Name: Culturing et mesure des os longs de murine fœtal et nouveau-né (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Apprenez la culture ex vivo des os longs de souris fœtale et nouveau-née pour étudier le développement osseux et cartilagineux. Cette technique permet l'imagerie en direct et l'analyse des effets génétiques locaux.

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Nous aimerions remercier Alexandra Joyner pour son soutien lorsque ce protocole a été établi, Edwina McGlinn et Yi-Cheng Chang pour le partage de l’acide rétinoïque. L’Institut australien de médecine régénérative est appuyé par des subventions du gouvernement de l’état de Victoria et du gouvernement australien.

Toutes les expériences doivent être menées suivant les directives locales gouvernementales et institutionnelles de la manipulation éthique des animaux de laboratoire.
1. préparations avant la journée de la culture osseuse
<ol><li>Configurez les accouplements de souris chronométrés pour obtenir des foetus et des chiots du jour embryonnaire 14,5 (E 14.5) et en avant. Remarque: La culture des os longs peut être appliquée avec succès à différentes souches de souris; dans le présent protocole, on utilise des souris de type sauvage Swiss Webster surlignées.</li>
	<li>Préparer le milieu de dissection (adapté de Houston et al.15): diluer le milieu α-minimum essentiel (α-MEM) ou le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (dmem) 1/13 dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et 2 mg/ml de sérum albumine bovine (BSA) et stériliser le filtre par un filtre à seringue de 0,22 μM, 33 mm de diamètre. Stocker les aliquotes à-20 ° c.</li>
	<li>La veille de l’extraction des foetus, préparer le milieu de culture osseuse sans sérum composé de DMEM contenant 0,2% de BSA, 0,5 mM de L-glutamine, 40 U/mL de pénicilline/streptomycine, 0,05 mg/mL d’acide ascorbique et 1 mM de betaglycérophosphate. Filtrer stériliser par un filtre à seringue de 0,22 μM, 33 mm de diamètre et conserver à 4 ° c pendant 1 mois.</li>
	<li>Le jour de la culture et avant l’abattage de la souris, préparez des plaques de 24 puits et des plats de 60 mm avec un milieu de dissection et gardez-les froids. Préchauffer le milieu de culture osseuse dans un bain d’eau 37 ° c. Vaporisez 80% (v/v) d’éthanol sur les outils (pinces et petits ciseaux) à utiliser pour la manutention du fœtus. Transférer une lunette binoculaire vers une armoire de biosécurité de classe II.</li>
</ol>2. culture du fœtus et du nouveau-né tibia et fémur
<ol><li>Cull la souris enceinte à travers la dislocation cervicale au stade gestationnel désiré (allant de E 14.5 à E 18.5). Si les chiots nouveau-nés sont utilisés, les retirer de la mère un par un et l’abattage par décapitation.</li>
	<li>Placez la souris sur son dos et stériliser la région abdominale en pulvérisant 80% (v/v) d’éthanol sur sa surface.</li>
	<li>Coupez la peau et le muscle abdominal avec de petits ciseaux pour accéder aux cornes utérines.</li>
	<li>Extraire l’utérus de la cavité abdominale à l’aide de pinces et de petits ciseaux, en enlevant le mésoomètre et en coupant la base des cornes. Placer l’utérus dans une boîte de Petri de 60 mm avec un milieu de dissection glacé et garder le plat de culture sur la glace pendant toute la procédure.</li>
	<li>Transférer la boîte de Petri avec l’utérus à l’armoire de biosécurité et y travailler à partir de maintenant.</li>
	<li>Séparer les fœtus individuels avec des ciseaux en coupant entre les sacs.</li>
	<li>Transférer le sac individuel sous un stéréomicroscope de dissection dans un plat de 60 mm propre avec un milieu de dissection et les ouvrir avec des pinces pour séparer les foetus des placentas et les nettoyer des membranes. Remarque: Travailler avec un embryon à la fois, tout en gardant le reste sur la glace.</li>
	<li>Décapiter les fœtus et transférer le corps à un nouveau plat 60 mm propre avec une pipette stérile coupée de 1 mL.</li>
	<li>Enlevez la peau des fœtus ou des chiots avec une pince à épiler en commençant par l’arrière et en l’épluchant jusqu’aux orteils.</li>
	<li>Séparer les membres postérieurs du corps en coupant avec la pince à épiler près de la colonne vertébrale et les transférer à un plat propre avec le milieu de dissection de glace froide.</li>
	<li>Séparer le tibia du fémur avec des pincettes en les introduisant avec précaution entre le cartilage de surface du fémur distal et du tibia proximale.</li>
	<li>Enlevez les os de la hanche du fémur proximale et de l’os de calcanéum et du péroné du tibia.</li>
