Name: Étude de toxicité des nanoparticules doxyde de zinc dans la culture cellulaire et dans le mélanogaster de Drosophila (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Découvrez une méthode de nanotoxicologie pour évaluer les effets des nanoparticules d'oxyde de zinc sur les fibroblastes pulmonaires humains MRC5 et Drosophila. Ce protocole permet d'identifier les types de mort cellulaire et de quantifier les espèces réactives de l'oxygène.

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L'étude a été appuyée par le numéro de subvention R706-000-043-490. L'étude ne représente pas le point de vue du promoteur de la subvention.

1. Analyse du tri des cellules activées par fluorescence (FACS) sur les cellules habitées/fixes
<ol><li>Sonicate ZnO NPs en suspension pour 15 min.</li>
	<li>Préparer les nP ZnO à diverses concentrations (p. ex. 0, 10, 25, 50 100 et 200 g/mL) en utilisant une solution de stock NP ZnO de mg/mL pour le traitement des cellules cultivées.</li>
	<li>Seed MRC5 fibroblastes pulmonaires humains (1 x 105 cellules / puits) sur une plaque de culture de 6 puits par jour à l'avance, puis traiter les cellules avec 2 mL de ZnO NPs (en tripliques) pour 8 h, 16 h, et 24 h.</li>
	<li>À chaque moment, recueillir les cellules en centrifuge à 300 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Laver les granulés cellulaires deux fois avec du phosphate salin tamponné (PBS).</li>
	<li>Resuspendre les cellules avec un tampon de liaison 1x, qui est composé de 0,1 M HEPES/hydroxyde de sodium (NaOH), 1,4 M de chlorure de sodium (NaCl), et 25 mM de chlorure de calcium (CaCl2), à une concentration de 1 x 105 cellules par 100 l.</li>
	<li>Ajouter 5 ll d'isothiocyanate de fluorécine (FITC) Tache d'annexe V et 5 l de tache d'ADN d'iodide de propidium (PI), et incuber les cellules pendant 15 min à température ambiante (RT; 25 oC) dans l'obscurité.</li>
	<li>Rehaussez les échantillons avec un tampon de liaison de 400 l de 1x avant de trier les cellules par cytométrie d'écoulement. Un minimum de 10 000 cellules est analysé pour chaque échantillon.</li>
	<li>Tabulate le graphique à barres en utilisant l'intensité médiane obtenue.</li>
</ol>2. Exposition des NP ZnO à Drosophila
<ol><li>Ajouter 1 ml de nanoparticules à différentes concentrations en flacons, suivi de 9 ml d'aliments à mouchepour effectuer une concentration finale de 0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL ou 0,5 mg/mL De nPs ZnO.</li>
	<li>Mélanger les nanoparticules avec les aliments à fond dans les flacons à l'aide de la pipette.</li>
	<li>Laisser refroidir les aliments à la mouche contenant des nPs ZnO pendant au moins 2-3 h avant de les utiliser.</li>
	<li>Introduire des mouches mâles et femelles adultes dans les flacons pendant 5 jours, et leur permettre de s'accoupler et de pondre des œufs (qui apparaissent sous forme de taches blanches) à la surface de la nourriture.</li>
	<li>Enlever les mouches parentales et permettre aux œufs de subir un développement ultérieur, qui se compose de 4 stades de développement différents (stade embryonnaire, larvaire, pupal et adulte).</li>
</ol>3. Dissection de la mouche
<ol><li>Recueillir les larves d'instar tardives de 3rd dans la paroi des flacons pour les analyses. Les œufs fraîchement pondus se développent normalement en larves de3e étoiles après 72-120 h à RT.</li>
	<li>Nettoyer le plat de dissection et remplir le puits avec le milieu de dissection/PBS.</li>
	<li>Disséquer les larves (fin 3e instar) sous le stéréomicroscope, à l'aide d'une paire de forceps.</li>
	<li>Utilisez la pointe des forceps pour faire un petit trou et ouvrir la couche de cuticule des larves. Retirez soigneusement l'intestin et placez-le dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml contenant le milieu Drosophila de Schneider, avant l'étape de fixation en utilisant 1 ml de paraformaldéhyde (PF) de 4 %.</li>
	<li>3.5Fixer l'intestin en PF pendant 10 min à RT, pour des expériences ultérieures, telles que l'immunostaining.</li>
</ol>4. Détection DE ROS utilisant le Dihydroethidium (DHE) Staining
<ol><li>Traiter les larves avec diverses concentrations de NP ZnO comme décrit à l'étape 2.1.</li>
	<li>Après la dissection de l'intestin de 3rd larves instar comme décrit sous la section 3, incuber l'intestin dans le milieu drosophila de Schneider à RT avant la coloration des tissus est effectuée. Dissoudre 1 l de colorant DHE (à partir de la concentration de stock de 30 mM) dans 1 ml du milieu de Schneider, ce qui fait une concentration de travail finale de 10-30 M de teinture DHE.</li>
	<li>Incuber l'intestin pendant 5 min à RT dans l'obscurité, puis laver trois fois en utilisant le milieu de Schneider pour chaque 5 min.</li>
	<li>Fixez l'intestin avec 4% PF (étape facultative) et montez l'intestin sur des lames de verre, avec le milieu de montage anti-fade contenant 4,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Capturez des images sous un microscope confocal.</li>
