Name: Capture de petites molécules Communication entre les tissus et les cellules à l’aide d’imagerie de la spectrométrie de masse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Découvrez la cartographie des communications par petites molécules entre cellules et tissus par spectrométrie de masse d'imagerie. Cette méthode sans marquage, appliquée au cancer de l'ovaire, révèle de nouvelles cibles thérapeutiques.

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A été financé par le Consortium de recherche biomédicale de Chicago avec l’appui des fonds Searle à The Chicago Community Trust (C-076) (L.M.S.) ; University of Illinois at Chicago démarrage finance (L.M.S.) ; Grant 543296 de l’Alliance de fonds de recherche de Cancer de l’ovaire (M.D.) ; et UG3 ES029073 (J.E.B.) et par le National Center for Advancing translationnelle Sciences, Institut National de la santé, par le biais de subvention UL1TR002003 (JEB & LMS).

Toutes les procédures d’animaux étaient conformes à la National Institutes of Health Guidelines pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et approuvé par le Comité institutionnel Animal Use et soin (IACUC) à l’Université de l’Illinois à Chicago.
1. préparation des réactifs
<ol><li>Maintenir l’épithélium tubaire murin (MOE) cellules à 37° C, avec 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié dans alpha médias milieu essentiel Minimum (αMEM) additionné de sérum de veau fœtal 10 % sélénium (FBS), 2 mM de L-glutamine, 10 mg/mL d’insuline, transferrine, (STI) , 1,8 facteur de croissance épidermique (EGF), ng/mL 100 U/mL de pénicilline-streptomycine, 1 mg/mL de gentamycine et 18,2 ng/mL d’estradiol-17β. Les cellules du col tous les 3-4 jours, assurant que le même jour, il y a suffisamment de cellules les souris seront sacrifiés.</li>
	<li>Préparer 2 % d’agarose en mélangeant 1 g d’agarose low-melting avec 50 mL d’eau distillée. Autoclave l’agarose, laisser refroidir et puis aliquote (1 mL) dans 2 mL tubes (voir Table des matières) avant de l’agarose se solidifie. Agarose peut être stockée indéfiniment à-20 ° C.</li>
	<li>Préparer au moins 2 mL de média de Medium (DMEM) de l’aigle de la modification de 1 x Dulbecco.</li>
	<li>Pour la matrice MALDI-TOF MS, préparer 10 mL de 5 mg/mL d’acide alpha-cyano-4-hyroxycinnamic 1:1 (ACSSD) : acide dihydroxybenzoïque (DHB) (voir la Table des matières) dans les 90/10 ACN:H2O + 0,1 % d’acide trifluoroacétique (TFA). Laisser agir la solution jusqu'à ce que la matrice est dissoute.</li>
</ol>2. la souris colonie et retrait de l’ovaire
<ol><li>Maintenir les couples reproducteurs de souris CD-1 à l’aide de procédures standard de logement. Près le jour de l’accouchement, vérifier les souris tous les jours pour que l’âge des petits est connue.</li>
	<li>Euthanasier les chiots 16 – 18 jours après la naissance de CO2 par inhalation selon les directives des NIH. Livrer de CO2 (100 %) à un débit taux de 10 % – 20 % volume par minute de chambre et continuer pendant deux minutes après que la respiration s’était arrêté. Confirmer l’euthanasie par dislocation cervicale.</li>
	<li>Désinfecter tout le matériel chirurgical en immergeant dans l’éthanol à 70 %. Réchauffer des médias L-15 de Leibovitz avec 1 x pénicilline-streptomycine à 37 ° C.</li>
	<li>Mouiller la surface abdominale avec de l’éthanol 70 % pour désinfecter la zone et pour minimiser la contamination avec des cheveux. Saisissez la peau recouvrant la paroi abdominale utilisant émoussé forceps et l’utilisation des ciseaux chirurgicaux pour faire une grande forme en V coupe à travers la peau et la paroi abdominale, exposant les organes internes.</li>
	<li>Déplacer les organes internes sur le côté avec une pincette. Individuellement, saisir chaque corne utérine avec une pince fine et soulevez légèrement.</li>
	<li>Localiser l’ovaire, qui aura lieu à la fin de la corne utérine, immédiatement en dessous du rein. Utiliser des ciseaux chirurgicaux à disséquer l’ovaire libre du tissu conjonctif. Ensuite, couper la corne ovarienne en deux.</li>
	<li>Déplacer l’ovaire, l’oviducte et environ une moitié de chaque corne utérine aux médias L-15 de Leibovitz préchauffé.</li>
	<li>Sous un microscope à dissection déplacer délicatement chaque ovaire de la bursa environnante, libérant de l’oviducte, bursa et tout le tissu adipeux. Passer chaque ovaire à un nouveau plat des médias L-15 de Leibovitz.</li>
	<li>Couper chaque ovaire en deux axialement. Garder les morceaux ovariennes (maintenant appelés explants) maintenues à 37 ° C jusqu’au bordé d’agarose.</li>
</ol>3. mise en place et en Incubant la diapositive imprégnées d’ITO pour Cocultures
<ol><li>
Indivis cocultures
	<ol>
<li>Liquéfier l’agarose à 70 ° C sur une plaque chauffante.</li>