	<li>Enlevez délicatement les tissus mous du fémur et du tibia en les enlevant et en les tirant. Remarque: Il est important d’enlever autant de tissus mous que possible, en prenant un soin particulier en enlevant le tissu qui relie les deux pôles de cartilage, mais en évitant d’endommager le cartilage, le périchondrium, et les os.</li>
	<li>Placer les quatre OS (tibias gauche et droit et fémurs) dans le premier puits de la plaque de 24 puits avec une pipette stérile en plastique de 1 mL. Alternativement, pour comparer l’effet de différents traitements sur les membres gauche et droit, placer des membres contralatéraux dans différents puits. Remarque: Des précautions supplémentaires doivent être prises lorsque les os sont transférés dans les puits, car ils peuvent facilement s’en tenir à la pipette.</li>
	<li>Procédez de la même façon avec autant de fœtus que nécessaire. Remarque: Changez le plat avec le milieu de dissection dès qu’il devient trop obscurci, car il est important de voir clairement les os dissédés.</li>
	<li>
Lorsque tous les os désirés sont transférés dans les puits, retirer le milieu de dissection avec une pipette en plastique de 1 mL stérile et prendre soin de ne pas aspirer les os.
	<ol>
<li>Selon le but de l’expérience, des images peuvent être prises des os avant de retirer le milieu de dissection, comme point de temps zéro de l’expérience. Prendre des photos avec un microscope attaché à un appareil photo numérique et annoter l’exposition et l’échelle utilisée. Pour assurer des mesures simples et fiables, prenez des photos avec un bon contraste pour distinguer la partie minéralisée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter 1 mL de milieu de culture à chaque puits. Si un traitement est prévu sur les os (Doxycycline, tamoxifène, facteurs de croissance, etc.), il doit être ajouté maintenant.</li>
	<li>Pour observer l’effet de l’inhibition de la croissance dans les conditions de culture, traiter le tibias gauche avec de l’acide rétinoïque (RA, 500 nM), tout en incubant le tibias droit avec un volume équivalent de véhicule (diméthyl sulfoxyde [DMSO], concentration finale 0,1%) comme un contrôle.</li>
	<li>Laisser les os croître pendant deux jours ou plus dans un incubateur de culture cellulaire dans des conditions de culture cellulaire standard (à 37 ° c dans un incubateur de 5% CO2 ).</li>
	<li>Pour évaluer la prolifération, ajouter la 5-éthynyl-2 '-désoxyuridine (EdU) ou la 5-bromo-2 '-désoxyuridine (BrdU) au milieu à une concentration finale de 10 μM 1 − 2H avant la fixation. Remarque: La concentration en stock d’EdU est de 20 mM. Attention: EdU et BrdU sont des analogues de la thymidine et peuvent être toxiques et mutagènes.</li>
	<li>Décongeler 4% de paraformaldéhyde (PFA) et fixer les os par immersion en PFA dans des tubes individuels de 2 mL. Attention: L’PFA est toxique et désigné comme cancérogène probable pour l’homme. Évitez de respirer la poudre et les vapeurs de paraformaldéhyde. EdU et BrdU sont des analogues de la thymidine et peuvent être toxiques et mutagènes.</li>
	<li>Après une brève fixation de 10 min en PFA à la température ambiante, transférer les os au PBS pour l’acquisition d’images à la fin du temps. Replacez ensuite les os dans l’IFP pour une fixation de nuit à 4 ° c.</li>
	<li>Après la fixation des os peuvent être traitées pour les applications en aval souhaitées.</li>
</ol>3. mesure et analyse de la pleine longueur de l’os et de la région minéralisée
<ol><li>Utilisez un logiciel de retouche d’image pour mesurer la longueur des os, en tenant compte de l’échelle de l’image. Mesurez la longueur totale de l’os et de la région minéralisée. Commencez les mesures à partir des premières cellules sombres à une extrémité jusqu’à ce que les dernières à l’autre extrémité. Remarque: La région minéralisée est caractérisée par la couleur plus foncée et se distingue facilement du cartilage.</li>
	<li>Pour calculer le taux de croissance, défini comme l’augmentation moyenne de la longueur par jour, divisez la différence entre la longueur finale de l’os et celle initiale par le nombre de jours dans la culture.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les méthodes de culture osseuse ex vivo ont été utilisées pendant un certain temps pour évaluer la biologie de la croissance osseuse28, mais ont été rarement appliquées à des os longs murins. Avec le développement de techniques d’imagerie, la culture osseuse ex vivo offre un moyen attrayant d’étudier la croissance osseuse en temps réel dans un cadre ressemblant étroitement aux conditions in vivo. Dans ce scénario, il est important de définir les conditions dans lesquelles la croissance des os long...

