Name: Combinaison de l’analyse SDS-PAGE non réductrice et de la réticulation chimique pour détecter les complexes multimères stabilisés par des liaisons disulfures dans les cellules de mammifères dans la culture (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Découvrez une méthode rapide et économique pour analyser les complexes protéiques multimères stabilisés par des liaisons disulfures dans les cellules U-2 OS. Cette technique combine SDS-PAGE non réductrice et réticulation chimique.

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Nous apprécions avec gratitude les efforts déployés par le Dr Jennifer Fischer pour la purification de l’anticorps polyclonaux dUTPase et Kerri Ciccaglione pour tous ses efforts pour aider à éditer ce manuscrit. Cette recherche a été partiellement appuyée par une subvention de la New Jersey Health Foundation (Grant #PC 11-18).

1. blocage des résidus de cystéine libres à l’aide d’iodoacétamide
<ol><li>Cultiver des cellules OS U-2 dans un plat de 6 cm2 à 50% – 60% de Confluences dans un milieu essentiel minimum avec un taux élevé de glucose contenant 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pyruvate de sodium à 37 ° c dans 5% co2.</li>
	<li>Faire un nouveau stock de 10 mM d’iodoacétamide juste avant l’utilisation, puis jeter tout réactif inutilisé.</li>
	<li>Ajouter l’iodoacétamide de concentration finale de 0,1 mM directement dans les milieux de culture cellulaire. Faire basculer doucement le plat à température ambiante pendant 2 min.</li>
</ol>2. récolter les cellules
<ol><li>Aspirer les médias des cellules.</li>
	<li>Laver les cellules avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate froid (PBS) trois fois. Aspirer la solution finale de lavage de PBS puis ajouter 1 mL de PBS froid.</li>
	<li>Grattez les cellules du fond du plat à l’aide d’un grattoir cellulaire. À l’aide d’une pipette de 1 mL, prélever le PBS et la suspension cellulaire et distribuer tout le liquide dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.</li>
	<li>Tourner les cellules à 7 500 x g pendant 3 min à 4 ° c. Aspirer le PBS, laissant le culot de la cellule derrière. Le culot de la cellule peut être stocké à-80 ° c jusqu’à</li>
</ol>3. extraction de protéines
<ol><li>Préparer 100 μL de tampon de lyse dilué dans le FD2O (voir tableau des matériaux). Ajouter le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) immédiatement avant utilisation à une concentration finale de 1 mM.</li>
	<li>Ajouter 50 μL du tampon de lyse 1x directement sur le culot de la cellule et suspendre. Incuber ce sur la glace pendant 5 min.</li>
	<li>Sonicate pour 8 s en utilisant le mode d’impulsion constante à 40% (voir tableau des matériaux pour Sonicator; ajuster si nécessaire pour différents sonicateurs), en gardant l’extrait sur la glace.</li>
	<li>Faire tourner l’extrait à 4 ° c pendant 5 min à 16 000 x g. Le surnageant est la fraction protéique soluble. L’analyse de Bradford peut être effectuée pour déterminer la concentration de protéines si désiré.</li>
</ol>4. préparation de l’échantillon
<ol><li>Prélever 10 μL d’extrait de protéine soluble et ajouter 10 μL de tampon de SDS-échantillon de Laemmli 1x (4% de SDS, 20% de glycérol, 0,004% de bleu de bromophénol et 0,125 M de Tris-HCl, pH 6,8). Ne pas ajouter de réactifs réducteurs.</li>
	<li>Conservez les échantillons sur la glace si l’analyse de la SDS PAGE sera effectuée ce jour-là; pour le stockage à long terme,-20 ° c est approprié. Juste avant d’exécuter le gel, chauffer l’échantillon pendant 5 min à 85 ° c.</li>
</ol>5. in vivo formaldéhyde réticulation des protéines endogènes dans les cellules U-2 OS
<ol><li>Cultivez des cellules OS U-2 dans un flacon de 175 cm2 à 70% – 80% de Confluences (voir rubrique 1).</li>
	<li>
Effectuer la réaction de réticulation du formaldéhyde
	<ol>