		<li>Placer le diviseur de 8 puits sur le dessus de la tinoxide d’indium (ITO)-lame traitée (Figure 1 a). Le fond en caoutchouc sur le diviseur du sida dans l’adhésion à la diapositive, mais assurez-vous d’appliquer continue légère pression à la baisse au cours de l’électrodéposition d’agarose pour garantir aucune fuite ou mélange entre puits.</li>
		<li>Prélever des cellules dans un tube conique de 15 mL, centrifugeuse (5 min à 800 tr/min) et remettre en suspension les cellules par 150 µL dans 1 x DMEM médias à 50k. Si une densité cellulaire différente est optimale, veillez à ce que, à cette étape, la suspension cellulaire est 2 x la densité finale souhaitée (par exemple, pour une concentration finale de 50 000 cellules dans 300 µL, densité cellulaire à cette étape est de 50 000 cellules dans 150 µL).</li>
		<li>Avant l’ensemencement de la culture cellulaire, ajouter explant ovarienne au centre du puits (Figure 1 b).</li>
		<li>Ajouter agarose à chaque culture de cellules dans des tubes individuels 2 mL juste avant l’ensemencement. Pour chaque puits, mélanger 200 µL de suspension cellulaire et 200 µL d’agarose liquéfié dans un tube de 2 mL. Par exemple, pour quatre puits, mélanger 800 µL de suspension cellulaire et 800 µL d’agarose à 2 %. Un mélange sera laissé, mais ce qui rend un peu plus nécessaire évite les bulles d’air pendant le pipetage.<ol>
<li>Ajouter agarose aux cultures de cellules individuelles, immédiatement avant cette culture cellulaire de placage. L’agarose va refroidir en moins d’une minute, alors soyez prêt à plaque rapidement.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Immédiatement ajouter 300 µL du mélange cellulaire / d’agarose dans chaque puits (Figure 1). Figure 1 montre les trois conditions de la cellule et l’état d’un média, que chacun plaqué avec et sans un ovaire.</li>
		<li>Incuber à lame à 37 ° C et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cocultures divisées.
	<ol>
<li>Couper des séparateurs de plastique mince et lisse (Figure 2 a). Remarque : Cette expérience utilise les côtés d’un bassin de stériles jetables médias parce qu’ils sont plat et mince. Coupez-les juste assez large pour s’adapter parfaitement à l’hypoténuse du puits (~ 13 mm).</li>
		<li>Liquéfier l’agarose à 70 ° C sur une plaque chauffante.</li>
		<li>Placer le diviseur de 8 puits sur le dessus de la diapositive imprégnées d’ITO (Figure 2 b). Le fond en caoutchouc sur le diviseur du sida dans l’adhésion à la diapositive, mais assurez-vous d’appliquer continue légère pression à la baisse au cours de l’électrodéposition d’agarose pour garantir aucune fuite ou mélange entre puits.</li>
		<li>Prélever des cellules dans un tube conique de 15 mL, centrifugeuse (5 min à 800 tr/min) et remettre en suspension les cellules par 150 µL dans 1 x DMEM médias à 50k. Si une densité cellulaire différente est optimale, assurez-vous que, à cette étape, la suspension cellulaire est 2 x la densité finale souhaitée (par exemple pour une concentration finale de 50 000 cellules dans 300 µL, densité cellulaire à cette étape est 50 000 cellules dans 150 µL).</li>
		<li>Insérer des intercalaires en plastique en diagonale dans les puits (Figure 2).</li>
		<li>Ajouter agarose à chaque suspension de cellules, un à la fois juste avant l’ensemencement. Pour chaque puits, mélanger 100 µL de suspension cellulaire et 100 µL d’agarose liquéfié dans un tube de 2 mL. Par exemple, pour quatre puits, mélanger 400 µL de culture cellulaire et 400 µL d’agarose à 2 %. Un mélange de cellules/agarose restera-t-il mais ce qui rend un peu plus nécessaire évite les bulles d’air pendant le pipetage.<ol>
<li>Ajouter agarose aux cultures de cellules individuelles, immédiatement avant cette culture cellulaire de placage. L’agarose va refroidir en moins d’une minute, alors soyez prêt à plaque rapidement.</li>
		</ol>
</li>
		<li>D’un côté de la cloison, plaque 150 µL du mélange de cellule/gel d’agarose. Permettre d’agarose refroidir et se solidifier (environ un min) et ensuite enlever le séparateur (Figure 2D).</li>
		<li>Placer au centre de la moitié vide du puits ovaire explant. 150 place mélange de médias/agarose µL au-dessus de l’ovaire et seulement dans le bon côté du puits (Figure 2E).</li>
		<li>Incuber à lame à 37 ° C et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. glisser de séchage et préparation de MALDI-TOF MS
<ol><li>Après quatre jours (ou n’importe quel point du temps préféré), enlever la cloison de la chambre des prises d’agarose et du toboggan (Figure 1). Détacher délicatement les côtés de l’agarose de la chambre avec une spatule plate et tirer doucement la chambre vers le haut, en veillant à ne pas déplacer les fiches d’agarose. Si elles ne se déplacent pas, doucement repositionnez-les afin qu’ils ne touchent pas un de l’autre.</li>
