant 18 h.</li>
		<li>Après refroidissement à température ambiante, verser le mélange vert foncé sur H2O (100 ml) et extraire avec EtOAc (3x 50 ml) dans un entonnoir séparatif. Laver les couches organiques combinées avec H2O (50 ml) et saumure (50 ml), sécher sur Na2SO4, filtrer et se concentrer dans le vacuo.
</li>
		<li>Purifiez le produit brut par chromatographie de colonne au-dessus du gel de silice (3 cm de diamètre de colonne et 50 cm de hauteur) en utilisant un gradient d'éther/EtOAc de pétrole (1:2) à EtOAc.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation de l'hétérodime (composé 9)
	<ol>
<li>Dissoudre le composé 7 (0,83 g, 1,65 mmol) dans le CHsec 2Cl2 (10 ml). Ajouter l'acide trifluratacétique (10 ml) et remuer le mélange jaune à 40 oC pendant 2 h dans un flacon rond fermé de 50 ml.</li>
		<li>Retirer les volatiles et coévaporer avec CH2Cl2 (4x 5 ml). Sécher les résidus dans le vacuo pendant 10 h.</li>
		<li>Redissoudre le matériau dans le DMF sec (20 ml). Ajouter le composé 4 (0,44 g, 1,50 mmol) et le DIPEA (0,78 g, 1,05 ml, 6,00 mmol) et équiper le flacon de reflux. Chauffer sous l'atmosphère d'argon à 90 oC pendant 10 h.</li>
		<li>Après refroidissement à température ambiante, verser le mélange vert foncé sur H2O (100 ml) et extraire avec EtOAc (3x 50 ml) dans un entonnoir séparatif. Laver les couches organiques combinées avec naHCOsaturé 3 (50 ml), H2O (50 ml), 10 % KHSO4 (50 mL), H2O (50 ml), et saumure (50 ml), sécher sur Na2SO4, filtrer et se concentrer en vacuo.</li>
		<li>Purifiez le produit brut par chromatographie de colonne au-dessus du gel de silice (3 cm de diamètre de colonne et 50 cm de hauteur) en utilisant un gradient d'éther/EtOAc de pétrole (1:2) à EtOAc.</li>
		<li>Élucider et vérifier la structure des molécules (figure 5A composé 8, 5B composé 9) par 1H NMR et 13Spectres RmN C dans DMSO-d6 sur une résonance magnétique nucléaire (RMN) Spectromètre. Vérifiez que la pureté des deux composés est supérieure à 97 % au moyen de la spectrométrie de masse de chromatographie liquide (LC-MS), appliquant une détection de tableau de diode (DAD) à 220 à 500 nm.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Validation fonctionnelle des molécules PROTAC
<ol><li>Analyse de la tache occidentale de la dégradation du CRBN par les PROTAC REMARQUE: Les effets du composé8 Annonceset composé9 (en)sur le niveau de protéine de CRBN ont été examinés par l'analyse occidentale de tache. En outre, l'impact sur les niveaux IKZF1 et IKZF3 pourrait également être confirmé (Figure 6).<ol><li>
Préparation de l'échantillon
		<ol>
<li>Dissoudre les composés 8 et 9, le lénalidomide (Len), le pomalidomide (Pom), le MG132 et le MLN-4924 en DMSO à une concentration de 10 mM, aliquot et stocker à -80 oC jusqu'à une utilisation ultérieure.</li>
			<li>Seed 1 x 106 MM1S cellules dans une plaque de 6 puits avec 2,5 ml de médias et traiter les cellules avec 100 nM ou 1 composé M 8 ou 9 pour 24 h.</li>
			<li>Récolter les cellules après le traitement et la centrifugeuse à 700 x g, 5 min, 4 oC. Laver les granulés de cellules à l'œil de 1x PBS froid pour enlever le support restant, la centrifugeuse à 700 x g, 5 min, 4 oC, et jeter le supernatant. Répétez cette étape une fois.</li>
			<li>Cellules lyse dans le tampon de lyse (25 mM Tris HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 5% glycérol, 1x Protease et Phosphatase Inhibitor Cocktail) pendant 10 min sur glace, centrifugeuse à 320 x g pour 10 min, 4 oC. Récolte supernatant et déterminer la concentration de protéines par un test de protéines d'acide bicinchoninique (bcA test) selon le protocole du fabricant.</li>
			<li>Dénaturer les protéines (15 à 30 g/échantillon) avec 1 x tampon de chargement LDS (5 % de 2-mercaptoethanol) et faire bouillir 10 min, 75 oC.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
SDS-PAGE (en)
		<ol>
<li>Fixer le sandwich au gel avec un gel de séparation de 10 % [4 mL 3x gel tampon (3 M Tris/HCl, 0,3 % (w/v) sulfate de dodecyl de sodium (SDS), pH 8,45), 4 mL d'acrylamide 30 %, 2,52 mL de glycérol 50 %, 1 395 mL H2O, 75 O L 11 % de persulfate d'ammonium (APS) et 9,75 [1,992 mL 3x gel tampon, 0,792 mL 30% acrylamide, 3,168 mL H2O, 36 'L 11% APS, et 6 'L TEMED] dans une unité d'assemblage d'électrodes. Enlever les peignes, rincer les puits avec un tampon cathodique (100 mM Tris/HCl, 100 mM tricine, 0,1 % (w/v) SDS) et charger des échantillons.</li>