<li>Dans une hotte, aliquote une solution de formaldéhyde à 37% achetée à partir de sources commerciales. Ajouter le fixatif de formaldéhyde directement au milieu à une concentration finale de 1% et incuber à température ambiante avec une agitation douce pendant 15 min.</li>
		<li>Pour étancher la réaction, ajouter 1,25 M glycine à une concentration finale de 0,125 M et incuber à température ambiante avec une agitation douce sur un rocker pendant 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laver les cellules avec 5 mL de PBS froid trois fois. Aspirer la solution finale de lavage de PBS et ajouter 10 mL de PBS. Gratter les cellules du fond de la fiole à l’aide d’un grattoir cellulaire.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette de 10 mL, prélever le PBS et la suspension cellulaire et distribuer tout le liquide dans un tube de centrifugation conique de 15 mL. Faire tourner les cellules à 500 x g pendant 2 min à 4 ° c. Aspirer le PBS, laissant le culot de la cellule derrière.</li>
</ol>6. fractionnement des noyaux
<ol><li>Préparer 10 mL de tampon d’homogénéisation: 0,25 M de saccharose, 1 mM d’EDTA, 10 mM d’HEPES et 0,5% de BSA à pH 7,4. Ajouter le PMSF immédiatement avant utilisation à une concentration finale de 1 mM et 3mL de tampon de suspension de noyaux (0,1% de Triton X-100 dans le PBS).</li>
	<li>Ajouter 5 mL de tampon d’homogénéisation directement sur le culot de la cellule et suspendre complètement. Centrifuger la suspension à 500 x g pendant 2 min à 4 ° c puis jeter le surnageant.</li>
	<li>Suspendre le culot dans 5 mL de tampon d’homogénéisation. Utiliser un homogénéisateur de verre-Teflon serré, dounce homogénéiser les cellules à 10 coups/500 RPM.</li>
	<li>Centrifuger la suspension à 1 500 x g pendant 10 min à 4 ° c, puis jeter le surnageant. Remarque: Utiliser le surnageant pour isoler les mitochondrias en centrifugeant à 10 000 x g pendant 10 min.</li>
	<li>Suspendre le culot dans un tampon de suspension de noyaux de 1 mL et incuber sur la glace pendant 10 min.</li>
	<li>Centrifuger à 600 x g pendant 10 min. jeter le surnageant.</li>
	<li>Suspendre le culot dans 1 mL de tampon de suspension de noyaux et centrifuger à nouveau. Jetez le surnageant. Le culot final sera des noyaux isolés.</li>
</ol>7. extraction de protéines
<ol><li>Répéter la section 4, sauf en ajoutant 25 μL du tampon de lyse 1x directement au culot de la cellule puis en suspendant.</li>
</ol>8. préparation de l’échantillon
<ol><li>Préparer deux échantillons pour la SDS-PAGE en prenant 10 μL chacun de l’extrait de protéine soluble et ajouter 10 μL de 2x tampon de SDS-échantillon de Laemmli et 1 μL de 2-mercaptoéthanol (BME).</li>
	<li>Chauffer un échantillon pendant 5 min à 37 ° c et le deuxième échantillon pendant 15 min à 98 ° c pour inverser la liaison croisée formaldéhyde.</li>
</ol>9. analyse SDS-PAGE
<ol><li>Préparer 1 L de tampon de course de Tris-Glycine 1x (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,1% (p/v) SDS).</li>
	<li>
Configurez l’appareil de fonctionnement SDS-PAGE. Remarque: ce protocole utilise une page SDS TGX de 16% préfabriqué. De note, n’importe quel pourcentage de gel peut être utilisé.<ol>
<li>Par le protocole du fabricant, ouvrez le paquet dans lequel le gel est stocké et retirez la cassette.</li>
		<li>Retirez le peigne qui est en alignant les puits et la bande du bas de la cassette.</li>
		<li>Placez le gel dans l’appareil de roulement.</li>
		<li>Remplissez la chambre avec le tampon de fonctionnement 1x jusqu’à ce que les puits soient immergés dans le liquide. À l’aide d’un pipetage en plastique, rincer les puits avec le tampon de roulement.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Chargez les échantillons sur le gel ainsi que 10 μL de marqueur standard préteinté.</li>
	<li>Faire fonctionner le gel à 200 V jusqu’à ce que le front de teinture soit à environ 1 cm du fond du gel.</li>
</ol>10. Western Blot