	<li>Placez la lame dans un four à 37 ° C pendant environ 4 h, rotation 90° toutes les heures. Remarque : La rotation de la lame est importante pour assurer la distribution de chaleur uniforme dans l’ensemble de l’échantillon.</li>
	<li>Une fois sec, retirez la lame du four (Figure 1E).</li>
	<li>Appliquer la solution de matrice à l’aide du pulvérisateur (Figure 1F), avec les paramètres suivants : température = 30 ° C, débit = 0,2 mL/min, nombre de passes = 8, direction = CC et la distance de buse = 40 mm. Remarque : Au lieu d’un pulvérisateur de matrice, un aérographe artistique peut être utilisé pour appliquer la matrice liquide. La même solution de matrice peut être utilisée pour vaporiser, mais il faut environ deux fois plus de solution. Avec le toboggan serré de sorte qu’il est suspendu verticalement, pulvériser la diapositive sous un angle de 90° d’environ un pied de distance (adapté de Hoffmann15) jusqu'à ce que la matrice de calque est visible.</li>
	<li>Ajouter 1 µL de degré (phosphore rouge pour cibles < 500 Da, un mélange de peptides (voir Table des matières) pour les cibles < 5 000 Da) à la tache claire sur la diapositive. Phosphore rouge ne nécessite aucun mélange avec la matrice, mais le mélange de peptide requiert mélange 1:1 avec la matrice à l’aide d’ionisation. Attendez calibrant à sécher.</li>
	<li>Dessiner un X à l’aide d’un marqueur permanent dans chaque coin de la diapositive et de prendre une image optique à l’aide d’un appareil photo ou un scanner à 1200 dpi.</li>
</ol>5. Acquisition de données de spectrométrie de masse imagerie
<ol><li>Ouvrez une nouvelle séquence sur le logiciel d’analyse de données IMS (voir Table des matières). Définissez la largeur de trame à résolution spatiale désirée, au moins 50 µm.</li>
	<li>Télécharger l’image optique du glissement vers le logiciel d’analyse et trois set enseignent en utilisant les intersections dans le x dans chaque coin.</li>
	<li>Désigner des zones d’intérêt pour l’imagerie dans le logiciel d’acquisition et leur nom en conséquence.</li>
	<li>Calibrer l’instrument en utilisant le logiciel d’acquisition de données (voir la Table des matières) au sein de l’erreur de 5 ppm.</li>
	<li>Enregistrez la méthode optimisée et commencer la course. Cette expérience optimisé les paramètres suivants : polarité = positif, détecteur = Réflectron, taille Laser = 2, puissance Laser = 50 %, réflecteur mode détecteur gain = x 3.</li>
</ol>6. traitement des données IMS
<ol><li>Importer un fichier .mis dans un logiciel de statistique (voir Table des matières) pour l’analyse de l’importance.</li>
</ol>

<ol><li>Paine, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Reproductive+System+Non-Negative+Matrix+Factorization+Mass+Spectrometry+Imaging+of+an+Early-Stage+Ovarian+Cancer+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model.</a> PLoS One. 11 (5), e0154837(2016).</li>
<li>Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+Metabolic+Exchange+with+Imaging+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Translating Metabolic Exchange with Imaging Mass Spectrometry.</a> Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).</li>
<li>Li, H., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Mass+Spectrometry+of+Three-Dimensional+Cell+Culture+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Imaging Mass Spectrometry of Three-Dimensional Cell Culture Systems.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).</li>
<li>Yang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+on+Agar-Based+Microbial+Imaging+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Primer on Agar-Based Microbial Imaging Mass Spectrometry.</a> Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).</li>
<li>Coscia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Proteomic+Profiling+of+Ovarian+Cancer+Cell+Lines+Reveals+Precursor+Cell+Associated+Proteins+and+Functional+Status%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Integrative Proteomic Profiling of Ovarian Cancer Cell Lines Reveals Precursor Cell Associated Proteins and Functional Status.</a> Nature Communications. 7, 12645(2016).</li>
<li>Labidi-Galy, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Grade+Serous+Ovarian+Carcinomas+Originate+in+the+Fallopian+Tube%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High Grade Serous Ovarian Carcinomas Originate in the Fallopian Tube.</a> Nature Communications. 8 (1), (2018).</li>
<li>Klinkebiel, D., Zhang, W., Akers, S. N., Odunsi, K., Karpf, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Methylome+Analyses+Implicate+Fallopian+Tube+Epithelia+as+the+Origin+for+High-Grade+Serous+Ovarian+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">DNA Methylome Analyses Implicate Fallopian Tube Epithelia as the Origin for High-Grade Serous Ovarian Cancer.</a> Molecular Cancer Research. 14 (9), 787-794 (2016).</li>