La croissance de l’organe doit être étroitement accordée pour prévenir l’apparition de troubles de la croissance, et implique la régulation de plusieurs types de cellules, voies moléculaires et Diaphonie entre les différentes parties du corps. Les techniques d’imagerie sont essentielles pour remédier aux changements survenant au fil du temps dans un embryon en croissance, dans des conditions normales, ainsi qu’après une perturbation est induite dans le système. Les embryons avec développement intra-utérin, comme les modèles de rongeurs largement utilisés, présentent un défi supplémentaire pour l’imagerie en direct et le traitement médicamenteux, qui peut être partiellement surmonté en utilisant des techniques de culture ex vivo. Pour récapituler avec succès les processus in vivo et obtenir des résultats significatifs, il devient crucial de trouver les bonnes conditions culturantes pour chaque organe ou tissu.
La plupart des os du squelette mammalien poussent à travers l’ossification endochondrale, où le cartilage embryonnaire (composé de cellules appelées chondrocytes) entraîne une croissance longitudinale et est graduellement remplacé par l’OS. Ce processus se déroule aux plaques de croissance, situées à la fin des longs os, où trois zones peuvent être distinguées: repos, proliférative et hypertrophique1,2. Tout d’abord, les chondrocytes ronds de progéniteur dans la zone de repos se transforme en chondrocytes en colonnes cycloaires dans la zone proliférative. Au cours de la prochaine étape de différenciation, ces chondrocytes deviennent hypertrophiques et commencent à sécréter le collagène de type X. Les chondrocytes hypertrophiques orchestrent les étapes suivantes de l’ossification: ils sécrètent des molécules de signalisation clés, telles que le facteur de croissance du tissu conjonctif, les protéines morphogénétiques des os et le hérisson indien, et dirigent la minéralisation de la matrice, recrutent les vaisseaux sanguins de la partie centrale de l’OS, et, sur l’apoptose, permettent aux ostéoblastes (cellules formant des os) d’envahir la matrice pour former le centre d’ossification primaire3,4. La matrice minéralisée facilite la pénétration des vaisseaux sanguins à travers lesquels les ostéoblastes migrent pour remplacer ce cartilage dégradé par une matrice osseuse5. La plupart des ostéoblastes envahissent la matrice du cartilage du périchondrium, une couche fibreuse qui enveloppe le cartilage6. Alternativement, une proportion de chondrocytes hypertrophiques sont capables de survivre et de se transdifférencier en ostéoblastes7,8,9. La longueur finale de l’OS est due à la croissance accumulée du cartilage transitoire, dont le taux de croissance dépend à son tour du nombre et de la taille des chondrocytes hypertrophiques, et de leur production matricielle10. En outre, il a été récemment montré que la durée de la dernière phase d’hypertrophie est corrélée avec la longueur finale de l’OS11. Par conséquent, une régulation serrée de la prolifération et de la différenciation de ces cellules est nécessaire pour assurer une taille osseuse appropriée.
Malgré les connaissances substantielles acquises au fil des ans sur l’organisation et le développement des plaques de croissance, la plupart de ces conclusions reposent sur l’observation de sections histologiques fixes. Le sectionnement tissulaire fournit des informations précieuses sur ce processus, mais peut être monté avec des artefacts techniques, de sorte qu’il ne peut pas être toujours utilisé de manière fiable pour estimer les changements morphologiques ou de taille entre les différentes étapes. En outre, comme la croissance osseuse est un processus dynamique, les images statiques en deux dimensions (2D) offrent un aperçu limité du mouvement des cellules dans la plaque de croissance, tandis que l’imagerie Time-lapse sur les tissus vivants pourrait offrir des informations précieuses sur le comportement de la chondrocytes dans la plaque de croissance.
Toutes ces limitations peuvent être potentiellement résolues à l’aide de cultures osseuses ex vivo. Alors que les protocoles de culture osseuse ont été développés il y a quelque temps, ils ont été appliqués de près aux os longs murins. La plupart des études utilisent Chick Bones en raison des avantages techniques offerts par le poussin modèle12,13. Des cultures organotypiques (interface air/liquide) ont été appliquées aux fémurs embryonnaires de poussins, qui ont été maintenus en culture pendant 10 jours14. Les outils génétiques sophistiqués disponibles dans la souris rendent ce modèle très attrayant pour être utilisé dans la culture osseuse ex vivo. Les études qui utilisaient des souris pour examiner la croissance osseuse travaillaient principalement avec des os métatarsiens15, probablement en raison de leur petite taille et de plus grands nombres obtenus par embryon16. Bien que traditionnellement considérés comme des os longs, les métatarsiens entrent dans la sénescence (caractérisée par une réduction de la prolifération et de l’involution de la plaque de croissance17) plus tôt que d’autres os longs in vivo, et par conséquent leur croissance continue ex vivo ne vraiment récapituler le processus in vivo. Aux fins du présent article, nous utiliserons le terme «os longs» pour les os des régions proximales et des membres intermédiaires. Plusieurs études antérieures utilisaient de longs os murins, comme le tibia, dans des cultures ex vivo et observaient une croissance substantielle du cartilage mais peu d’ossification18. Nous avons également utilisé les cultures tibiales récemment, principalement pour étudier la dynamique des chondrocytes19. D’autres études ont utilisé des têtes fémorales de jeunes souris20 ou seulement la partie distale du fémur pour la culture21. Quelques travaux plus récents combinent avec succès la culture ex vivo des os complets avec l’imagerie Time-lapse pour acquérir des films tridimensionnels (3d) de chondrocytes dans le tissu de souris vivant22,23. Les auteurs ont réussi à observer des événements précédemment inaperçus dans le réarrangement des chondrocytes à la zone proliférative23 dans un bon exemple de l’application potentielle de la culture osseuse ex vivo. L’alternative, c’est-à-dire l’analyse d’images statiques, nécessite des techniques indirectes et complexes. Cela a été illustré par une étude récente évaluant l’importance des clones à orientation transversale pour la croissance du cartilage, où le traçage génétique avec des souches de souris de reporter multicolore couplé avec la modélisation mathématique ont été utilisés24. Par conséquent, la culture ex vivo peut aider à mieux comprendre les processus dynamiques de manière plus rapide et plus directe.
Ici, nous présentons une méthode pour la culture des os longs murins, qui peut être combinée avec différents traitements moléculaires et/ou avec l’imagerie en direct Time-lapse. Ce protocole adapte les méthodes utilisées dans les rapports précédents15,18,25, mais aborde quelques problèmes supplémentaires et se concentre sur les os longs tels que le tibia, plutôt que les os métatarsiens. Enfin, il explore le potentiel d’utiliser des comparaisons appariées statistiquement puissantes en cultivant les os gauche et droit séparément en présence de différentes substances.