<ol><li>Préparer 1 L de tampon de transfert 1x (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% méthanol) et conserver à 4 ° c jusqu’à l’utilisation.</li>
	<li>Retirez délicatement le gel et ouvrez la cassette. À l’aide d’un rasoir, coupez soigneusement et jetez le gel d’empilage. Ramasser le gel en utilisant un coin et le placer dans un plateau avec tampon de transfert, ce qui lui permet de roche doucement pendant 5 min.</li>
	<li>Pendant que le gel bascule, placez un bloc de glace (stocké dans-20 ° c) dans le réservoir de transfert et ajoutez le tampon de transfert à 3/4 plein.</li>
	<li>Mouiller la membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) en la trempant dans 100% de méthanol pendant 30 s.</li>
	<li>Une fois que les 5 min ont passé, préparez-vous à mettre en place le transfert dans un plateau avec tampon de transfert. Le tampon de transfert doit être suffisant pour submerger complètement la tache. Réglez le transfert de la tache comme suit: en bas, le fond du support de cassette (noir); puis une éponge épaisse, du papier buvard extra épais, du gel de polyacrylamide, une membrane PVDF, du papier buvard extra épais et une éponge épaisse; puis enfin le haut du support de cassette (blanc) en haut.</li>
	<li>Verrouiller la cassette et placer l’appareil dans le réservoir de transfert avec la membrane PVDF vers l’anode positive et le gel vers le négatif. En haut de l’unité avec tampon de transfert jusqu’à ce que votre transfert est complètement submergé.</li>
	<li>Placez l’appareil au-dessus d’une plaque d’agitation. Ajouter une barre de brassage à l’unité et commencer à remuer à 125 tr/min.</li>
	<li>Courir à 100 V pour 60 min.</li>
	<li>Pendant que le transfert est en cours, préparez une solution de 5% de lait en poudre dissous dans la solution saline tamponnée au tris, avec Tween-20, pH 7,5 (TBST).</li>
	<li>Démonter l’unité et enlever la membrane, en notant quel côté était en contact avec le gel; Assurez-vous que ce côté reste dans le tiroir pour les étapes restantes.</li>
	<li>Faire tremper la membrane pendant 2 min dans une solution saline tamponnée (TBS) suivie d’un blocage de la membrane en incubant dans 5 mL de 5% de lait-TBST pendant 30 min à température ambiante.</li>
	<li>Remplacez le lait par une solution fraîche de 4 mL de lait-TBST de 5% et ajoutez l’anticorps primaire à la dilution appropriée (dans ce cas, notre dilution est de 1:2000 pour l’anticorps dUTPase) et incubez pendant la nuit avec un léger balancement à 4 ° c.</li>
	<li>Le jour suivant, retirez la tache du rocker de 4 ° c à une bascule de température ambiante, en rejetant la solution d’anticorps primaire.</li>
	<li>Faire trois lavages rapides avec TBST, en utilisant assez de liquide pour submerger complètement la tache, suivie de 3 lavages, 5 min chacun, bascule lentement.</li>
	<li>Après le dernier lavage, ajouter 5 mL de la solution 5% Milk-TBST et faire basculer la tache pendant 15 min puis la jeter.</li>
	<li>Ajouter l’anticorps secondaire dilué dans 5% de lait-TBST à la concentration désirée. (Dans ce cas, dilution 1:5000 de chèvre anti-lapin dilué dans 5 mL de 5% de lait-TBST solution)</li>
	<li>Incuber à température ambiante, à bascule pendant 1 h, puis jeter la solution.</li>
	<li>Faites trois lavages rapides avec le TBST suivi de 3 lavages, 5 min chacun, bascule lentement, puis jetez le lavage final et ajoutez 5 mL de TBS.</li>
	<li>Préparer un mélange 1:1 de solutions de détection chimiluminescente ECL (1 mL de chaque réactif pour un volume final de 2 mL) et l’ajouter directement à la tache incubant pendant 1 min.</li>
	<li>Retirez la membrane à l’aide de pinces et tamponnez le coin avec une lingette de laboratoire, en éliminant toute solution excédentaire. Placez la membrane dans un enveloppement rétractable et placez le côté protéique dans une cassette à rayons x.</li>
	<li>Exposer la membrane au film radiographique. Le temps d’exposition variera.</li>
</ol>