<li>Falconer, H., Yin, L., Gronberg, H., Altman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+Cancer+Risk+After+Salpingectomy%3A+A+Nationwide+Population-Based+Study%5BTitle%5D)+AND+%22JNCI+Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Ovarian Cancer Risk After Salpingectomy: A Nationwide Population-Based Study.</a> JNCI Journal of the National Cancer Institute. 107 (2), dju410(2015).</li>
<li>Dean, M., Davis, D. A., Burdette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+A+Stimulates+Migration+of+the+Fallopian+Tube+Epithelium%2C+an+Origin+of+High-Grade+Serous+Ovarian+Cancer%2C+through+Non-Canonical+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Activin A Stimulates Migration of the Fallopian Tube Epithelium, an Origin of High-Grade Serous Ovarian Cancer, through Non-Canonical Signaling.</a> Cancer Letters. 391, 114-124 (2017).</li>
<li>King, S. M., Burdette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+Progenitor+Cells+of+Ovarian+Cancer%3A+Analysis+of+Current+Animal+Models%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">Evaluating the Progenitor Cells of Ovarian Cancer: Analysis of Current Animal Models.</a> BMB Reports. 44 (7), 435(2011).</li>
<li>Reznik, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+Metabolic+Variation+across+Tumor+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Landscape of Metabolic Variation across Tumor Types.</a> Cell Systems. 6 (3), 301-313 (2018).</li>
<li>Watkins, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Impact+of+Selective+and+Nonselective+Beta-Blockers+on+Survival+in+Patients+with+Ovarian+Cancer%3A+Beta-Blockers+and+Ovarian+Cancer+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Clinical Impact of Selective and Nonselective Beta-Blockers on Survival in Patients with Ovarian Cancer: Beta-Blockers and Ovarian Cancer Survival.</a> Cancer. 121 (19), 3444-3451 (2015).</li>
<li>Lutgendorf, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-Related+Mediators+Stimulate+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Secretion+by+Two+Ovarian+Cancer+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Stress-Related Mediators Stimulate Vascular Endothelial Growth Factor Secretion by Two Ovarian Cancer Cell Lines.</a> Clinical Cancer Research. 9 (12), 4514-4521 (2003).</li>
<li>Sood, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+Hormone-Mediated+Invasion+of+Ovarian+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Stress Hormone-Mediated Invasion of Ovarian Cancer Cells.</a> Clinical Cancer Research. 12 (2), 369-375 (2006).</li>
<li>Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+Matrix+Deposition+on+Dried+Agar+for+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+of+Microbial+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+The+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Homogeneous Matrix Deposition on Dried Agar for MALDI Imaging Mass Spectrometry of Microbial Cultures.</a> Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).</li>
<li>Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Mass+Spectrometry+Reveals+Crosstalk+between+the+Fallopian+Tube+and+the+Ovary+That+Drives+Primary+Metastasis+of+Ovarian+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging Mass Spectrometry Reveals Crosstalk between the Fallopian Tube and the Ovary That Drives Primary Metastasis of Ovarian Cancer.</a> ACS Central Science. 4 (10), 1360-1370 (2018).</li>
<li>Armaiz-Pena, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Src+Activation+by+%CE%B2-Adrenoreceptors+Is+a+Key+Switch+for+Tumour+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Src Activation by β-Adrenoreceptors Is a Key Switch for Tumour Metastasis.</a> Nature Communications. 4, 1403(2013).</li>
<li>Choi, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTERT+Mediates+Norepinephrine-Induced+Slug+Expression+and+Ovarian+Cancer+Aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">HTERT Mediates Norepinephrine-Induced Slug Expression and Ovarian Cancer Aggressiveness.</a> Oncogene. 34 (26), 3402(2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Il y a un nombre croissant d’une preuve qui implique le rôle de la noradrénaline en HGSOC12,17,18, et cette technique a fourni de l’information plus mécaniste. Au moins huit conditions biologiques présentes sur la même lame, la méthode peut expliquer les contrôles biologiques telles que gène et spécificité cellulaire ainsi que des contrôles de médias dans un seul IMS run. Alors que la méthode a été optimisée pour évaluer échangé...