			<li>Remplir le tampon d'anode (100 mM Tris/HCl, pH 8,9) dans le réservoir. Chargez l'échantillon de protéines de l'étape 2.1.1.4 et exécutez SDS-PAGE à 70 V, 20 min, suivi de 115 V, 150 min à tension constante.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Immunoblotting et détection de CRBN, IKZF1 et IKZF3
		<ol>
<li>Activer la membrane PVDF (0,45 m) dans 100 % de méthanol pendant 1 min. Membrane equilibrate et gel de séparation dans un tampon de transfert 1x [192 mM de glycine, 25 mM Tris-base/HCl, 900 mL H2O), 20 % méthanol, 0,1 % SDS, pH 8,3].</li>
			<li>Assembler la cassette de ballonnement selon le protocole du fabricant. Transférer le gel à 180 mA pendant 90 min.</li>
			<li>Laver la membrane 3x en 1x TBS-T (25 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6, 0,1 % Tween 20) pendant 5 à 10 min chacun à température ambiante. Bloquer la membrane dans 5 % de lait non séché aux graisses (NFDM), TBS-T pendant 1 h à température ambiante. Laver la membrane 3x en 1X TBS-T pendant 5 à 10 min chacune à température ambiante.</li>
			<li>Incuber la membrane avec l'anticorps primaire pour CRBN (1:500 dans 5% BSA, TBS-T) avec des secousses douces à 4 oC, pendant la nuit.</li>
			<li>Laver la membrane 3x en 1X TBS-T pendant 5 à 10 min chacune à température ambiante. Incubate membrane avec anti-souris (1:10.000 dans 5% NFDM, TBS-T) ou anti-lapin (1:5.000 dans 5% NFDM, TBS-T) anticorps secondaires couplés au raifort peroxidase HRP (1 h à température ambiante.)</li>
			<li>Laver la membrane 2x en 1X TBS-T pendant 5 à 10 min chacune à température ambiante. Répétez cette étape deux fois avec 1x TBS.</li>
			<li>Incuber la membrane pendant 2 min avec la solution de substrat HRP selon les protocoles du fabricant et détecter la chemiluminescence dans un dispositif de détection de chemiluminescence.</li>
			<li>Laver la membrane 1x en 1X TBS pendant 5 à 10 min chacune à température ambiante. Pour la libération d'anticorps, la membrane de bande dans le tampon de décapage disponible dans le commerce pendant 15 min. Laver la membrane 3x dans 1X TBS pendant 5-10 min chacun à la température ambiante.</li>
			<li>Reblasser la membrane dans 5 % de lait non séché aux graisses, TBS-T pendant 1 h à température ambiante. Laver la membrane 3x en 1x TBS-T pendant 5 à 10 min chacun e à température ambiante et reprobe avec IKZF1, IKZF3 ou tubulin selon l'étape 2.1.3.4.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Expériences de compétition avec MG132, MLN4942 ou pomalidomide REMARQUE : Pour confirmer si le CRBN est dégradé par la voie ubiquitine-protéasome, nous avons effectué des expériences de compétition avec l'inhibiteur de protéasome MG132 et un inhibiteur d'enzyme activant de neddylation (NAE) MLN4942 (figure 7).<ol>
<li>Seed 1 x 106 MM1S cellules par puits dans une plaque de 6 puits. Cellules de pretreat avec 10 mg MG132, 10 MLN4942, ou lénalidomide (100x), et incuber 1 h à 37 oC, 5 % CO2.</li>
		<li>Ajouter 100 nM composé 8 pour 3 h à 37 oC, 5% CO2.</li>
		<li>Cellules de récolte pour la tache occidentale selon l'étape 2.1.1.</li>
	</ol></li>
	<li>Tests de viabilité cellulaire dans plusieurs lignées cellulaires de myélome REMARQUE : Cet essai est utilisé pour tester l'impact sur la viabilité des cellules et, en outre, contrarier l'effet des MiDI sur plusieurs cellules de myélome par prétraitement des cellules avec le composé 8 (Figure 8, Figure 9A, B).<ol>
<li>Seed 5 x 104 MM1S cells per well in a 96-well plate in biological triplicates for viability assay. Pour l'analyse de tache occidentale, graine 1 x 106 cellules MM1S par puits dans une plaque de 6 puits dans les triplicats biologiques.</li>
		<li>Traiter les cellules avec DMSO ou 100 nM, 1 M, ou 10 M composé 8, composé 9 ou pomalidomide et incuber pendant 24 h, 48 h, ou 96 h à 37 oC, 5 % CO2. Pour les expériences de sauvetage, traiter les cellules avec 100 nM composé 8 pour 3 h, avant ou après l'ajout de 1 pomalidomide M et couver pendant 96 h.</li>
		<li>Mesurer la luminescence de la plaque de 96 puits avec un analyse de viabilité de cellules luminescentes, selon le protocole du fabricant sur un lecteur de plaque ou des cellules de récolte de la plaque de 6 puits pour l'analyse occidentale de tache.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent pas de conflit d'intérêts financier potentiel.