<ol><li>Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine-based+redox+switches+in+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Cysteine-based redox switches in enzymes.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).</li>
<li>Antelmann, H., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based+redox+switches+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Thiol-based redox switches and gene regulation.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1049-1063 (2011).</li>
<li>Brandes, N., Schmitt, S., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based+redox+switches+in+eukaryotic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Thiol-based redox switches in eukaryotic proteins.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 11 (5), 997-1014 (2009).</li>
<li>Groitl, B., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based+redox+switches%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Thiol-based redox switches.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1844 (8), 1335-1343 (2014).</li>
<li>Stern, B. D., Wilson, M., Jagus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+nonreducing+SDS-PAGE+for+monitoring+renaturation+of+recombinant+protein+synthesis+initiation+factor%2C+eIF-4+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Use of nonreducing SDS-PAGE for monitoring renaturation of recombinant protein synthesis initiation factor, eIF-4 alpha.</a> Protein Expression and Purification. 4 (4), 320-327 (1993).</li>
<li>Gorman, J. J., Wallis, T. P., Pitt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+disulfide+bond+determination+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Protein disulfide bond determination by mass spectrometry.</a> Mass Spectrometry Reviews. 21 (3), 183-216 (2002).</li>
<li>Li, X., Yang, X., Hoang, V., Liu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Protein+Disulfide+Linkages+by+MS+In-Source+Dissociation+Comparing+to+CID+and+ETD+Tandem+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Characterization of Protein Disulfide Linkages by MS In-Source Dissociation Comparing to CID and ETD Tandem MS.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. , (2018).</li>
<li>Kelly, S. M., Price, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+circular+dichroism+in+the+investigation+of+protein+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protein+and+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">The use of circular dichroism in the investigation of protein structure and function.</a> Current Protein and Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).</li>
<li>Klockenbusch, C., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+formaldehyde+cross-linking+for+protein+interaction+analysis+of+non-tagged+integrin+beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 927585(2010).</li>
<li>Gavrilov, A., Razin, S. V., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formaldehyde+cross-linking%3A+it+is+time+for+black+box+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 163-165 (2015).</li>
<li>Rotoli, S. M., Jones, J. L., Caradonna, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine+residues+contribute+to+the+dimerization+and+enzymatic+activity+of+human+nuclear+dUTP+nucleotidohydrolase+%28nDut%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Cysteine residues contribute to the dimerization and enzymatic activity of human nuclear dUTP nucleotidohydrolase (nDut).</a> Protein Science. , (2018).</li>
<li>Caradonna, S., Muller-Weeks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+enzymes+involved+in+uracil-DNA+repair%3A+isoform+characteristics+of+proteins+responsible+for+nuclear+and+mitochondrial+genomic+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protein+and+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">The nature of enzymes involved in uracil-DNA repair: isoform characteristics of proteins responsible for nuclear and mitochondrial genomic integrity.</a> Current Protein and Peptide Science. 2 (4), 335-347 (2001).</li>
<li>Macpherson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noxious+compounds+activate+TRPA1+ion+channels+through+covalent+modification+of+cysteines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Noxious compounds activate TRPA1 ion channels through covalent modification of cysteines.</a> Nature. 445 (7127), 541-545 (2007).</li>
<li>Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts avec le contenu de ce manuscrit.