<table><tbody><tr><td>5-Ethynyl-2'-deoxyuridine</td><td>Santa Cruz</td><td>CAS 61135-33-9</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-2&prime ;-deoxyuridine</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubes à centrifuger coniques</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Plat de culture d’organe Center Well traité TC, 20/paquet, 500/caisse, Sterile</td><td>Falcon</td><td>353037</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td>CS4</td><td></td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Sigma</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>Unité de base pour la lunette</td><td>Zeiss</td><td>435425-9100-000</td><td></td></tr><tr><td>Bêtaglycérophosphate</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Lunette binoculaire</td><td>Zeiss</td><td>STEMI-2000</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA) fraction v</td><td>Roche/Sigma</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>DigiRetina 500 caméra</td><td>Aunet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de dissection</td><td>Cumper Robbins</td><td>PFS00034</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes de 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 96 %</td><td>Merk</td><td>159010</td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont#5 Inox08</td><td>Fine Science Tools</td><td>T05811</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 150 CO2</td><td>incubateur Thermo Fisher</td><td>51026282</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle</td><td>Sigma</td><td>M2279</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 24 puits</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes en plastique 1 mL Stérile Emballage individuel</td><td>Filtre</td> à seringue Thermo <td>273</td><td></td></tr><tr><td>0,2 um</td><td>Life Sciences</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>Seringue Terumo 20 mL</td><td>Terumo</td><td>DVR-5174</td><td></td></tr><tr><td>Tretinoïne (acide rétinoïque)</td><td>Sigma</td><td>PHR1187-3X</td><td></td></tr><tr><td>Endoscope trinoculaire</td><td>Aunet</td><td>AZS400T</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing et mesure des os longs de murine fœtal et nouveau-né