Imagerie de la spectrométrie de masse (IMS) a été optimisé afin de caractériser la distribution spatiale des caractéristiques moléculaires en trois applications utilisées : tranches de tissus, sphéroïdes et colonies microbiennes1,2,3. Tranches de tissus peuvent servir à évaluer la localisation des métabolites dans le contexte des conditions biologiques dans une foule, ciblées ou non ciblées dans une plage de masse déterminée. Toutefois, les différences entre les caractéristiques moléculaires sont la plus importante et la plus évidente lorsqu’un tissu sain est comparé à une condition de malade, par exemple, une tumeur. Cette approche de l’IMS est particulièrement adaptée à la détection des biomarqueurs de la maladie, cependant, acquisition d’échantillons de tissus à des stades distincts dans la progression de la maladie (par exemple les grades de la tumeur) s’oppose à l’identification des signaux qui pourraient être importantes pour l’initiation de la maladie. L’échange d’informations par le biais de l’espace est un élément omniprésent de nombreux systèmes biologiques, et tranches de tissus ne peuvent pas capturer ce relais dynamique chimique. Une technique qui peut être capable de visualiser la diffusion et l’échange chimique est IMS des colonies microbiennes cultivées sur gélose ; petites molécules peuvent se diffuser à travers et l’agar et peuvent être capturés par l’intermédiaire de spectrométrie de masse (MALDI-TOF) de désorption-ionisation laser assistée par matrice4. Cette configuration de croissance peut être utilisée pour identifier des molécules échangées entre des entités biologiques discrets (colonies) et peut aussi déterminer la directionnalité de la production de métabolites. La plate-forme conçue initialement pour la croissance des colonies microbiennes a été adaptée pour explorer le métabolisme primaire des tissus explants cultivés avec des cellules de mammifères, et IMS a été utilisée pour évaluer l’échange chimique dynamique dans un système in vitro chez les mammifères.
Dans les dernières années, il est devenu clair que le cancer ovarien séreux de haut grade (HGSOC) est souvent originaire de l’épithélium de la trompe de Fallope (ETP) et puis métastase dans l’ovaire au cours de la maladie début développement5,6, 7 , 8. la raison que les ETP tumorigène cellules propagation à l’ovaire, où les grosses tumeurs finissent par forment et métastases plus loin, est actuellement incertaine. Des recherches antérieures a mis l’accent sur le rôle des protéines ovariens à la métastase primaire à l’ovaire ; Toutefois, il a récemment été démontré que la transition entre un milieu sain et un tissu tumorigène entraîne une perturbation massive du métabolisme cellulaire et modifie la production de petites molécules9,10,11. C’est pourquoi, nous avons supposé que les petites molécules échangées entre l’ETP et de l’ovaire peuvent être en partie responsables de la métastase primaire de HGSOC.
En suivant notre procédure IMS nouvellement mis au point, nous avons déterminé que co-culture d’ETP tumorigène et tissu ovarien sain induit la production de noradrénaline par l’ovaire. Toutefois, autres types de cellules ou les cellules normales d’ETP ne pas permis d’obtenir cet effet. Un extraordinaire avantage de cette méthode est que la production moléculaire et l’échange de signaux qui représentent de véritables molécules peuvent être visualisées, ainsi, même dans une co-culture, il est possible de déterminer la source d’un signal. Il s’agit d’un avantage par rapport à l’analyse des échantillons homogénéisés, où toutes les informations spatiales sont perdues. Dans notre système de modèle, nous avons pu clairement affecter la production de noradrénaline à l’ovaire. La noradrénaline a été liée à la chimiorésistance des cancers de l’ovaire et des métastases, et notre détection de cette molécule a validé que la nouvelle méthode IMS peut découvrir des molécules biologiquement pertinente12,13, 14. cette validation nous permet de proposer que cette nouvelle application d’IMS peut être particulièrement utile pour les groupes qui sont efforcent d’identifier des petites molécules dans des environnements de co-culture et pour comprendre les événements précoces qui influent sur la transformation des cellules de recherche et la métastase. L’objectif général de cette méthode est d’élucider l’identité et la distribution spatiale des petites molécules au cours de l’échange entre les tissus et organes, représentées par cultures de cellules 3D de in vitro ou ex vivo des tissus.