La conception de ces homo-PROTAC tel que décrit ici pour CRBN repose sur l'affinité spécifique de la pomalidomide à CRBN, qui a été utilisée avec succès dans de nombreux PROTAC hétérofunctional et a abouti au développement de PROTAC 8 comme un très crBN sélectif de grader. La spécificité de notre molécule a déjà été confirmée par des analyses protéomiques24. Pour les KO génétiquement médiatisés, l'exclusion et la validation des effets secondaires est difficile et prend beaucoup de...

Les médicaments immunomodulateurs (IMiDs) thalidomide et ses analogues, lénalidomide et pomalidomide, tous approuvés pour le traitement du myélome multiple, se lient à l'E3 ubiquitin ligase cereblon (CRBN), un adaptateur de substrat pour cullin4A-RING E3 ubiquitin ligase (CRL4CRBN)1,2,3. La liaison des IMiD améliore l'affinité du CRL4CRBN aux facteurs de transcription lymphoïde Ikaros (IKZF1) et Aiolos (IKZF3), conduisant à leur ubiquitination et dégradation (Figure 1)4,5, 6 Annonces , 7 Annonces , 8. Puisque IKZF1 et IKZF3 sont essentiels pour les cellules de myélome multiples, leur inactivation a comme conséquence l'inhibition de croissance. SALL4 a été récemment trouvé comme un néo-substrat iMiD-induit supplémentaire de CRBN qui est probablement responsable de la tératogénicité et la catastrophe dite Contergan dans les années 1950 causée par la thalidomide9,10. En revanche, la caséine 1 (CK1) est un substrat spécifique au lénalidomide de CRBN qui est impliqué dans l'effet thérapeutique dans le syndrome myélodydyplasique avec des suppressions de chromosome 5q11.
La capacité des petites molécules à cibler une protéine spécifique pour la dégradation est une implication passionnante pour le développement de médicaments modernes. Alors que le mécanisme de la thalidomide et de ses analogues a été découvert après leur première utilisation chez l'homme, ce qu'on appelle Proteolyse Targeting Chimeras (PROTACs) ont été conçus pour cibler spécifiquement une protéine d'intérêt (POI) (Figure 2)12,13,14,15,16,17,18. Les PROTAC sont des molécules hétérophobes qui se composent d'un ligand spécifique pour le POI connecté via un linker à un ligand d'une ligase d'ubiquitine E3 comme CRBN ou von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20, 21,22. Les PROTAC induisent la formation d'un complexe ternaire transitoire, dirigeant le POI à la ligase d'ubiquitine d'E3, ayant pour résultat son ubiquitination et la dégradation protéasomal. Les principaux avantages des PROTAC par rapport aux inhibiteurs conventionnels sont que la liaison à un POI est suffisante plutôt que son inhibition et, par conséquent, les PROTAC peuvent potentiellement cibler un spectre beaucoup plus large de protéines, y compris celles qui ont été considérées comme non médicamentables comme facteurs de transcription15. En outre, les molécules chimériques agissent catalytiquement et ont donc une puissance élevée. Après le transfert d'ubiquitine au POI, le complexe ternaire se dissocie et est disponible pour la formation de nouveaux complexes. Ainsi, de très faibles concentrations PROTAC sont suffisantes pour la dégradation de la protéine cible23.
Ici nous décrivons la synthèse d'un homo-PROTAC conjugué pomalidomide-pomalidomide (composé 8) qui recrute CRBN pour la dégradation de lui-même24. L'E3 ubiquitine ligase CRBN sert à la fois de recruteur et de cible en même temps (figure 3). Pour valider nos données, nous avons également synthétisé un contrôle de liaison négatif (composé 9). Nos données confirment que l'homo-PROTAC nouvellement synthétisé est spécifique à la dégradation du CRBN et n'a que des effets minimes sur d'autres protéines.