</ol>5. Mesurer la fluorescence à l'aide du logiciel ImageJ
<ol><li>Importer les images de fluorescence capturées acquises à l'aide de la microscopie par fluorescence ou de la microscopie à balayage au laser confocal dans le logiciel ImageJ.</li>
	<li>Cliquez sur le menu Analyser et sélectionnez Mesures de set.</li>
	<li>Sélectionnez la mesure de sortie telle que l'intensité intégrée de la zone et la valeur grise moyenne.</li>
	<li>Cliquez sur Mesure.</li>
	<li>Sélectionnez une région sans fluorescence pour définir l'arrière-plan.</li>
	<li>Exportez les données dans la feuille de calcul Excel et déterminez la fluorescence cellulaire totale corrigée (CTCF), en utilisant le calcul indiqué ci-dessous. CTCF - Densité intégrée - (Zone de la cellule sélectionnée X Fluorescence moyenne des lectures de fond)</li>
	<li>Construire un graphique à barres et effectuer une analyse statistique.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+100+nm+zinc+oxide+nanoparticles%3A+a+report+of+90-day+repeated+oral+administration+in+Sprague+Dawley+rats%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats.</a> International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).</li>
<li>Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+activity+and+mechanism+of+action+of+zinc+oxide+nanoparticles+against+Campylobacter+jejuni%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).</li>
<li>Colvin, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+environmental+impact+of+engineered+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The potential environmental impact of engineered nanomaterials.</a> Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).</li>
<li>De Angelis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+ZnO+and+TiO%282%29+nanoparticles%3A+physicochemical+characterisation+and+toxicological+effects+on+human+colon+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells.</a> Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).</li>
<li>Johnson, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+exposure+to+ZnO+nanoparticles+induces+autophagic+immune+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death.</a> Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).</li>
<li>Singh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoGenotoxicology%3A+the+DNA+damaging+potential+of+engineered+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials.</a> Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).</li>
<li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+dissolved+zinc+ion+and+reactive+oxygen+species+in+cytotoxicity+of+ZnO+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles.</a> Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).</li>
<li>Wahab, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZnO+nanoparticles+induced+oxidative+stress+and+apoptosis+in+HepG2+and+MCF-7+cancer+cells+and+their+antibacterial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).</li>
<li>Namvar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+effects+of+biosynthesized+zinc+oxide+nanoparticles+on+murine+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Evidence-Based+Complementary+and+Alternative%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).</li>
<li>Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicities+of+nano+zinc+oxide+to+five+marine+organisms%3A+influences+of+aggregate+size+and+ion+solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).</li>
<li>Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-specific+toxic+effects+of+differently+shaped+zinc+oxide+nanoparticles+to+zebrafish+embryos+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).</li>
<li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity%2C+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li>
<li>Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+study+of+the+harmful+effects+of+ZnO+nanoparticles+using+Drosophila+melanogaster+as+an+in+vivo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hazardous+Materials%22%5BJournal%5D)">A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model.</a> Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).</li>
<li>Rand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophotoxicology%3A+the+growing+potential+for+Drosophila+in+neurotoxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology+and+Teratology%22%5BJournal%5D)">Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology.</a> Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).</li>
<li>Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+as+a+model+organism+to+study+nanotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity.</a> Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).</li>