<table><tbody><tr><td>15 mL Falcon tubes</td><td>Denville</td><td>C1017-O</td><td>Pour collecter des cellules</td></tr><tr><td>Chambre à 8 puits (chambre Millipore EZ-slide)</td><td>Millipore</td><td>PEZGS0816</td><td>Réutilisé à partir de Millipore Millicell EZ-slide chamber</td></tr><tr><td>slide Acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34998-4L</td><td>Solvant pour matrice pulvérisée</td></tr><tr><td>Alpha Minimum Essential Medium (&alpha ; MEM)</td><td>Fisher</td><td>10-022-CV</td><td>Milieux de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Vitesse Autoflex MALDI-TOF LRF</td><td>Bruker</td><td></td><td>Pour l’analyse des données IMS</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>Pour collecter des cellules et éliminer le surnageant</td></tr><tr><td>CHCA Matrix</td><td>Bruker Daltonic</td><td>8201344</td><td>Matrix pulvérisé sur lame séchée</td></tr><tr><td>DHB Matrix</td><td>Bruker Daltonic</td><td>8201346</td><td>Matrix pulvérisé sur lame séchée</td></tr><tr><td>Scalpels jetables</td><td>Fisher</td><td>22-079-707</td><td>Pour l’ablation des ovaires</td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection</td><td>Fisher</td><td>13-804-6</td><td>Pour l’ablation des ovaires</td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Média mélangé à l’agarose</td></tr><tr>facteur de<td>croissance épidermique</td><td>Peprotech Inc.</td><td>100-15</td><td>Complément de milieux de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Tubes Eppendorf</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-282</td><td>Pour aliquotes d’agarose</td></tr><tr><td>Estradiol-17&beta ;</td><td>Simga-Aldrich</td><td>E2758</td><td>Complément de milieux de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Denville</td><td>fb5001</td><td>Supplément de milieux de culture cellulaire</td></tr><tr><td>FlexControl 3.4</td><td>Bruker Daltonic</td><td></td><td>Logiciel d’acquisition de données IMS</td></tr><tr><td>FlexImaging 4.1</td><td>Bruker Daltonic</td><td></td><td>Logiciel d’analyse de données IMS</td></tr><tr><td>Forceps (fine)</td><td>Fsiher</td><td>22-327379</td><td>Pour l’élimination de la ovaires</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Cellgro</td><td>30-005-CR</td><td>Complément de milieux de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Insuline, Transferrin, Selenium (ITS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11074547001</td><td>Supplément de milieux de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Lame enduite d’ITO</td><td>Bruker</td><td>8237001</td><td>Plateforme pour l’incubation en co-culture</td></tr><tr><td>Leibovitz’s L-15 Medium</td><td>Gibco</td><td>11415064</td><td>Milieu utilisé pendant la production tissulaire dissection</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Complément de milieux de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Agarose à bas point de fusion</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414-10G</td><td>Mélangé avec des milieux pour le placage</td></tr><tr><td>Bassin de milieux</td><td>Corning</td><td>4870</td><td>Utilisé pour découper des séparateurs en plastique pour chambres divisées</td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Supplément</td></tr> <tr><td>de milieux de culture cellulaireÉtalon d’étalonnage peptidique</td><td>Bruker Daltonic</td><td>8206195</td><td>Calibrant pour la gamme de masse moyenne</td></tr><tr><td>Phophorus rouge</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>343-242-5G</td><td>Calibrant pour la plage de faible masse</td></tr><tr><td>SCiLS Lab 2015</td><td>Bruker Daltonic</td><td></td><td>Analyse statistique des données IMS</td></tr><tr><td>Pince chirurgicale (émoussée)</td><td>Fisher</td><td>08-875-8B</td><td>Pour l’ablation des ovaires</td></tr><tr><td>TFA</td><td>Fisher Technologies</td><td>A116-50</td><td>Ajouté à la solution matricielle</td></tr><tr><td>TM Pulvérisateur</td><td>HTX Technologies</td><td></td><td>Pour l’application de la matrice</td></tr></tbody></table>

capture de petites molécules communication entre les tissus et les cellules à l’aide d’imagerie de la spectrométrie de masse

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

Imagerie de spectrométrie de masse (IMS) a été systématiquement appliquée à trois types d’échantillons : coupes tissulaires, sphéroïdes et colonies microbiennes. Ces types d’échantillons ont été analysés à l’aide de spectrométrie de désorption-ionisation laser assistée par matrice time-of-flight masse (MALDI-TOF MS) de visualiser la répartition des protéines, des lipides et métabolites dans l’ensemble de l’échantillon biologique d’intérêt. Nous avons développé une méthode de préparation d’échantillon roman qui combine les forces des trois demandes précédentes pour déterminer une démarche sous-explorée pour identifier la communication chimique dans le cancer, par ensemencement des cultures de cellules de mammifères en gel d’agarose dans coculture avec des tissus sains, suivies par la dessiccation de l’échantillon. Cellules et tissus de mammifères sont cultivées à proximité permettant la communication chimique par diffusion entre les tissus et les cellules. À des moments spécifiques, l’échantillon d’agarose est séché de la même manière que des colonies microbiennes préparé pour l’analyse de l’IMS. Notre méthode a été développée afin de modéliser la communication entre le cancer des ovaires séreuse haut grade dérivé de la trompe de Fallope comme il interagit avec l’ovaire au cours de la métastase. Optimisation de la préparation de l’échantillon a permis l’identification de la noradrénaline comme composante chimique clé dans le microenvironnement ovarienne. Cette méthode nouvellement mis au point peut être appliquée à d’autres systèmes biologiques qui nécessitent une compréhension de la communication chimique entre les cellules adjacentes ou de tissus.

