Électrorétinogramme enregistrement chez le poisson zèbre larvaire, à l’aide d’électrode de pointe éponge en forme de cône de roman A

Ce protocole permet de simplifier les mesures des électrorétogrammes ou des ERG chez le poisson zèbre larvaire qui fournit une lecture fonctionnelle importante des modèles de développement visuel et de maladies génétiques. Les extrémités douces d’éponge de l’enregistrement des électrodes utilisées dans ce protocole est facile à fabriquer en utilisant des matériaux économiques et facilement disponibles et évite les dommages potentiels aux yeux larvaire. L’électrode à pointe éponge plus douce peut faciliter les mesures répétées de l’ERG d’un même œil.

Les personnes nouvelles à cette procédure peuvent avoir du mal à travailler sous l’éclairage rouge tamisé qui est utilisé tout au long de la procédure. Mais il est important que l’adaptation sombre soit maintenue. Pour préparer l’électrode d’enregistrement d’éponge en forme de cône, coupez l’extrémité d’une extension de plomb d’électrode de platine et utilisez un scalpel pour enlever 10 millimètres du revêtement extérieur d’isolation de polytetrafluoroethylène de la nouvelle extrémité de l’extension.

Couper un morceau de 40 millimètres d’un fil d’argent de 0,3 millimètre de diamètre et enlacer le fil d’argent avec le fil intérieur exposé pour fixer solidement le fil au plomb de l’électrode. Envelopper l’articulation avec du ruban isolant laissant une longueur d’environ 15 millimètres de fil d’argent exposée. Connectez un autre fil au terminal négatif de la batterie et plongez l’autre extrémité du fil dans la solution saline.

Immergez le fil d’argent exposé dans la solution saline normale et connectez l’autre extrémité au terminal positif d’une source de courant direct de neuf volts. Après 60 secondes, placer le fil sur le tissu absorbant pour sécher. Entre-temps, couper un carré de 20 x 20 millimètres d’éponge en acétate de polyvinyle en forme de cône et saturer l’éponge en une seule fois le tampon de Ringer.

Sous un microscope léger avec une barre d’échelle sur l’oculaire, utilisez une lame de scalpel pour façonner l’apex du cône à un diamètre d’environ 40 micromètres. Séchez à l’air l’éponge en forme de cône sur du papier de soie absorbant jusqu’à ce qu’elle soit solide. Avant d’insérer le fil d’argent dans l’éponge en acétate de polyvinyle en forme de cône solide séché à travers la base du cône, en utilisant du ruban adhésif pour isoler tout excès de métal exposé pour réduire les artefacts photovoltaïques.

Le jour de l’expérience, plongez l’électrode à pointe éponge dans le tampon de Ringer pendant 15 minutes pour saturer complètement l’éponge. Au moins huit heures avant les enregistrements, placez pas plus de 20 larves de poisson zèbre dans un seul tube de 15 millilitres sans couvercle et enveloppés dans du papier d’aluminium dans un incubateur sombre. À la fin de l’incubation, verser le poisson zèbre adapté à l’obscurité dans une boîte de Pétri sous un faible éclairage rouge à partir d’une diode électroluminescente.

Pour préparer la plate-forme éponge, couper un morceau d’éponge en acétate de polyvinyle à peu près égale en épaisseur à la profondeur d’une boîte de Pétri de 35 millimètres de sorte que l’éponge s’adaptera parfaitement dans le plat. Faire une petite coupe verticalement à travers une extrémité de l’éponge pour accueillir le fil d’argent de l’électrode de référence et tremper l’éponge dans le tampon de goldfish Ringer jusqu’à ce que l’éponge soit saturée. Ensuite, placez l’éponge dans une boîte de Pétri propre de 35 millimètres et utilisez une serviette en papier pour absorber le liquide supplémentaire jusqu’à ce qu’aucune solution n’échappe à l’éponge en réponse à une légère pression du doigt.

Pour positionner l’animal pour l’expérience, utilisez une pipette Pasteur de trois millimètres pour transférer une larve anesthésiée sur un carré de trois par trois centimètres de papier absorbant et utilisez des forceps pour placer le carré sur l’éponge humidifié. À l’aide d’une fine brosse trempée dans le tampon de Ringer, ajustez la position de la larve d’un œil orienté vers le haut et loin de tout liquide sur la serviette sous la larve. Glacer le corps larvaire avec du gel hydratant pour les yeux afin de garder l’animal hydraté tout au long de l’enregistrement de l’électrorétogramme.

Et placez le plat sur une petite plate-forme chauffée à l’eau devant le bol Ganzfeld stimulus léger situé à l’intérieur d’une cage faraday. Insérer l’électrode de référence dans la coupe faite dans l’éponge plate-forme. Et connecter une électrode au sol obtenue commercialement à la cage de Faraday.

Attachez l’électrode d’enregistrement à un support d’électrode et fixez le support au bras stéréotaxique d’un micromanipulateur. À l’aide d’une pipette Pasteur de trois millimètres, résaturer l’extrémité éponge de l’électrode avec une goutte de la solution de Ringer et positionner le microscope dans la cage de Faraday au-dessus de la plate-forme d’électrorétogramme. Utilisez la pointe d’un tissu absorbant pour enlever tout excès de liquide de la pointe de l’éponge électrode et sous le microscope, placez l’électrode active de sorte que la pointe de l’éponge touche doucement la surface cornéenne centrale de l’œil de poisson zèbre larvaire.

Déplacez ensuite le bol Ganzfeld vers la plate-forme éponge en prenant soin que la larve est couverte par le bol et fermez la cage pour réduire le bruit électromagnétique extérieur. La sensibilité de la rétine larvaire du poisson zèbre aux éclairs de gradateur augmente avec l’âge. Comme les ondes a et B ne sont pas reconnaissables à des intensités inférieures à moins 1,61 candela de billot seconde par mètre carré à quatre jours après la fécondation, tandis que des signaux clairs sont détectables à ces intensités chez les larves plus âgées.

L’amplitude de b-onde augmente nettement entre quatre et cinq après fertilisation. À sept jours, le signal à 2,48 candela journal seconde par mètre carré est plus élevé par rapport aux jours cinq et six après la fécondation. Les temps implicites des ondes A et B deviennent beaucoup plus rapides après cinq jours après la fécondation.

Dans l’ensemble, ces résultats démontrent une maturation de la fonction rétinienne du poisson zèbre entre quatre et sept jours après la fécondation. Pour réussir ce protocole, il est essentiel que les éponges soient entièrement saturées de liquide, ce qui aide à maintenir la conductivité de l’électrode d’enregistrement et à abaisser les niveaux de bruit. Si l’onde a un intérêt particulier, des traitements pharmacologiques peuvent être appliqués pour bloquer le composant de l’onde B exposant ainsi la pleine onde.