<li>Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+innate+immunity%3A+an+evolutionary+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective.</a> Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).</li>
<li>Hughes, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+genetic+model+for+studying+pathogenic+human+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses.</a> Virology. 423, 1-5 (2012).</li>
<li>Jennings, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+-+a+versatile+model+in+biology+%26+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today%22%5BJournal%5D)">Drosophila - a versatile model in biology & medicine.</a> Materials Today. 14, 190-195 (2011).</li>
<li>Adams, M. D., Sekelsky, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+sequence+to+phenotype%3A+reverse+genetics+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster.</a> Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).</li>
<li>Adams, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of Drosophila melanogaster.</a> Science. 287, 2185-2195 (2000).</li>
<li>Ong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+nanoparticles+disrupt+germline+stem+cell+maintenance+in+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li>
<li>Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+potential+harmful+effects+of+CdSe+quantum+dots+by+using+Drosophila+melanogaster+as+in+vivo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model.</a> Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).</li>
<li>Barik, B. K., Mishra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+as+a+potential+teratogen%3A+a+lesson+learnt+from+fruit+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly.</a> Nanotoxicology. , 1-27 (2018).</li>
<li>Jovanovic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+a+human+food+additive%2C+titanium+dioxide+nanoparticles+E171%2C+on+Drosophila+melanogaster+-+a+20+generation+dietary+exposure+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster - a 20 generation dietary exposure experiment.</a> Scientific Reports. 8, (2018).</li>
<li>Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Toxicity+of+Nanoparticles+to+Human+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).</li>
<li>Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+ROS+scavenging+and+antioxidant+signalling+by+redox+metallic+and+fullerene+nanomaterials%3A+Potential+implications+in+ROS+associated+degenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta-General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).</li>
<li>Akter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+on+silver+nanoparticles-induced+cytotoxicity%3A+Physicochemical+properties+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Advanced+Research%22%5BJournal%5D)">A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives.</a> Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).</li>
<li>Vecchio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fruit+fly+in+the+nanoworld%3A+once+again+Drosophila+contributes+to+environment+and+human+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health.</a> Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).</li>
<li>Marino, G., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+apoptotic+phosphatidylserine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure.</a> Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).</li>
<li>Stoddart, M. J. Cell Viability Assays: Introduction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStoddart%2C+MJ+%22Mammalian+Cell+Viability%3A+Methods+and+Protocols%22">Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols</a>. , Chapter 1 (2011).</li>
<li>Yazdani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerns+in+the+application+of+fluorescent+probes+DCDHF-DA%2C+DHR+123+and+DHE+to+measure+reactive+oxygen+species+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro.</a> Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).</li>
<li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+kinetics+of+dihydroethidium+fluorescence+with+superoxide+using+xanthine+oxidase+and+hypoxanthine+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay.</a> Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).</li>
<li>Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHartig%2C+SM+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , Chapter 14, Unit14.15 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Afin d'évaluer si ZnO NP peut induire l'apoptose dans les fibroblastes DE MRC5, nous utilisons la cytométrie de flux pour distinguer les cellules de la mort nécrotique ou apoptotique de cellules. Dans les cellules vivantes normales, la phosphatidylserine (PS) est localisée à la membrane cellulaire. En cas d'apoptose, PS est translogué dans le dépliant extracellulaire de la membrane plasmatique, permettant la liaison de l'annexe V étiquetée avec de la fluorescéine (FITC Annexin V)29. D'autre part, ...