Une diapositive ITO parfaitement sec se traduira par un échantillon desséché plat avec peu ou pas de rides sur la surface du gel d’agarose et morceaux d’agarose qui maintiennent la séparation spatiale sur la lame (Figure 3). Figure 3 a montre un séchage optimal, tandis que la Figure 3 b montre les rides qui sont à proscrire. Cette optimisation nécessite attention comme heures exactes peuvent varier l...

Une nouvelle méthode de préparation de l’échantillon a été développée pour accueillir la co-culture de cellules et de tissus pour détecter l’échange de petites molécules à l’aide de la spectrométrie de masse d’imagerie.

Capture de petites molécules Communication entre les tissus et les cellules à l’aide d’imagerie de la spectrométrie de masse

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Notre protocole peut cartographier la communication chimique des petites molécules entre les cellules et les tissus, et nous l’avons spécifiquement appliqué pour explorer de petites molécules dans la métathèse du cancer de l’ovaire. Le principal avantage de notre technique est la capacité de mesurer les petites molécules d’une manière sans étiquette tout en maintenant l’intégrité spatiale des cellules et des tissus en 2D. Cette technique nous a permis d’interroger la contribution des petites molécules dans les métastases du cancer de l’ovaire d’une manière non ciblée.Cela pourrait dévoiler de nouvelles cibles thérapeutiques et des voies qui ont déjà été négligées. Cette méthodologie pourrait facilement être étendue à d’autres cancers qui peuvent être cultivés dans l’agarose et toute autre maladie dans laquelle un composant spatial pourrait être important pour le phénotype cellulaire résultant. S’assurer que toutes les cellules et composants sont en main et la patience avec le processus de séchage est essentiel à ce protocole.Une étape de dessiccation précipitée peut souvent conduire à des données de spectrométrie de masse de mauvaise qualité. La démonstration visuelle de cette méthode est utile dans la compréhension de nos étapes de préparation et de dessiccation d’échantillon, car ceux-ci s’écartent considérablement des expériences typiques de spectrométrie de masse d’imagerie qui emploient des tissus ou des microbes sur l’agar. Pour commencer, liquéfier l’agarose à 70 degrés Celsius sur une plaque chaude.Placez le séparateur de huit puits sur la glissière traitée par l’OIT. Par le traitement standard de trypsine, recueillez des cellules de MOE dans un tube conique de 15 millilitres, centrifugeuse, et ajoutez une fois le média de DMEM à la résuspendance pour obtenir une concentration de 50.000 cellules par 150 microlitres, qui est deux fois la densité finale désirée. Pour les cocultures indivises, utilisez des forceps pour ajouter l’explantation ovarienne au centre des quatre puits.Juste avant le placage, combiner 200 microlitres de suspension cellulaire et 200 microlitres d’agarose liquéfié dans des tubes individuels de deux millilitres. Évitez les bulles d’air pendant le pipetage. Immédiatement, ajouter 300 microlitres du mélange cellule-agarose à chaque puits, et appliquer une légère pression continue vers le bas sur le séparateur pour s’assurer qu’il n’y a pas de fuite ou de mélange entre les puits.Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air et que l’ovaire reste au centre du puits. Si l’agarose pipetted dérangé l’ovaire, utilisez doucement la pointe pipette pour le centrer avant que l’agarose refroidit. Ensuite, incubez la glissade à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone dans un incubateur humidifié.Pour les cocultures divisées, couper les séparateurs de plastique mince et lisse. Les côtés d’un bassin de médias stérile et jetable sont utilisés. Coupez-les juste assez large pour s’insérer confortablement dans l’hypoténuse du puits.Placez le séparateur de huit puits sur la glissière traitée par l’OIT et insérez les séparateurs en plastique en diagonale dans les puits. Préparez les cultures cellulaires comme cela a été fait précédemment, et combinez 100 microlitres de suspension cellulaire et 100 microlitres d’agarose liquéfié dans un tube de deux millilitres. Immédiatement, plaquez 150 