<table><tbody><tr><td>1,1'-Carbonyldiimidazole</td><td>TCI produits chimiques</td><td>C0119</td><td></td></tr><tr><td>2,2&prime ;-(éthylènedioxy)-bis(éthylamine)</td><td>Composé 385506 Sigma-Aldrich</td><td>6</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>3-anhydride fluorophtalique, 98 %</td> <td>Alfa Aesar</td><td>A12275</td><td></td></tr><tr><td>4-diméthylaminopyridine, 99 %</td> <td>Acros</td><td>148270250</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamidstamml&ouml ; sung/ Bisacrylamid (30 %/0,8 %)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>Aiolos (D1C1E) mAB</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>15103S</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-CRBN produit chez le lapin</td><td>Sigma</td><td>HPA045910</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-IgG HRP de lapin</td><td>Sigma</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>Roth</td><td>9592.2</td><td></td></tr><tr><td>Boc-Gln-OH</td><td>TCI produits chimiques</td><td>B1649</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Essai de viabilité cellulaire luminescente</td><td>Promega</td><td>G7571</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>DMF, anhydre, 99,8 %</td> <td>Acros</td><td>348435000</td><td>Extra Dry sur tamis moléculaire</td></tr><tr><td>DMSO, anhydre, 99,7 %</td> <td>Acros</td><td>348445000</td><td>Extra Dry sur Tamis Moléculaire</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15523-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris (HRP conjugué)</td><td>Santa Cruz biotechnologie</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protéase & Inhibiteur de la phosphatase Cocktail à usage unique (100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>Ikaros (D6N9Y) Signalisation cellulaire Mab</td><td></td><td>14859S</td><td></td></tr><tr><td>ImmobilonP Membrane de transfert (0,45&micro ; m)</td><td>Merck</td><td>IPVH000010</td><td></td></tr><tr><td>Iodomethane, 99 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8507</td><td>Méthanol hautement toxique</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32213-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Mg132</td><td>Selleckchem</td><td>S2619</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cellule de transfert électrophorétique</td><td>Bio-Rad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cellule</td> <td>d’électrophorèse verticaleBio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>MLN4942</td><td>biomol (caïman)</td><td>Cay15217-1</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal anti-&alpha ;-tubuline produit chez la souris (B512)</td><td>Sigma</td><td>T5168</td><td></td></tr><tr><td>N-Ethyldiisopropylamine, 99 %</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11801</td><td></td></tr><tr><td>Lait écrémé en poudre</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0830,0500</td><td></td></tr><tr><td>Nunc F96 MicroWell Blanc Plaque de polystyrène</td><td>Thermo Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’échantillon NuPAGE LDS (4X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Kit de dosage des protéines</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pomalidomide</td><td>Selleckchem</td><td>S1567</td><td></td></tr><tr><td>RestoreTM Tampon de décapage Western Blot</td><td>Thermo Scientific</td><td>46430</td><td></td></tr><tr><td>sodium dodécylsulfate</td> Carl <td>Roth</td><td>183.1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539-500g</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>tert-butyle N-[2-[2-(2-(2-aminoéthoxy)éthoxy]éthyl]carbamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89761</td><td>Composé 5</td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Carl Roth</td><td>6977.4</td><td></td></tr><tr><td>Base Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-500ml</td><td></td></tr><tr><td>WesternBright ECL spray</td><td>Advansta</td><td>K-12049-D50</td><td></td></tr></tbody></table>

inactivation chimique de l'e3 ubiquitin ligase cereblon par des homo-protac à base de pomalidomide

Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs

Les médicaments immunomodulatoires (IMiDs) thalidomide et ses analogues, lénalidomide et pomalidomide, tous les médicaments approuvés par la FDA pour le traitement du myélome multiple, induire l'ubiquitination et la dégradation des facteurs de transcription lymphoïde Ikaros (IKZF1) et Aiolos (IKZF3) via le cereblon (CRBN) E3 ubiquitin ligase pour la dégradation protéasomal. IMiDs ont récemment été utilisés pour la génération de chiolyse bifonctionnelle ciblant les chimères (PROTACs) pour cibler d'autres protéines pour l'ubiquitination et la dégradation protéasomal par la ligase CRBN E3. Nous avons conçu et synthétisé des PROTAC homobifonctionnels à base de pomalidomide et analysé leur capacité à induire l'ubiquitination autodirigée et la dégradation de CRBN. Ici, CRBN sert à la fois, la ligase d'ubiquitine E3 et la cible en même temps. Le composé homo-PROTAC 8 dégrade CRBN avec une puissance élevée avec seulement des effets restants minimes sur IKZF1 et IKZF3. L'inactivation de CRBN par le composé 8 n'a eu aucun effet sur la viabilité et la prolifération de cellules multiples différentes. Cet homo-PROTAC abroge les effets des IMiD dans plusieurs cellules de myélome. Par conséquent, nos composés homodimériuns à base de pomalidomide peuvent aider à identifier les substrats endogènes et les fonctions physiologiques de CRBN et à étudier le mécanisme moléculaire des MiD.

Ici nous avons décrit la conception, la synthèse et l'évaluation biologique d'un PROTAC à base de pomalidomide homodimérique pour la dégradation de CRBN. Notre PROTAC interagit simultanément avec deux molécules CRBN et forme des complexes ternaires qui induit l'auto-ubiquitination et la dégradation protéasomal de CRBN avec seulement des effets restants minimes sur les néo-substrats induits par le pomalidomide IKZF1 ou IKZF3.
Sur...

Ce travail décrit la synthèse et la caractérisation d'un homo-PROTAC bifonctionnel à base de pomalidomide comme une nouvelle approche pour induire l'ubiquitination et la dégradation du cereblon de ligase d'ubiquitine E3 (CRBN), la cible des analogues de la thalidomide.

Inactivation chimique de l'E3 Ubiquitin Ligase Cereblon par des Homo-PROTAC à base de Pomalidomide

The immunomodulatory drugs (IMiDs) thalidomide and its analogs, lenalidomide and pomalidomide, all FDA approved drugs for the treatment of multiple ...