La méthode décrite ici donne un protocole direct pour l’analyse des complexes multimères stabilisés par des liaisons disulfures. Ce protocole peut facilement être adapté à d’autres lignées de culture cellulaire, des tissus et des organismes permettant une large gamme d’applications.
Une étape importante dans cette procédure est de s’assurer que les liaisons disulfure ne sont pas une conséquence de la procédure d’extraction. Tous les résidus de cystéine libre peuvent être bloqués en utilisant l...

Les liaisons disulfures ont longtemps été connues pour stabiliser la structure de nombreuses protéines. Dans les travaux récents, ce lien a également été classé comme une modification post-translationnelle réversible, agissant comme un "commutateur redox" à base de cystéine permettant la modulation de la fonction de protéine, de l’emplacement et de l’interaction1,2, 3,4. Il est donc important de pouvoir étudier cette modification. Une méthode simple pour analyser ces complexes multimères stabilisés par la cystéine est de ne pas réduire l’analyse SDS-PAGE5. L’analyse SDS-PAGE est une technique utilisée dans de nombreux laboratoires, où les résultats peuvent être obtenus et interprétés rapidement, facilement et avec des coûts minimes, et est avantageux par rapport aux autres techniques utilisées pour identifier les liaisons disulfure telles que la spectrométrie de masse6 ,7 et dichroïsme circulaire8.
Une étape importante pour déterminer si cette méthode est une technique appropriée pour aider dans une étude est d’examiner attentivement la séquence primaire de la protéine d’intérêt pour s’assurer qu’il y a des résidus de cystéine (s) présents. Une autre étape utile est de rechercher toutes les structures cristallines précédentes publiées ou d’utiliser une application de bioinformatique pour explorer la structure tridimensionnelle de la protéine d’intérêt pour visualiser où le résidu de cystéine (s) peut être localisé. Si le ou les résidus sont présents sur la surface extérieure, il peut être préférable de former un lien disulfure plutôt qu’un résidu de cystéine enterré à l’intérieur de la structure. Cependant, il est important de noter que les protéines peuvent subir des changements structurels sur des interactions de substrat ou des interactions protéine-protéine permettant à ces résidus d’être alors exposés à l’environnement aussi bien.
Les complexes multimères identifiés peuvent ensuite être vérifiés avec un réticulation chimique à l’aide de formaldéhyde. Le formaldéhyde est un lien de croisement idéal pour cette technique de vérification en raison de la perméabilité cellulaire élevée et de la courte portée croisée de ~ 2-3 Å, assurant la détection d’interactions protéine-protéine spécifiques9,10. Ici, cette méthode est illustrée par l’analyse de l’isoforme nucléaire de dUTPase de la lignée cellulaire ostéosarcome osseuse humaine U-2 OS11. Cependant, ce protocole peut être adapté pour d’autres lignées cellulaires, tissus et organismes.