microlitres de mélange cellule-agarose d’un côté du séparateur tout en maintenant la pression vers le bas sur le séparateur.Laisser refroidir et solidifier l’agarose pendant environ une minute, puis retirer le séparateur. Utilisez des forceps pour placer l’explantation d’ovaire au centre de la moitié vide du puits. Ajouter 150 microlitres de mélange cellule-agarose sur le dessus de l’ovaire.Incuber la glissade à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans un incubateur humidifié. Après quatre jours, retirer le séparateur de chambre des bouchons d’agarose. À l’aide d’une spatule plate, détachez les côtés de l’agarose de la chambre et tirez doucement la chambre vers le haut.Si des bouchons d’agarose sont déplacés, repositionnez-les doucement afin qu’ils ne se touchent pas. Placez la glissade dans un four de 37 degrés Celsius pendant environ quatre heures et faites pivoter 90 degrés toutes les heures pour assurer une distribution uniforme de la chaleur tout au long de l’échantillon. La lame doit être complètement séchée.Dans le cas contraire, il peut conduire à une explosion de l’échantillon dans l’environnement à vide élevé du spectromètre de masse MALDI-TOF. Le séchage de la diapositive et la surveillance des progrès sont l’étape la plus critique pour atteindre une haute résolution spatiale et des spectres de masse de qualité. En cas d’écaouillement ou de froissement excessif, nous ne recommandons pas de recueillir les données de spectrométrie de masse.Avec les paramètres définis sur le pulvérisateur matricielle, appliquer la solution matricielle à la diapositive. Pour utiliser phosphore rouge comme étalon, ajouter un microlitre de phosphore rouge à un endroit clair sur la diapositive. Pour utiliser le mélange peptidique comme étalon, mélangez-le avec la matrice sur Parafilm dans un rapport un-à-un pour faciliter l’ionisation, et placez 0,5 pour un microlitre sur la diapositive.Attendez que le calibrant sèche avant d’obtenir des données de spectrométrie de masse. Dessinez un X à l’aide d’un marqueur permanent dans chaque coin de la diapositive, et prenez une image optique à l’aide d’un appareil photo ou d’un scanner à 1200 dpi. Dans cette expérience, une surveillance attentive de la lame dans le four est essentielle pour assurer une glissade ITO séchée optimale, ce qui se traduit par un échantillon plat dessiccated avec un minimum ou pas de rides à travers la surface de l’agarose.Ce chiffre montre les rides qui doivent être évitées. Les rides peuvent légèrement affecter la hauteur et donc la précision de masse des signaux de spectrométrie de masse d’imagerie. De légères rides n’auront pas d’impact sur la qualité des données.Un tissu situé de façon optimale doit être aussi proche du centre que possible. Le tissu utilisé doit être au centre du puits s’il est indivis ou au centre du demi-triangle s’il est divisé de sorte que l’acquisition de données IMS ne soit pas contaminée par des effets de bord. Les tissus mal positionnés, lorsqu’ils sont photographiés, peuvent entraîner de faux signaux de masse provenant des effets de bord.L’image de diapositive séchée est utilisée pour enseigner au spectromètre de masse MALDI-TOF quelles régions à l’image. De petites régions autour du tissu ovarien ont été choisies pour ims à 50 micromètres. Une image représentative d’un signal m-over-z est affichée pour les cocultures indivises, ainsi que pour la configuration de chambre divisée.La chose la plus importante à retenir est que les données qui en résultent ne sont aussi bonnes que la préparation de l’échantillon. Portez une attention particulière au processus de séchage. L’aspect le plus passionnant est la validation des petites molécules découvertes de cette façon à l’aide d’autres expériences, telles que des analyses d’invasion ou des analyses de colonisation, pour informer sur la concentration efficace et traduire en biologie humaine.Nous nous attendons à ce que cela ouvre la porte à la découverte de nouvelles voies de cibles thérapeutiques potentielles pour le cancer de l’ovaire en comprenant mieux les processus de la métathèse primaire du cancer de l’ovaire.

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