La nanotechnologie fait référence à l'application de matériaux nanométriques qui sont utilisés dans tous les domaines scientifiques, y compris la médecine, la science des matériaux et la biochimie. Par exemple, les NP ZnO qui sont connus pour leur diffusion ultraviolette, leur détection chimique et leurs propriétés antimicrobiennes, ainsi que pour leur conductivité électrique élevée, sont utilisés dans la production de divers produits de consommation tels que les emballages alimentaires, les cosmétiques, textiles, caoutchoucs, batteries, catalyseur pour le traitement du gaz de queue automobile, et applications biomédicales1,2,3.
Cependant, les applications naissantes des produits à base de NP ZnO, conduisant à une exposition accrue de l'homme aux nP ZnO, ont soulevé des préoccupations sur leurs effets néfastes potentiels sur la santé humaine. Un certain nombre d'études cellulaires in vitro ont démontré que les NP de ZnO peuvent induire le stress oxydatif, la cytotoxicité autophagie-connexe, l'inflammation, et la génotoxicité4,5,6,7,8 . Notamment, la toxicité des NP ZnO est supposée être causée par la dissolution de Zn pour libérer les ions Zn2, ainsi que la réactivité de surface de ZnO, résultant en déséquilibres ioniques et métaboliques cellulaires qui sont liés à l'homéostasie ionique altérée et un inhibition du transport ionique4,7,9,10. Fait important, des études ont montré que la génération d'espèces réactives d'oxygène (ROS) est l'un des mécanismes primaires sous-jacents à la toxicité associée à ZnO NPs. L'activité anti-oxydante insuffisante suivant l'insulte de ROS s'est avérée responsable de l'obtention de la cytotoxicité et des dommages d'ADN9. Les effets toxiques des NP ZnO ont également été signalés chez les modèles animaux, y compris le rongeur1, poisson zèbre11,12, ainsi que l'invertébré Drosophila13.
Drosophila sert de modèle animal alternatif bien établi pour le dépistage de la toxicité des entités chimiques et des nanomatériaux (NM)14,15. Fait important, il existe des niveaux élevés de similitude génétique et physiologique entre l'homme et la drosophile qui justifie l'utilisation de la drosophile comme modèle in vivo pour évaluer les réponses biologiques aux contaminants environnementaux tels que les NM 16. En outre, il y a beaucoup d'avantages d'utiliser Drosophila en raison de sa petite taille, de sa courte durée de vie, de son aptitude génétique et de son entretien facile et rentable. En outre, Drosophila a été largement adopté pour l'étude de la génétique, la biologie moléculaire et développementale, depuis que son génome complet a été entièrement séquencé il ya des années en 2000, ce qui le rend approprié pour une variété de dépistage à haut débit et pour s'attaquer aux questions biologiques non résolues17,18,19,20,21. Ces dernières années, un certain nombre d'études liées à l'immunotoxicité utilisant différents types de NP dans Drosophila ont été rapportés15,22,23,24. Ces nouvelles connaissances fondamentales obtenues à partir des études utilisant Drosophila ont contribué à fournir plus de perspicacité dans notre compréhension de la nanotoxicologie.
ROS est un coupable bien connu pour la cytotoxicité et la génotoxicité causées par les nP, en particulier, à base de métal NPs25. Les ROS sont des espèces chimiques contenant de l'oxygène avec des propriétés réactives plus élevées que l'oxygène moléculaire. Les radicaux libres tels que le radical superoxyde (O2-) et même, les molécules non radicales telles que le peroxyde d'hydrogène (H2O2) peuvent agir comme ROS. Dans l'état physiologique normal, ils sont tenus de maintenir l'homéostasie cellulaire26, cependant, ROS excessive en raison de la surproduction ou la dysrégulation du système de défense antioxydant peut causer un stress oxydatif, conduisant à des dommages aux protéines, lipides et acide désoxyribonucléique (ADN)27. Par exemple, à mesure que les niveaux de ROS augmentent et que le niveau de glutathion (GSH) diminue de façon concomitante, la perturbation de la synthèse de l'adénosine triphosphate (ATP) a lieu et le niveau de déshydrogénase de lactate (LDH) augmente dans le milieu, aboutissant à la mort cellulaire27.
Ici, nous fournissons des protocoles pour effectuer des analyses cellulaires et génétiques utilisant les cellules cultivées de mammifères et Drosophila pour déterminer les effets défavorables potentiels des NPs de ZnO. Un aperçu de la méthode utilisée pour l'étude de toxicité des nP ZnO est montré dans la figure 1.

