Imagerie à haute résolution de la dynamique nucléaire dans les cellules vivantes sous contrainte de traction uniaxiale

Nous avons déjà conçu un dispositif pour appliquer une souche mécanique aux cellules adhérentes. Dans les travaux actuels, nous avons repensé la géométrie du substrat et personnalisé la configuration de l’imagerie haute résolution de ces cellules souches. Le principal avantage de ce système d’étirement cellulaire est qu’il fournit une imagerie subcellulaire à haute résolution à 100x des cellules souches.

Vicki, assistante de recherche de mon laboratoire, démontrera la fabrication du substrat. Commencez par concevoir un moule en polydiméthane très bien en suivant le protocole texte qui l’accompagne. Ensuite, mélangez 20 parties d’une base en polydiméthylsiloxane avec un agent de séchage de pièce dans une tasse jetable.

Une fois mélangé, placer le mélange de polydimethylsiloxane dans un vide de-gasser à 0,8 bar pendant 30 minutes pour enlever les bulles du mélange. Verser ensuite le mélange de poly diméthylsiloxane dans le moule et le plat. Enlevez les bulles supplémentaires à ce stade en la dé-gazant à nouveau à vide de 0,8 bar pendant 30 minutes.

Lorsque le dé-gazage est terminé, cuire les échantillons à 80 degrés Celsius sur une table de nivellement pendant deux heures. Ensuite, retirez soigneusement les échantillons du four et laissez-les refroidir à température ambiante. Couper les bords à l’arme d’une lame et éplucher délicatement le polydiméthane séché.

Sur le polydimethylsiloxane de 150 millimètres de diamètre, dessiner une grille de deux centimètres par deux centimètres avec un marqueur. Dans chaque carré, dessiner un centimètre par un centimètre carré, laissant une marge de 0,5 centimètres de tous les côtés. Utilisez une lame pour couper soigneusement le long des lignes et obtenir des compartiments carrés.

Ensuite, nettoyez les échantillons en les incubant à 100% d’acétone pendant quatre heures, 100% éthanol pendant quatre heures supplémentaires, puis dans de l’eau autoclavée pendant quatre heures. Placez les échantillons nettoyés sur du papier sulfurisé à l’intérieur d’un plat en plastique de 150 millimètres de diamètre et séchez l’échantillon dans un four de 80 degrés Celsius pendant quatre heures. Une fois terminé, sceller les plats avec du film de paraffine et les conserver dans une chambre froide jusqu’à nouvel usage.

Préparer les cellules progénitrices et les suspendre dans un milieu de prolifération. Ensemencer ces cellules à une densité de 35 000 cellules par centimètre carré sur des surfaces en plastique recouvertes de PDL. Ajuster le volume du milieu de prolifération à trois millilitres par dix centimètres carrés de surface.

Un volume plus faible de médias peut entraîner l’agglutination des cellules, résultant des forces de tension de surface, tandis qu’un volume plus élevé de médias dans les plats peut provoquer un débordement des médias. Le troisième jour après l’ensemencement, récoltez les cellules et comptez-les à l’aide d’un hémomètre. Puis, graine 35 000 cellules par plaque de polydiméthane et 700 microlitres de milieu de prolifération.

Ensuite, ajoutez une construction plasmique à l’étiquetage des complexes histone H2B de la cellule avec des protéines fluorescentes vertes en suivant les instructions du fabricant. Après 24 heures, monter les échantillons de polydiméthaneiloxane avec des cellules à étirer sur le dispositif de contrainte uniaxiale. Ensuite, changez le milieu dans tous les échantillons en milieu de différenciation.

Mesurez la longueur non tendue du compartiment cellulaire et tournez la vis du micromètre de scène pour augmenter la longueur du compartiment cellulaire par la quantité de contrainte désirée. Laissez les échantillons de poly diméthylsiloxane étirés et non tendus dans l’incubateur à 37 degrés Celsius jusqu’à l’imagerie. Préparez l’incubateur au microscope pour l’imagerie vivante en fixant la température de l’incubateur à 37 degrés Celsius.

Ensuite, apportez un objectif d’immersion d’huile 100x à la position centrale, car le turnit objectif ne sera pas accessible plus tard. Une fois en position, dévissez l’objectif et vissez-le de nouveau avec un anneau objectif, de sorte que l’objectif peut être rapproché des cellules. Ensuite, ajouter une goutte d’huile à l’objectif.