Nos PROTACs homodimeric sont les premiers inhibiteurs chimiques de Cereblon et peuvent aider à élucider davantage le mécanisme moléculaire des analogues de thalidomide, aussi bien qu’à étudier la fonction physiologique de Cereblon. Cette nouvelle technologie de plate-forme PROTAC peut être très utile pour cibler spécifiquement les protéines d’intérêt qui sont par ailleurs considérées comme irréparables. L’inhibition de CRBN seule n’a aucune activité anti-tumorale.Cependant, les dégradants de CRBN peuvent avoir des implications cliniques dans l’obésité, les maladies infectieuses, et d’autres désordres. La synthèse est difficile et il est difficile de trouver des liens optimaux et l’attachement pour générer des dégradants de protéines efficaces lors de la conception d’un composé PROTAC. Pour commencer, placez 2,46 grammes de L-glutamine protégée par Boc et 50 millilitres de tétrahydrofuran dans un flacon à fond rond de 100 millilitres, et remuez à 800 rpm pendant une minute.Ensuite, ajouter 1,95 grammes de 1, 1'carbonyldiimidazole et une quantité catalytique de 4-pyridine. Continuer à remuer pendant 10 heures au reflux pour obtenir une solution incolore claire de composé glutarimide. Laissez refroidir la solution à température ambiante et retirez le solvant à l’évaporateur rotatif.Redissolvez les résidus en 200 millilitres d’acétate d’éthylique et versez-les dans un entonnoir séparateur. Laver la couche organique avec 50 millilitres chacun d’eau déionisée et de saumure, et sécher la couche organique sur le sulfate de sodium. Gravité filtrer la solution à travers le gel de silice pour enlever le desiccant, puis rincer le gel de silice avec 200 millilitres d’acétate d’éthyle.Retirer le solvant du filtrate sous vide pour obtenir le composé 1 comme solide incolore. Séchez le produit sous vide pendant la nuit avant de l’utiliser. Ensuite, dissoudre 0,50 grammes d’acétate de sodium dans 20 millilitres d’acide acétique glaciaire dans un flacon à fond rond de 100 millilitres équipé d’une barre de remue-glace.Ajouter 1,25 grammes d’anhydride 3 fluorophtaliques et 1,14 grammes de glutarimide et remuer au reflux pendant six heures pour obtenir une solution violette du composé 3. Laisser refroidir le mélange à température ambiante, puis le verser dans 100 millilitres d’eau déionisée et remuer pendant 10 minutes pour précipiter le composé 3. Recueillir le solide par filtration, le laver avec de l’eau et de l’éther de pétrole, et le sécher sous vide pendant deux jours.Ensuite, placez 0,83 gramme de composé trois et 20 millilitres de sulfure de diméthyle sec dans un flacon Schlenk de 50 millilitres et remuer pendant deux minutes. Ajouter 0,22 gramme d’alpha omega diamine linker Compound 6, et 1,05 millilitres de N, N-diisopropyléthylamine et remuer le mélange sous argon à 90 degrés Celsius pendant 18 heures pour obtenir Homodimer 8 dans un mélange vert foncé. Laisser refroidir le mélange à température ambiante et le verser dans 100 millilitres d’eau déionisée.Extraire le produit en trois portions de 50 millilitres d’acétate d’éthyle, combiner les couches organiques et les laver avec 50 millilitres chacun d’eau et de saumure. Séchez la couche organique lavée sur le sulfate de sodium, filtrez le dessiccant et retirez le solvant sous vide. Redéfinir les résidus dans une quantité minimale de solvant chromatographie et appliquer sur une colonne de gel de silice pour la purification.Recueillir les fractions du produit fluorescent, les combiner, et enlever le solvant pour obtenir Homodimer 8 comme un solide jaune. Pour commencer, dissoudre 2,28 grammes de Glutarimide 1 dans 25 millilitres de diméthylformamide dans un flacon rond-fond de 100 millilitres. Suspendre 2,76 grammes de carbonate de potassium moulu dans cette solution.Puis, dessinez 0,62 millilitres d’iodométhane dans une seringue équipée d’une aiguille de calibre 20. Ajouter l’iodomethane drop-wise au cours de 10 secondes. Arrêter le flacon à l’aide d’un septum en caoutchouc et ajouter une aiguille d’évent.Sonicate le mélange pendant deux heures à température ambiante pour obtenir glutarimide composé 2. Diluer le mélange avec 50 millilitres d’acétate d’éthyle et le verser dans un entonnoir séparateur. Rincer le flacon dans l’entonnoir avec encore 50 millilitres d’acétate d’éthyle.Travaillez le produit et purifiez-le avec la chromatographie de colonne de gel de silice pour