<table><tbody><tr><td>15 % Méthyl 4-Hydroxybenzoate</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 % Paraformaldéhyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cncCK6/TM3, Sb</td><td></td><td></td><td>un cadeau du Dr. Kerppola T</td></tr><tr><td>Semoule de maïs, glucose, levure brasseur</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CyAn ADP avec Summit Software</td><td>DAKO</td><td></td><td>https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf</td></tr><tr><td>Dihydroethidium (Hydroethidine)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D11347</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I</td><td>BD biosciences</td><td>556547</td><td></td></tr><tr><td>Microscope fluorescent</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucolin</td><td>Supermarket</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRC5 fibroblaste poumon humain</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield antifade milieu de montage avec DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Wild-type Canton-S ; Sod2N308/CyO</td><td>NIG-FLY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoparticules d’oxyde de zinc</td><td>Sigma Aldrich</td><td>721077</td><td>Se référer à la fiche 2</td></tr></tbody></table>

Étude de toxicité des nanoparticules d'oxyde de zinc dans la culture cellulaire et dans le mélanogaster de drosophila

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Les nanoparticules d'oxyde de zinc (ZnO NPs) ont un large éventail d'applications, mais le nombre de rapports sur la toxicité associée à ZnO NP a augmenté rapidement ces dernières années. Cependant, les études qui élucident les mécanismes sous-jacents pour la toxicité NP-induite par ZnO sont maigres. Nous avons déterminé les profils de toxicité des nP znO utilisant des modèles expérimentaux in vitro et in vivo. Une diminution significative de la viabilité cellulaire a été observée dans les fibroblastes pulmonaires MRC5 exposés au nP De ZnO, ce qui montre que les NP ZnO exercent des effets cytotoxiques. De même, il est intéressant de noter que l'intestin exposé aux nCp ZnO a montré une augmentation spectaculaire des niveaux d'espèces réactives d'oxygène (ROS) dans la mouche des fruits Drosophila. Des études plus approfondies sont nécessaires pour établir une évaluation des risques pour l'utilisation accrue des nP ZnO par les consommateurs.

Les cellules NP-exposées ont été traitées avec le kit de réactif de coloration de cellules, suivi s'est triant de cellules utilisant la cytométrie de flux. Les cellules traitées par ZnO NP (en bas, panneau droit) présentent un pourcentage plus élevé de cellules apoptotiques précoces (R3)/tardives (R6) que de cellules témoins (R5, panneau inférieur, gauche). La mort des cellules nécrotiques est indiquée par R4 (en haut, panneau droit) (Figure 2). Les résultats...

Nous décrivons un protocole détaillé pour évaluer les profils toxicologiques des nanoparticules d'oxyde de zinc (ZnO NPs) en particulier, le type de mort cellulaire dans les fibroblastes pulmonaires HUMAINS MRC5 et la formation de ROS dans la mouche des fruits Drosophila.

Étude de toxicité des nanoparticules d'oxyde de zinc dans la culture cellulaire et dans le mélanogaster de Drosophila

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent ...