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

Les os longs sont des structures complexes et dynamiques, qui résultent de l’ossification endochondrale via un intermédiaire de cartilage. L’accès limité à des os humains sains rend particulièrement utile l’utilisation de modèles de mammifères, tels que la souris et le rat, pour examiner différents aspects de la croissance osseuse et de l’homéostasie. En outre, le développement d’outils génétiques sophistiqués chez la souris permet des études plus complexes de la croissance osseuse longue et demande une expansion des techniques utilisées pour étudier la croissance osseuse. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour la culture osseuse murin ex vivo, qui permet l’étude de l’os et du cartilage d’une manière étroitement contrôlée tout en récapitulant la plupart du processus in vivo. La méthode décrite permet la culture d’une gamme d’os, y compris le tibia, le fémur et les os métatarsiens, mais nous nous sommes concentrés principalement sur la culture tibiale ici. En outre, il peut être utilisé en combinaison avec d’autres techniques, telles que l’imagerie en direct Time-lapse ou le traitement médicamenteux.

La culture osseuse peut être réalisée à partir de différentes étapes. Dans la figure 1a-D, on montre une comparaison entre le tibia cultivé et les fraîchement extraits à des stades équivalents. La première observation est que jusqu’à deux jours de culture, la taille obtenue est comparable à la croissance osseuse in vivo pour le cartilage et l’os minéralisé (figure 1a, B, D). Des périodes de cultu...

Ici, nous présentons une méthode pour la culture ex vivo de longs os murins aux stades fœtal et nouveau-né, approprié pour analyser le développement osseux et le cartilage et l’homéostasie dans des conditions contrôlées tout en récapitulant le processus in vivo.