obtenir le Glutarimide 2 comme un solide incolore. Comparez les temps de rétention des composés glutarimides 1 et 2 pour confirmer que la méthylation N a été un succès. Pour commencer la validation, traiter les cellules myélomateuses multiples avec les composés d’intérêt.Isoler les protéines pertinentes et préparer des échantillons pour une analyse occidentale de la dégradation des protéines. Ensuite, préparez un sandwich au gel pour SDS-PAGE et remplissez le réservoir tampon d’anodes avec une solution tris-HCl pH 8.9. Chargez les échantillons de protéines dans le gel et exécutez-le à 70 Volts pendant 20 minutes, suivis de 115 volts pendant 150 minutes.Ensuite, préparez un tampon de transfert 1x pour l’immunoblotting et déplacez soigneusement le gel de sa cassette au tampon de transfert pour l’équilibrer. Vous devez être très prudent lorsque vous retirez le gel de la cassette pour l’équilibrage, car il peut éclater et froisser très rapidement. Plonger une membrane de difluoride polyvinylidene de 0,45 micromètre dans du méthanol pur pendant au moins 20 secondes pour l’activer, puis l’immerger dans un tampon de transfert 1x.Laisser le gel et la membrane s’équilibrer pendant 10 minutes. Ensuite, assemblez la cassette blotting occidentale et appliquez 180 milliamperes pendant 90 minutes pour transférer les protéines à la membrane. Ensuite, visualisez les protéines en immunostaining.Pour évaluer les effets sur la viabilité des cellules, tout d’abord, les graines 50 000 cellules myélomateuses multiples par puits d’une plaque de puits de 96 dans le triplicate biologique. Ajouter à chaque puits 100 microlitres de supports contenant du DMSO, ou un 0,1, un ou 10 micromolaires de composé 8, composé 9 ou pomalidomide. Pour effectuer l’expérience de sauvetage de viabilité cellulaire, traitez plutôt les cellules avec une solution nanomolaire de 100 du composé 8 pendant trois heures, avant ou après l’ajout d’une solution micromolaire de pomalidomide.Incuber les cellules pendant 24, 48 ou 96 heures à 37 degrés Celsius dans une atmosphère de dioxyde de carbone de 5 %, et mesurer la viabilité cellulaire à l’essai luminescent. La structure de PROTAC 8 homodimeric a été confirmée avec proton et carbone NMR. Protac 9 heterodimérique a été synthétisé comme un contrôle négatif, comme N-méthylation dans la partie glutarimide entraîne une perte de Cereblon, ou CRBN, capacité contraignante.L’homo PROTAC 8 induit une dégradation protéosomique presque complète du CRBN avec des effets minimes sur les facteurs de transcription lymphoïde IKZF1 et IKZF3. En revanche, l’hétéro PROTAC 9 a montré un comportement similaire aux pomalidomides. La dégradation du CRBN induite par le composé 8 pourrait être bloquée par un inhibiteur direct du protéasome, ou indirectement bloquée par l’inhibition de la nétylation.Les cellules prétraitées avec le composé 8 ont résisté de manière significative aux effets de la pomalidomide sur IKZF1 et IKZF3. La dégradation induite par le CRBN composée 8 a eu beaucoup moins d’effet sur la viabilité des cellules du myélome multiple après 96 heures que la dégradation IKZF1 et IKZF3 du composé 9 et du pomalidomide. Les cellules multiples de myélome prétraitées avec le composé 8 ont eu sensiblement plus de viabilité une fois exposées à la pomalidomide que les cellules non traitées, suggérant que le composé 8 pourrait être employé pour imiter la résistance immunomodulatoire de drogue d’IMiD.Nous avons constaté que le composé 8 induit la dégradation protéasomale complète du cereblon, n’a aucun effet secondaire sur la viabilité et la prolifération cellulaires d’IKZF1 et d’IKZF3. L’extension de la technologie du projet à d’autres cibles a le potentiel d’inactiver et de suivre les protéines liées au cancer et à d’autres maladies. Lors de l’adaptation de cette technique pour d’autres médicaments et protéines, il faut étudier attentivement les structures moléculaires du médicament et la cible protéique pour choisir les liens optimaux et les attachements.Les IMiD ne fonctionneront pas chez la souris en raison d’une mutation ponctuelle dans Cereblon, mais il existe un modèle transgénique de souris knock-in qui peut être utilisé pour d’autres études sur les animaux. Comme la pomalidomide est une thalidomide analogique, qui est hautement tératogène, nous ne recommandons pas aux femmes enceintes de travailler avec ces médicaments.