Nos méthodes décrivent une façon simple et répétée d’étudier la nanotoxicité, comme l’examen des types de mort cellulaire et l’examen de la production d’espèces réactives d’oxygène. Le tri cellulaire activé par fluorescence est un format strict qui nous permet d’étudier la sous-population des cellules et les différents types croissants de mort cellulaire. La méthode d’étude de la sonde DHE nous permet de détecter et de quantifier les espèces réactives d’oxygène suivies de la cytométrie du débit, de l’imagerie microscopique à haute teneur et de l’analyse de fluorescence à base de couplet.Pour commencer, placez un tube d’Eppendorf contenant des nanoparticules d’oxyde de zinc dans la solution de stock de nanoparticules d’oxyde de zinc dans un sonicateur pendant 15 minutes. Préparer les nanoparticules d’oxyde de zinc à diverses concentrations à l’aide d’un milligramme par millilitre de stock de nanoparticules d’oxyde de zinc. Puis, dans un cabinet de biosécurité, les fibroblastes pulmonaires humains MRC5 se plantent sur trois plaques de culture de six puits à la concentration d’une fois 10 à la cinquième cellule par puits.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius. Après une journée, traiter les cellules avec deux millilitres de nanoparticules d’oxyde de zinc pendant huit heures, 16 heures ou 24 heures. À chaque fois, recueillir les cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres, et centrifugeuse à 300 fois g pendant cinq minutes.Lavez les granulés cellulaires deux fois avec de la solution saline tamponnée de phosphate, puis résépendez les cellules avec un tampon de liaison 1X. Ensuite, ajoutez cinq microlitres de tache fitc annexine V dans cinq microlitres de tache d’ADN iodure de propidium. Incuber les cellules tachées pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité.Avant de trier les cellules par cytométrie d’écoulement, rechargez les échantillons avec 400 microlitres supplémentaires de tampon de liaison 1X. Tabuler le graphique à barres en utilisant l’intensité médiane obtenue. Utilisez maintenant une pipette pour ajouter un millilitre de nanoparticules à différentes concentrations en flacons, suivie de neuf millilitres de mouches pour faire une concentration finale de 0,1 milligramme par millilitre, 0,25 milligramme par millilitre, ou 0,5 milligramme par nanoparticules d’oxyde de zinc millilitre.Pipette de haut en bas pour bien mélanger. Laisser refroidir les aliments volants contenant des nanoparticules d’oxyde de zinc pendant au moins deux à trois heures avant utilisation. Anesthésiez ensuite les mouches mâles et femelles adultes dans un flacon avec du dioxyde de carbone, et introduisez cinq mouches mâles et cinq mouches femelles dans chaque flacon pendant cinq jours.Laissez-les s’accoupler et pondre des œufs à la surface de la nourriture. Après l’anesthésie, enlever les mouches parentales et permettre aux œufs de subir un développement ultérieur à température ambiante, qui se compose de quatre stades de développement différents. Stade embryonnaire, larvaire, pupal et adulte.Après 72 à 120 heures, les œufs fraîchement pondus se développent en larves tardives du troisième stade. À l’aide de forceps, recueillir les larves de la paroi des flacons pour les analyses. Dans un puits d’un plat de dissection avec milieu de dissection ou PBS, placez les larves dans la solution.Sous le stéréomicroscope, utilisez le bout des forceps pour faire un petit trou et ouvrez la couche cuticule des larves. Retirez soigneusement l’intestin. Placez l’intestin dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre contenant le Drosophila Medium de Schneider.Ajouter un microlitre de la sonde DHE et incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 10 minutes. Lavez l’intestin trois fois à l’aide du medium de Schneider toutes les cinq minutes. Montez l’intestin sur des glissières en verre et fournissez 10 microlitres de support antifade contenant du DAPI.Capturez des images au microscope confocal. Pour mesurer la fluorescence, importez les images de fluorescence capturées acquises à l’aide d’une microscopie fluorescence ou d’une microscopie à balayage laser confocal dans le logiciel ImageJ. Cliquez sur le menu analyser et sélectionnez les mesures définies.Sélectionnez la mesure de sortie, telle que l’intensité intégrée de la zone et la valeur grise moyenne. Sélectionnez une région sans fluorescence pour définir l’arrière-plan. Cliquez sur la mesure.Exportez les données dans la feuille de calcul et déterminez la fluorescence cellulaire totale corrigée. Construisez un diagramme à barres et effectuez une analyse statistique. Dans cette étude, les cellules traitées par nanoparticules d’oxyde de zinc présentent un pourcentage plus élevé de cellules R3 ou R6 apoptotiques tardives que les cellules de contrôle R5. La mort des cellules nécrotiques a été notée par R4. L’intestin extrait de la larve de drosophile a été divisé en trois domaines discrets d’origine développementale différente.À savoir, le foregut, midgut, et hindgut. Le stock DHE a tendance à expirer assez rapidement, alors faites attention à la solution de stock que vous utilisez. Alternativement, vous pouvez essayer d’autres sondes, par exemple la cellule Roche, qui est conçu pour détecter le ROS intracellulaire dans les signaux verts, et qui est plus photostable que le DHE.Notre protocole fournit un aperçu général pour l’étude de la production intracellulaire de ROS, et la quantification du niveau de ROS pour l’étude de nanotoxicité. DMSO est connu pour être un meilleur solvant pour DHE que le PBS. Cependant, DMSO est toxique.Par conséquent, je voudrais conseiller à l’utilisateur de limiter l’ensemble du processus d’étude à 30 minutes maximum. C’est parce que vous pouvez observer un résultat faussement positif que DMSO peut causer la mort cellulaire.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Dans cet article, les embryons de poisson-zèbre sont utilisés pour le dépistage de la toxicité chimique. La toxicité chimique est corrélée aux lectures phénotypiques. L’exemple de protocole montre une approche méthodologique de la réalisation du dépistage de la toxicité chimique.