Culturing et mesure des os longs de murine fœtal et nouveau-né

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

Cette méthode adapte le protocole de culture métatarsienne aux os plus gros, permettant de combiner la manipulation osseuse directe avec des modèles génétiques complexes pour traiter les processus liés au développement osseux. Cette technique permet la manipulation et l’analyse de la croissance osseuse qui ne sont pas possibles in vivo, comme l’imagerie en direct ou la manipulation physique et pharmacologique directe. Cette méthode de culture ex vivo permet l’étude spécifique des effets locaux de l’encart génétique dans l’os le séparant de l’effet systémique du traitement sur l’organisme.Commencez par stériliser la région abdominale d’un jour gestationnel enceinte 14,5 à 18,5 souris avec 80% d’éthanol et en utilisant de petits ciseaux pour ouvrir la peau et les muscles abdominaux pour accéder aux cornes utérinnes. Pour extraire l’utérus de la cavité abdominale, retirez le mésometrium et coupez la base des cornes. Ensuite, transférez l’utérus dans une boîte de Pétri de 60 millimètres contenant un milieu de dissection glacé sur la glace.Dans une armoire de biosécurité coupée entre les sacs avec des ciseaux pour séparer les fœtus individuels, et transférer un sac individuel dans un nouveau plat de 60 millimètres avec milieu de dissection fraîche sous un microscope stéréo dissection. Utilisez des pinces à épiler pour séparer les fœtus des placentas et nettoyer les fœtus des membranes. Utilisez une pipette en plastique parée pour transférer le corps dans un nouveau plat de 60 millimètres et décapiter l’embryon avant d’autres dissections.Ensuite, utilisez des pinces à épiler pour enlever la peau, à partir du dos et l’épluchage vers les ateils. Utilisez la pince à épiler pour couper près de la colonne vertébrale et séparer les membres postérieurs du corps. Transférez les membres postérieurs dans un plat propre contenant un milieu de dissection glacé et insérez les pinces entre le cartilage de surface du fémur distal et le tibia proximal pour séparer le tibia du fémur.Retirer les os de la hanche du fémur proximal et l’os du calcanée et le péroné du tibia. Pincez soigneusement et tirez les tissus mous des fémurs et des tibias et utilisez une pipette stérile d’un millilitre pour transférer les quatre os de jambe dans le premier puits d’une plaque de 24 puits contenant le milieu frais de dissection. Il est important de montrer que le tissu mou qui relie le pouls de l’os est enlevé.Sinon, l’os se pliera et n’atteindra pas la croissance appropriée. Lorsque les os ont été disséqués à partir du nombre expérimental approprié de fœtus, imagez les os dans chaque puits parfois zéro sous un microscope léger avec un bon contraste et remplacez le milieu de dissection dans chaque puits par un millilitre de milieu de culture par puits en prenant soin de ne pas aspirer les os. Pour observer l’effet de l’inhibition de croissance dans les conditions de culture, traitez les tibias gauches avec l’acide rétinoïque nanomolaire de 500 nanomolar et incubez les tibias droit avec un volume équivalent de véhicule comme contrôle.Ensuite, placez la plaque dans un incubateur de culture cellulaire dans des conditions standard de culture cellulaire. Après deux jours, traiter les os avec un analogue approprié de thymidine pendant une à deux heures pour évaluer la prolifération de cellules d’os avant de transférer les os aux tubes individuels de deux millilitres de 4% paraformaldéhyde pendant 10 minutes. Ensuite, transférez les os à PBS pour l’image des os au point de temps final avant de retourner les échantillons au paraformaldéhyde pour la fixation de nuit à quatre degrés Celsius.Pour mesurer la longueur et la région minéralisée des os, ouvrez un logiciel d’imagerie approprié, et en tenant compte de l’échelle de l’image, mesurez à la fois la longueur totale de l’os et la région minéralisée. Démarrage des mesures à partir des premières cellules sombres à une extrémité jusqu’aux dernières cellules sombres à l’autre extrémité. Pour calculer le taux de croissance qui est défini comme l’augmentation moyenne de la longueur par jour, répartir la différence entre la longueur finale de l’os et la longueur initiale par le nombre de jours en culture.Ici, une comparaison entre le tibia cultivé et le tibia fraîchement extrait à des stades équivalents est montrée. Après jusqu’à deux jours de culture, la taille atteinte est comparable à la croissance osseuse in vivo pour le cartilage et l’os minéralisé. De plus longues périodes de culture conduisent à de plus grandes différences entre les os cultivés et les os fraîchement extraits.Notez que le tibia cultivé avec un ablation incomplète du tissu mou peut entraîner une flexion du tibia cultivé. Le traitement à l’acide rétinoïque a un effet robuste sur la croissance tibiale dès après deux jours de traitement. Bien qu’il y ait une augmentation constante de la longueur totale du tibia après deux jours dans la culture, cette croissance correspond à une augmentation approximative de seulement neuf à 29% de la longueur initiale.Moins que l’augmentation de la croissance osseuse qui serait observée in vivo. En effet, l’étiquetage analogique de thymidine montre moins de cellules positives dans cette région après culture comparées aux os fraîchement extraits d’un stade équivalent. En outre, dans le tibia cultivé in vitro, la longueur totale de l’élément squelettique augmente considérablement, tandis que presque aucune augmentation dans la région minéralisée n’est observée.En plus de l’analyse histologique et moléculaire, la compensation et l’imagerie 3D peuvent être effectuées après la culture pour caractériser l’effet cellulaire des traitements appliqués aux os cultivés. Cette technique nous permet d’aborder les questions liées à la communication interorganique. Par exemple, en co-culture des os des différents modèles génétiques dans une sorte d’expérience de parabiosis sans douleur.

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JoVE Journal

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