<table><tbody><tr><td>16 % préfabriqué TGX</td><td>gels ThermoFisher</td><td>Xp00160</td><td></td></tr><tr><td>175 cm2 Flacon</td><td>Cell star</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>18CO</td><td>ATCC</td><td>CRL-1459</td><td></td></tr><tr><td>6 cm2 parabole</td><td>VWR</td><td>10861-588</td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ECL kit de détection</td><td>GE</td><td></td><td></td>16817200</tr><tr><td>Appareil de transfert de transfert de transfert</td><td>Biorad</td><td>153BR76789</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Réactif protéique Bradford</td><td>Biorad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr>Bleu <td></td><td></td><td></td>de<td>bromophénol</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>99985</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse cellulaire</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>9803</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendor</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Perceuse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M101</td><td></td></tr><tr><td>Appareil d’électrophorèse</td><td>Invitrogen</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Papier western blot extra épais</td><td>ThermoFisher</td><td>88610</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sérum bovin</td><td>Gibco</td><td>1932693</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>ThermoFisher</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateur</td><td></td><td></td><td></td>verre-téflon</tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>65516</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>RPI</td><td>636050</td><td></td></tr><tr><td>Bloc chauffant</td><td>Denville</td><td>10285-D</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0527</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>VWR</td><td>2018010431</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacétamide</td><td>ThermoFisher</td><td>90034</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Pharmco</td><td>339000000</td><td></td></tr><tr><td>Lait écrémé en poudre</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>99995</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Posi-click tube</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Alimentation</td><td>Biorad</td><td>200120</td><td></td></tr><tr><td>Marqueur précoloré</td><td>ThermoFisher</td><td>26619</td><td></td></tr><tr><td>Membrane PVDF</td><td>Biorad</td><td>162-0177</td><td></td></tr><tr><td>Rocker</td><td>Reliable Scientific</td><td>55</td><td></td></tr><tr><td>Saos2</td><td>ATCC</td><td>HTB-85</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Biorad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>70748</td><td></td></tr><tr><td>Grattoir à petites cellules</td><td>Tygon</td><td>S-50HL classe VI</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>RPI</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>450</td><td></td></tr><tr><td>Tampon éponge pour buvard</td><td>Invitrogen</td><td>E19051</td><td></td></tr><tr><td>Plaque d’agitation</td><td>Corning</td><td>PC353</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-1888</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>RPI</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Tris Saline tamponnée, avec Tween 20, pH 7,5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRE0031</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine Tampon courant</td><td>VWR</td><td>J61006</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>U-2 OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>Film radiographique</td><td>ThermoFisher</td><td>34090</td><td></td></tr></tbody></table>

combinaison de l’analyse sds-page non réductrice et de la réticulation chimique pour détecter les complexes multimères stabilisés par des liaisons disulfures dans les cellules de mammifères dans la culture

Combining Non-reducing SDS-PAGE Analysis and Chemical Crosslinking to Detect Multimeric Complexes Stabilized by Disulfide Linkages in Mammalian Cells in Culture

Les structures de nombreuses protéines sont stabilisées par des liaisons disulfures covalentes. Dans les travaux récents, ce lien a également été classé comme une modification post-traductionnelle. Ainsi, il est important de pouvoir étudier cette modification dans les cellules vivantes. Une méthode simple pour analyser ces complexes multimères stabilisés par la cystéine est par une méthode en deux étapes d’analyse SDS-PAGE non réductrice et de réticulation du formaldéhyde. Cette méthode en deux étapes est avantageuse comme première étape pour découvrir les complexes multimères stabilisés par des liaisons disulfures en raison de sa facilité technique et de son faible coût de fonctionnement. Ici, la lignée cellulaire ostéosarcome osseuse humaine U-2 OS est utilisée pour illustrer cette méthode en analysant spécifiquement l’isoforme nucléaire de dUTPase.

La dUTPase nucléaire forme une liaison disulfure intermoléculaire formant une configuration dimère stable grâce à l’interaction de deux résidus de cystéine positionnés au troisième acide aminé de chaque protéine monomère11. Ceci est démontré dans la figure 1a, B. Pour s’assurer que cette liaison disulfure n’était pas une interaction non spécifique en raison d’anomalies de la migration dans l’environnement non réduit, t...

Les liaisons disulfures ont longtemps été connues pour stabiliser la structure de nombreuses protéines. Une méthode simple pour analyser les complexes multimères stabilisés par ces liaisons est une analyse SDS-PAGE non réductrice. Ici, cette méthode est illustrée par l’analyse de l’isoforme nucléaire de dUTPase de la lignée cellulaire ostéosarcome osseuse humaine U-2 OS.

Combinaison de l’analyse SDS-PAGE non réductrice et de la réticulation chimique pour détecter les complexes multimères stabilisés par des liaisons disulfures dans les cellules de mammifères dans la culture

The structures of many proteins are stabilized through covalent disulfide linkages. In recent work, this bond has also been classified as a ...