Dépistage de la toxicité chimique à base d’embryons : évaluation des effets sur le développement des embryons de poisson-zèbre

Un protocole est développé pour examiner les effets d’un médicament épigénétique DZNep sur le développement, la fécondité et la survie des moustiques.  Nous décrivons ici les procédures d’exposition aqueuse de DZNep aux moustiques immatures et d’exposition sanguine de DZNep aux moustiques adultes, en plus de mesurer l’inhibition de l’hydrolase de l’HSA.

Les analyses toxicologiques pour Effets d&#39;essais d&#39;un médicament épigénétique sur le développement, la fécondité et de la survie du paludisme moustiques

Dans cet article, nous fournissons un protocole détaillé d’exposer des espèces du genre Drosophila aux polluants dans le but d’étudier l’impact de l’exposition sur un éventail de sorties phénotypiques à différents stades de développement et de plusieurs générations.

Protocole expérimental pour l’utilisation de drosophile comme un système modèle d’invertébrés pour les essais de toxicité en laboratoire

Une méthode quantitative a été développée pour identifier et prédire la toxicité aiguë de substances chimiques en analysant automatiquement la détermination des caractéristiques phénotypiques de Caenorhabditis elegans. Ce protocole décrit comment traiter les vers avec des produits chimiques dans une plaque 384 puits, capturer des vidéos et quantifier les phénotypes associés toxicologiques.

Un test haut débit pour la prévision de la toxicité chimique de profilage phénotypique automatisé de Caenorhabditis elegans

Les perturbateurs chimiques endocriniens (CED) représentent un grave problème pour les organismes et pour les milieux naturels. Drosophila melanogaster représente un modèle idéal pour étudier les effets d'EDC in vivo. Ici, nous présentons des méthodes pour étudier la perturbation endocrinienne dans Drosophila, traitant des effets d'EDC sur la fécondité, la fertilité, le moment développemental, et la durée de vie de la mouche.

Méthodes pour tester la perturbation endocrinienne dans le mélanogaster drosophila

Ce protocole présente des tests de cytotoxicité couramment utilisés (tests Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red et MTT) adaptés à l’évaluation de la cytotoxicité dans des lignées cellulaires d’embryons de poisson zèbre (ZEM2S) et de foie (ZFL) dans des plaques à 96 puits.

Essais de cytotoxicité avec des lignées cellulaires de poisson zèbre

Ce protocole décrit une méthode efficace et peu coûteuse qui utilise des milieux liquides pour évaluer les effets des toxiques chimiques sur la viabilité de Drosophila melanogaster adulte.

Évaluation de la toxicité chimique chez la drosophile melanogaster adulte

L’étude suivante évalue le profil toxicologique d’un cadre métallo-organique sélectionné à l’aide de la détection d’impédance cellule-substrat électrique (ECIS), une technique de criblage à haut débit en temps réel.

Détection électrique cellule-substrat pour l’évaluation en temps réel des profils toxicologiques des structures organométalliques

Le protocole présente une méthode à haut débit et rentable pour évaluer la neurotoxicité chez la mouche des fruits grâce à la quantification de la dysfonction locomotrice comme alternative aux modèles traditionnels de mammifères. Il vise à évaluer les effets neurotoxiques de composés pharmaceutiques, d’agents environnementaux ou de modifications génétiques à l’aide d’un modèle sensible, reproductible et éthiquement favorable.

Analyse comportementale de la dysfonction locomotrice chez Drosophila melanogaster comme lecture de la neurotoxicité

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Transduction rétrovirale des récepteurs de cellules T dans les lymphocytes T de souris

Découvrez une méthode de nanotoxicologie pour évaluer les effets des nanoparticules d'oxyde de zinc sur les fibroblastes pulmonaires humains MRC5 et Drosophila. Ce protocole permet d'identifier les types de mort cellulaire et de quantifier les espèces réactives de l'oxygène.

Étude de toxicité des nanoparticules d'oxyde de zinc dans la culture cellulaire et dans le mélanogaster de Drosophila

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