Utilisation d'un accélérateur linéaire pour la réalisation d'expériences de radiobiologie in vitro

La radiothérapie est le plus souvent dispensée à l’aide d’accélérateurs linéaires. Ce protocole permet aux chercheurs d’évaluer les effets biologiques des radiations sur les cellules à l’aide d’un accélérateur linéaire. L’avantage de cette technique est qu’en utilisant un accélérateur linéaire, les chercheurs peuvent étudier un large éventail de doses et de taux de dose cliniquement pertinents.

En outre, ce protocole peut être utilisé pour tous les types de cellules cancéreuses. Cette méthode peut être effectuée à l’aide d’un équipement similaire à celui montré ici. Par exemple, des accélérateurs linéaires fabriqués par d’autres fournisseurs.

Les personnes qui n’ont pas d’expérience dans l’exécution de calculs dosimétriques à l’aide d’un accélérateur linéaire peuvent avoir de la peine de calculer le nombre exact d’unités de moniteur nécessaires pour fournir la dose désirée à l’échantillon. Ils bénéficieraient de demander conseil à un physicien médical d’expérience ou dosimetrist. La livraison de la dose à l’échantillon avec précision à l’aide d’un accélérateur linéaire nécessite un placement attentif.

Deux jours avant l’irradiation programmée, travaillant dans une hotte de culture, utilisez une pipette stérile de cinq millilitres pour recueillir des cellules souches de gliome d’une plaque de culture dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Centrifuger les cellules à 200 fois g pendant trois minutes dans une centrifugeuse de comptoir. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire avec un millilitre de trypsine-EDTA.

Incuber à température ambiante pendant cinq minutes pour digérer la pastille et faire une suspension à cellule unique en trypsine-EDTA. Toutes les deux minutes pendant la digestion, secouez doucement le fond du tube de centrifugeuse pour vous assurer que les cellules sont bien digérées. Ajouter ensuite trois millilitres de culture de cellules souches pour étancher la trypsine, mélanger délicatement et centrifugeuse à 200 fois g pendant trois minutes dans une centrifugeuse de comptoir.

Après avoir jeté le supernatant, resuspendez la pastille cellulaire avec cinq millilitres de médias de culture cellulaire et comptez les cellules avec un hémocytomètre. Plaque cinq millions de cellules divisées en deux plaques de 10 centimètres contenant 10 millilitres de médias de culture cellulaire et incuber 48 heures à 37 degrés Celsius. Juste avant l’irradiation programmée, recueillir les cellules et la centrifugeuse comme cela a été fait auparavant.

Jetez le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire avec cinq millilitres de médias de culture cellulaire. Transférer un millilitre de suspension cellulaire dans une plaque de 35 millimètres contenant deux millilitres de milieu de culture cellulaire, en s’assurant que le milieu atteint une hauteur d’un centimètre. Transférer les cellules plaquées dans un récipient secondaire afin de réduire le risque de contamination et d’amener les cellules dans le récipient sur un chariot utilitaire à l’installation d’irradiation pour irradier les cellules.

Un jour avant l’irradiation, travaillant dans le capot de culture cellulaire, utilisez une pipette Pasteur reliée à un vide pour enlever le milieu DMEM de la plaque de culture cellulaire à la ligne cellulaire attachée. Lavez ensuite les cellules avec cinq millilitres de PBS stérile pour rincer le milieu résiduel. Ajouter un millilitre de trypsine-EDTA dans le plat de culture et incliner doucement la plaque de culture pour s’assurer que le plat entier est couvert.

Après avoir incubé à température ambiante pendant cinq minutes, étanchez la réaction trypsine-EDTA avec trois millilitres de médias DMEM. Utilisez une pipette de cinq millilitres pour recueillir les cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres, une centrifugeuse, puis la culture des cellules telles que décrites dans le manuscrit. Pour irradier ces cellules précédemment préparées à l’aide du logiciel de console du LINAC, réglez le portique et le collimateur de l’accélérateur à zéro degré, ouvrez les mâchoires x et y à une taille de champ symétrique de cinq par cinq centimètres carrés, et rétractez les collimateurs multileaf.

Ajouter au moins cinq centimètres de matière équivalente à l’eau sur le canapé de traitement et placer le plat cellulaire à irradier sur elle au centre du réticule LINAC. Placez les cellules à une profondeur de dose maximale dans un faisceau de rayons X de six mégavolts d’environ 1,5 centimètre et ajoutez un centimètre supplémentaire de matériau équivalent à l’eau sur le dessus du plat. Apposer le pointeur avant sur la tête du LINAC et l’étendre jusqu’à ce qu’il touche la surface du matériau d’accumulation.

Ajustez la hauteur de la table jusqu’à ce que la distance entre la source et la surface d’accumulation soit de 100 centimètres. Quittez la chambre forte du traitement, en vous assurant que toutes les autres personnes sont parties. Vérifiez qu’il n’y a pas d’autres cellules dans la pièce, puis fermez la porte de la chambre forte.

Confirmez la taille du champ, surveillez les unités et surveillez les unités par minute à la console, puis activez le faisceau pour une cellule de rayonnement. Trois échantillons de cellules souches du gliome ont été préparés à l’aide de ce protocole et prélevés 24 heures après l’irradiation. Là, des profils de cycle cellulaire ont été calculés et montrés avec les pourcentages de cellules dans différentes phases du cycle cellulaire.

L’arrêt de cycle cellulaire de G2 a été observé après irradiation des cellules souches de gliome avec un taux de dose standard ou un taux de dose extra-élevé, comparé aux cellules témoins non irradiées. Afin d’avoir la bonne dose livrée, il est plus important de mesurer la hauteur des médias dans le plat de culture pour s’assurer qu’il atteint un centimètre. Après cette procédure, d’autres essais biologiques peuvent être exécutés, tels que l’immunostaining, la tache occidentale, et l’analyse de cycle cellulaire.

Puisque cette procédure fournit aux chercheurs des paramètres cliniquement pertinents de dose et de taux de dose, il peut être employé pour évaluer l’effet de rayonnement sur beaucoup de modèles basés sur la culture cellulaire.