Il a été bien établi que les structures de nombreuses protéines sont stabilisées dans des liens de disulfure covalents. Dans des travaux récents, ce lien a été classé comme une modification post-translationnelle. Ainsi, il est important d’être en mesure d’identifier les complexes multimères stabilisés à la cystéine dans les cellules vivantes en utilisant une méthode rapide et simple.Le principal avantage de cette technique est que les résultats peuvent être obtenus et interprétés rapidement, facilement et avec un coût minimum. Pour commencer, cultivez des cellules U-2 OS dans un plat de six centimètres carrés en minimum essentiel à haute teneur élevée en glucose, complété par 10% FBS et 1% pyruvate de sodium à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5%. Faire un bouillon frais d’iodoacetamide de 10 millimollar juste avant utilisation.Après que les cellules atteignent 50 à 60% confluency, ajoutez l’iodoacetamide final millimolar de concentration 0.1 millimolar directement au média de culture cellulaire. Faire bercer doucement le plat à température ambiante pendant deux minutes. Ensuite, aspirez les médias des cellules, et lavez les cellules avec cinq millilitres de PBS froid trois fois.Aspirez la solution finale de lavage PBS et ajoutez un millilitre de PBS froid. Racler les cellules du fond du plat à l’aide d’un grattoir cellulaire. À l’aide d’une pipette d’un millilitre, dessinez le PBS et la suspension cellulaire et distribuez tout le liquide dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.Faites tourner les cellules à 7500 fois g en quatre degrés Celsius pendant trois minutes. Aspirez le PBS en laissant la pastille cellulaire derrière. La pastille cellulaire peut être stockée à moins 80 degrés Celsius jusqu’au traitement.Pour extraire la protéine, préparer 100 microlitres d’un tampon de lyse 1X dilué dans de l’eau distillée double. Ajouter le PMSF immédiatement avant l’utilisation à une concentration finale d’un millimlaire. Ajouter ensuite 50 microlitres du tampon de lyse 1X directement à la pastille cellulaire et les suspendre à nouveau.Incuber l’extrait sur la glace pendant cinq minutes. Sonicate pendant huit secondes en utilisant le mode impulsion constante à 40%garder l’extrait sur la glace. Faites tourner l’extrait à 4 degrés Celsius et 16 000 fois g pendant cinq minutes.Effectuez l’analyse de Bradford pour déterminer la concentration de protéines si désiré. Pour préparer l’échantillon, prenez 10 microlitres de l’extrait de protéine soluble et ajoutez 10 microlitres d’un tampon d’échantillon 1X Laemmli SDS. Gardez les échantillons sur la glace.Chauffer l’échantillon à 85 degrés Celsius pendant cinq minutes avant de faire fonctionner le gel. Pour commencer le formaldéhyde de liaison croisée, faire croître les cellules U-2 OS dans un flacon de 175 centimètres carrés à 70 à 80% confluency. Dans une hotte de fumée ajouter le fixatif de formaldéhyde directement au milieu à une concentration finale de 1% et incuber à température ambiante avec une agitation douce pendant 15 minutes.Pour étancher la réaction ajouter 1,25 glycine molaire à une concentration finale de 0,125 molaire et incuber à température ambiante avec une agitation douce sur un rocker pendant cinq minutes. Lavez les cellules avec cinq millilitres de PBS froid trois fois. Aspirez la solution finale de lavage PBS et ajoutez 10 millilitres de PBS.Racler les cellules du fond du flacon à l’aide d’un grattoir cellulaire. À l’aide d’une pipette de 10 millilitres, tracez la suspension PBS et cellulaire et distribuez tout le liquide dans un tube de centrifugeuse conique de 15 millilitres. Faites tourner les cellules à 500 fois g et quatre degrés Celsius pendant deux minutes.Aspirez le PBS en laissant la pastille cellulaire derrière. Préparez 10 millilitres du tampon d’homogénéisation en ajoutant 0,25 saccharose molaire, un millimolaire EDTA, 10 millimolaire HEPES et 0,5%BSA au pH 7,4. Immédiatement avant l’utilisation, ajouter le PMSF à une concentration finale d’un millimolaire et à trois millilitres du tampon de suspension des noyaux.Ajouter cinq millilitres du tampon d’homogénéisation directement à la pastille cellulaire et resuspendre