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L'activité cytotoxique de l'phénanthridiniques PJ-34 dans les cellules cancéreuses en mitose a été documentée en temps réel par imagerie confocale en direct. 34-PJ cancer du sein humain éradiqué MDA-MB-231 cellules hébergeant des extra-centrosomes dans la mitose. Contrairement à la mitose bifocal normale, les extra-centrosomes sont regroupés dans les deux pôles du fuseau, en présence d'PJ-34.

La mort cellulaire associée à la mitose anormale constatée par imagerie confocale dans des cellules vivantes du cancer

Évaluation de l’activité des produits chimiques environnementaux et médicaments, pour être enzymatiquement bioactivated intermédiaires générant ADN covalent adduits, est un domaine important dans le développement du cancer et son traitement. Méthodes sont décrites pour l’activation composée pour former que des adduits d’ADN, ainsi que des techniques pour leur détection et la quantification.

Formation de l’ADN Covalent adduits cancérogènes enzymatiquement activés et médicaments In Vitro et leur détermination par 32P-post-marquage

Cet article utilise un écoulement cytometry-test aux bibliothèques d’écran d’inhibiteurs chimiques pour l’identification des inhibiteurs et leurs objectifs qui influent sur la signalisation de récepteur de T-cellule. Les méthodes décrites ici peuvent aussi être étendues pour des projections de haut débit.

Identification des médiateurs du récepteur des cellules T signalisation via la projection des bibliothèques inhibiteur chimique

Ce protocole vise à établir des protéomes spécifiques à l'ubiquitine (Ubquitin) et à l'ubiquitine (Ubls) afin d'identifier les altérations de ce type de modifications post-traductionnelles (PTM), associées à une condition spécifique telle qu'un traitement ou un phénotype.

Profilage des modifications post-traductions à l'ubiquitine et à l'ubiquitine et identification des modifications importantes

Ce protocole décrit la détection luminescente quantitative de la cinétique de dégradation des protéines dans les cellules vivantes qui ont été modifiées à l’aide de CRISPR / Cas9 pour exprimer l’étiquette de détection de protéine endogène sans anticorps fusionnée à une protéine cible. Des instructions détaillées pour calculer et obtenir les paramètres de dégradation quantitatifs, le taux, Dmax, DC 50 et Dmax50 sont incluses.

Profilage cellulaire à haut débit de composés de dégradation de protéines ciblés à l’aide de lignées cellulaires HiBiT CRISPR

Ici, nous décrivons un essai biologique utilisant le bromure de 3-(4′,5′-diméthylthiazol-2′-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) pour tester les oximes spirocycliques précédemment synthétisés.

Synthèse hétérocyclique spinocyclique fonctionnalisée et dosage de cytotoxicité

Le présent protocole met en évidence une méthode modifiée pour détecter et quantifier les réticulations ADN-protéines (DPC) et leurs modifications post-traductionnelles (PTM), y compris l’ubiquitylation, la SUMOylation et l’ADP-ribosylation induites par les inhibiteurs de la topoisomérase et par le formaldéhyde, permettant ainsi l’étude de la formation et de la réparation des DPC et de leurs PTM.

Détection quantitative des réticulations ADN-protéines et de leurs modifications post-traductionnelles

Cet article rapporte la construction de cellules knock-out de la protéine E associée au centromère (CENP-E) à l’aide du système CRISPR/Cas9 et de trois stratégies de criblage basées sur le phénotype. Nous avons utilisé la lignée cellulaire knock-out CENP-E pour établir une nouvelle approche visant à valider la spécificité et la toxicité des inhibiteurs de CENP-E, ce qui est utile pour le développement de médicaments et la recherche biologique.

Génération de lignées cellulaires knock-out Protein-E CENP-E-/- associées au centromère à l’aide du système CRISPR/Cas9

Nous décrivons ici des protocoles pour la caractérisation biophysique de la formation de complexes ternaires induite par protéolyse ciblant les chimères (PROTACS) qui impliquent les ubiquitine ligases Von Hippel-Lindau, E3 ligase (VHL) et Cereblon (CRBN).  Les méthodes biophysiques illustrées ici comprennent la résonance plasmonique de surface (SPR), l’interférométrie de biocouche (BLI) et la calorimétrie de titrage isotherme (ITC).

le développement et l’application de tests biophysiques pour l’évaluation de la formation de complexes ternaires induite par la protéolyse ciblant les chimères (PROTACS)

Nous décrivons les détails expérimentaux de la synthèse de particules motifs et reconfigurables à partir de deux dimensions (2D) des précurseurs. Cette méthodologie peut être utilisée pour créer des particules dans une variété de formes, y compris les polyèdres et les dispositifs de préhension à des échelles de longueur allant de la micro à l'échelle du centimètre.

Origami Inspired Auto-assemblage de particules à motifs et reconfigurable

Découvrez l'inactivation chimique de Cereblon par des homo-PROTAC à base de pomalidomide pour la dégradation protéique ciblée. Cette méthode innovante permet d'étudier les mécanismes moléculaires des analogues de thalidomide.

Inactivation chimique de l'E3 Ubiquitin Ligase Cereblon par des Homo-PROTAC à base de Pomalidomide

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