À l’aide d’un support imprimé sur mesure, enduire le support de graisse sous vide à la périphérie de la fenêtre et placer un couvercle en verre d’épaisseur zéro sur la surface supérieure du support. Collez la fenêtre en plastique sur l’étape du microscope. Ensuite, vissez une étape de traduction Z sur l’étape du microscope et déplacez-la vers la position Z la plus élevée.

Retirez 500 microlitres du milieu de la plaque de polydiméthane étirée pour être photographié, et ajoutez ce milieu sur le couvercle en verre dans la fenêtre en plastique blanc. Ensuite, utilisez une paire de pinces stériles pour détacher soigneusement le compartiment carré de la plaque de polydimethylsiloxane. Maintenez le dispositif de contrainte dans une position verticale de sorte que les cellules soient orientées vers le haut, au-dessus de la fenêtre en plastique blanc et inversent soigneusement le dispositif de contrainte, de sorte que laisser n’importe quel milieu supplémentaire tomber directement au milieu du coverslip en verre avec les cellules faisant face vers le bas.

Placez la partie inférieure de l’appareil de contrainte sur l’étape de traduction Z à l’aide de ruban adhésif à double face pour le maintenir en place. Tout en regardant à travers l’oculaire sous le champ lumineux, très lentement apporter le dispositif de contrainte vers le bas et déplacer l’objectif vers le haut pour se concentrer sur les cellules. Effectuez cette étape de focalisation lentement, en alternant entre l’abaissement de l’étape de traduction Z et l’élévation de l’objectif.

Si l’étape de traduction Z s’abaisse trop, les cellules pourraient se comprimer et donc mourir. Si nous élevons l’objectif trop haut, il pourrait briser le couvercle en verre et provoquer une fuite du milieu. Scannez la plaque de polydiméthane dans les directions X et Y pour trouver une cellule qui a un noyau fluorescent, en utilisant l’épiflorescence à 488 nanomètres excitation.

Assurez-vous également que la cellule a une morphologie appropriée lorsque vous regardez l’échantillon sous un champ lumineux. Enregistrez des images à champ large ou à sténopé ouvert du noyau avec 488 nanomètres d’excitation de longueur d’onde et de la cellule avec excitation de champ lumineux à intervalles de 30 secondes par image pour une durée totale d’au moins 30 minutes. La géométrie redessinée du substrat de polydimethylsiloxane et la configuration d’imagerie montrée dans cette vidéo minimisent la distance entre les cellules et l’objectif.

Cela permet l’imagerie en accéléré des noyaux cellulaires étiquetés fluorescents à l’aide d’un objectif d’immersion d’huile 100x. Pour mesurer les fluctuations nucléaires, tracez d’abord la zone nucléaire par rapport au temps. Ensuite, détendez les données à l’aide d’un polynomial de troisième ordre.

Enfin, tracez les fluctuations résiduelles et calculez l’écart type des fluctuations résiduelles. Les fluctuations nucléaires des cellules progénitrices d’oligodendrocyte, suivant l’induction chimique de la différenciation avec et sans souche de 10%tensile, montrent qu’avec l’induction chimique seule, l’amplitude des fluctuations nucléaires a montré une diminution significative à 48 heures, mais pas à 24 heures. D’autre part, l’induction chimique avec une souche 10%tensile a montré une diminution significative à 24 heures, qui est restée constante sans autre réduction à 48 heures.

La chose la plus importante à retenir est que la distance de travail de l’objectif choisi doit être égale ou supérieure à la profondeur du compartiment cellulaire plus l’épaisseur du coverslip. Le substrat peut être repensé pour intégrer une grille, ce qui faciliterait l’imagerie de la même cellule avant et après l’application de la souche, car un type avant et après de l’ensemble de données réduit le bruit provenant d’une erreur expérimentale. À l’aide de cette configuration d’imagerie, de nombreux phénomènes subcellulaires dans les cellules vivantes adhérentes, tels que la localisation des protéines ou la dynamique des composants cellulaires, peuvent être photographiés en quelques secondes après l’application de la souche mécanique.