complètement. Centrifuger la suspension à 500 fois g et quatre degrés Celsius pendant deux minutes. Après centrifugation, jetez le supernatant et réutilisez la pastille en cinq millilitres du tampon d’homogénéisation.Ensuite, avec un verre moulant téflon homogénéiseur dounce homogénéiser les cellules à 10 coups par 500 RPM et centrifugeuse de la suspension à 1500 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Après centrifugation jeter le supernatant. Resuspendez la pastille dans un millilitre du tampon de suspension des noyaux et incubez sur la glace pendant 10 minutes.Après l’incubation, centrifugeuse à 600 fois g pendant 10 minutes. Après la centrifugation, jeter le supernatant, resuspendre la pastille dans un millilitre de la suspension des noyaux tampon et centrifugeuse à nouveau. La pastille finale sera les noyaux isolés.Extraire les protéines telles que décrites avant d’ajouter 25 microlitres du tampon de lyse 1X directement à la pastille cellulaire. Ensuite, préparez deux échantillons pour SDS PAGE en prenant 10 microlitres chacun de l’extrait de protéine soluble et ajouter 10 microlitres de 2X Laemmli SDS tampon échantillon et un microlitres de BME. Chauffer un échantillon à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes et le deuxième échantillon à 98 degrés Celsius pendant 15 minutes pour inverser le lien de formaldéhyde.Préparez un litre de tampon de fonctionnement 1X Tris-glycine en mélangeant 25 millimolaires Tris, 192 millimolar glycine et 0,1% poids par volume SD. Configurez ensuite l’appareil d’exécution SDS PAGE. Ouvrez le paquet TGX SDS-PAGE préfabriqué à 16 % selon le protocole du fabricant et retirez la cassette. Retirez le peigne qui tapisse les puits et le ruban du bas de la cassette et placez le gel dans l’appareil en marche.Remplissez la chambre avec le tampon de fonctionnement 1X jusqu’à ce que les puits soient immergés dans le liquide. À l’aide d’une pipette en plastique rincer les puits avec tampon en cours d’exécution. Chargez les échantillons sur le gel avec 10 microlitres du marqueur standard pré-taché.Enfin, faire fonctionner le gel à 200 volts jusqu’à ce que le front de teinture est d’environ un centimètre du fond du gel. Une analyse occidentale de tache des extraits totaux de cellules en l’absence de l’agent réducteur de BME a démontré une formation complexe multimérique dans différentes populations humaines de cellules. Le complexe a disparu avec l’ajout de BME dans les quatre lignées cellulaires examinées, indiquant la présence d’un lien de disulfide.La confirmation monomère du dUTPase dans les cellules humaines au moment de la récolte est une combinaison d’au moins trois des isoformes du dUTPase : l’isoforme mitochondrial, l’isoforme nucléaire, et une version tronquée notée à M24. L’isoforme mitochondrial utilisé comme contrôle n’a pas forgé de lien de disulfide et a migré vers le poids moléculaire prévu pour la protéine monmérique. Le lien de formaldéhyde du dUTPase nucléaire a démontré la formation complexe multimérique.Lorsque le lien croisé a été inversé en incubant l’échantillon à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes, le complexe a été déstabilisé et a pu être visualisé dans son état monomère. L’ajout d’iodoacetamide est une étape importante dans cette procédure pour bloquer les résidus libres de cystéine et pour s’assurer que les liens de disulfide ne sont pas une conséquence de la procédure d’extraction. Il est important de se rappeler de ne pas ajouter d’agent réducteur, comme le BME ou le DDT à vos échantillons SDS-PAGE, car ceux-ci réduiront les liens de disulfide présents dans votre échantillon.

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Combinaison de l’analyse SDS-PAGE non réductrice et de la réticulation chimique pour détecter les complexes multimères stabilisés par des liaisons disulfures dans les cellules de mammifères dans la culture (Vidéo) | JoVE Journal

Combinaison de l’analyse SDS-PAGE non réductrice et de la réticulation chimique pour détecter les complexes multimères stabilisés par des liaisons disulfures dans les cellules de mammifères dans la culture

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